Summary
हम बंधन के ऊतकों का एक मॉडल पेश करते हैं जिसमें तीन आयामी निर्माण मानव व्यायाम-वातानुकूलित सीरम के साथ किया जाता है और कोलेजन सामग्री, कार्य, और सेलुलर जैव रसायन के लिए विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
जैविक तंत्र को समझने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में आवश्यक हैं; हालांकि, मोनोलेयर टिशू कल्चर और मानव फिजियोलॉजी के बीच का अंतर बड़ा है और निष्कर्षों का अनुवाद अक्सर खराब होता है। इस प्रकार, वैकल्पिक प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त अवसर हैं यहां हम एक ऐसे दृष्टिकोण को प्रस्तुत करते हैं जिसमें मानव कोशिकाओं को मानव पूर्वकाल क्रूजियत बंधन के ऊतक अवशेषों से अलग किया जाता है, संस्कृति में विस्तारित होता है, और इंजीनियर लिगमेंट्स बनाने के लिए इस्तेमाल होता है। व्यायाम रक्त में जैव रासायनिक परिवेश को बदलता है जैसे कि कई ऊतकों, अंगों और शारीरिक प्रक्रियाओं के कार्य में सुधार होता है इस प्रयोग में, अभिसरण का प्रयोग संस्कृति मीडिया को प्रायोगिक मानव सीरम के साथ किया गया था जिसे व्यायाम द्वारा 'वातानुकूलित' किया गया है। इस प्रकार हस्तक्षेप अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि एक प्रायोगिक ऊतक को पूर्ण अंतर्जात जैव रासायनिक परिवेश के संपर्क में आने से बाध्यकारी प्रोटीन और सहायक यौगिक शामिल हैं, जो कि एकब्याज की अज्ञात एजेंट उपचार के बाद, यांत्रिक फ़ंक्शन, कोलेजन सामग्री, आकृति विज्ञान, और सेलुलर बायोकेमेस्ट्री के लिए इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन का विश्लेषण किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यहां पर प्रस्तुत किये जाने वाले बंधन के ऊतकों के शारीरिक मॉडल की पारंपरिक मोनोलायर संस्कृति और पशु मॉडल बनाम चार प्रमुख फायदे हैं। सबसे पहले, बंधन निर्माण तीन आयामी होते हैं, जो मैकेनिकल गुण ( अर्थात् फ़ंक्शन) जैसे परम तन्यता तनाव, अधिकतम तन्यता भार और मापांक, को मापने के लिए अनुमति देता है। दूसरा, एन्थिसिस, बोनी और साइनेव तत्वों के बीच का इंटरफ़ेस, विस्तृत और कार्यात्मक संदर्भ में जांच की जा सकती है। तीसरा, पोस्ट-सर्जरी सीरम के साथ मीडिया को तैयार करने से व्यायाम-प्रेरित जैव-रसायन संबंधी परिवेश के प्रभावों की अनुमति मिलती है, जो कि निष्पक्ष तरीके से जांच के लिए व्यायाम के व्यापक स्वास्थ्य लाभ के लिए जिम्मेदार है। अंत में, यह प्रायोगिक मॉडल वैज्ञानिक अनुसंधान को मानवीय और नैतिक तरीके से आगे बढ़ाता है, इसके उपयोग के स्थान परपशु, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, रोग नियंत्रण केंद्र और खाद्य एवं औषधि प्रशासन का मुख्य जनादेश।
Introduction
कण्डरा और बंधन की चोट सामान्य हैं और सामान्य गतिशीलता और जीवन की गुणवत्ता पर कमजोर पड़ने वाले परिणाम हो सकते हैं। सर्जिकल हस्तक्षेप अक्सर आवश्यक होता है लेकिन सीमित और विविधतापूर्ण सफलता 4 , 5 हो सकती है । कैसे tendons और स्नायुबंधन विकसित, परिपक्व, और चोट का जवाब अधूरा है, और इस प्रकार प्रभावी शोध मॉडल की जरूरत है और अधिक प्रभावी उपचार के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए 5 । इस ज्ञान की खाई को संबोधित करने के लिए, पशु मॉडल का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन विवो अध्ययन में पर्यावरण को नियंत्रित करने में कठिनाई के साथ स्वाभाविक रूप से परिचयात्मक हैं और इच्छित हस्तक्षेपों को सीधे लक्ष्यित ऊतक को लक्षित करते हैं। इसके विपरीत, पारंपरिक मोनोलायर सेल संस्कृति के साथ इन विट्रो में प्रयोगात्मक वातावरण आसानी से नियंत्रित और मॉनिटर किया जा सकता है। हालांकि, यह तकनीक रासायनिक और मैकेनिकल परिवेश को कम कर सकता है और इस तरह यह संभव नहीं हो सकता है recapituदेर कोशिकाओं के विवो व्यवहार में ऊतक इंजीनियरिंग इन विट्रो पर्यावरण के नियंत्रण के साथ पशु मॉडल में विवो पर्यावरण में जटिल के फायदे से शादी करने में सक्षम है और शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए एक अतिरिक्त उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, इलिग्रेशन विकास की बेहतर समझ के साथ सशस्त्र, ऊतक इंजीनियरिंग भी भ्रष्टाचार के ऊतकों का स्रोत प्रदान कर सकता है जब सर्जिकल पुनर्निर्माण की आवश्यकता होती है 6 । इस प्रकार, यहां वर्णित विधि में इन विट्रो 3 डी इंजीनियर टिशू की पुष्टि की गई है जिसका इस्तेमाल लिगमेंट फ़ंक्शन और आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
फाइब्रिन आधारित कंठ या अस्थिबंध निर्माण का उपयोग कोलेजन फाब्रिलोजेनेसिस 7 और कण्डरा विकास 8 , साथ ही साथ ट्रांसजेक्शन अनुप्रयोगों सहित शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में किया गया है, जिसमें उनके उपयोगिता को भ्रष्टाचार के ऊतकों के रूप में पूर्ववर्ती जंग के भेड़ मॉडल में मूल्यांकन किया गया है।सिएट लिगमेंट (एसीएल) पुनर्निर्माण 9 हमारी प्रयोगशाला ने पहले दो ब्रशट, एक कैल्शियम फॉस्फेट हड्डी-प्रतिस्थापन सामग्री, सीमेंट एन्कर्स के फैले 3 डी इंजीनियर लिगमेंट मॉडल की स्थापना की है। इस मॉडल को विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के अधीन आसानी से जैविक कारकों के साथ संस्कृति मीडिया को पुरस्कृत करके या यांत्रिक उत्तेजना 11 को लागू कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस अस्थि-टू-हड्डी का अस्थिभंग मॉडल enthesis के गहराई से विश्लेषण, बोनी और sinew तत्वों के बीच अंतर है, जो चोट के लिए अतिसंवेदनशील है के लिए अनुमति देता है।
इस पद्धति को प्रस्तुत करने के लिए यहां 1 पर प्रकाश डाले जाने वाले अध्ययन में, हम लिगमेंट फ़ंक्शन पर जैव रासायनिक परिवेश में व्यायाम से प्रेरित बदलावों के प्रभाव में रुचि रखते थे। व्यायाम पूरे शरीर में विभिन्न प्रकार के ऊतकों में सेलुलर और अंग फ़ंक्शन को सुधारता है 2 , 3 , 12 , एक प्रभाव जो विभिन्न ज्ञात (उदा।, आईएल -6 13 , आईएल -15 14 , मेटोरिन-जैसी 15 , एक्सओसम 16 , 17 ), और अन्य अज्ञात, बायोकेमिकल कारकों को प्रणालीगत परिसंचरण में जारी करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है । इसके अलावा, व्यायाम के बाद जैव-रासायनिक वातावरण को समृद्ध किया जाता है, जो कि रिहाई से ग्रंथि ग्रंथियों की सहानुभूति तंत्रिका तंत्र उत्तेजना द्वारा उत्तेजित होती है ( जैसे , अधिवृक्क ग्रंथि 18 से कोर्टिसोल और कैटेकोलामाइन, और पूर्वकाल में पिट्यूटरी 1 9 से विकास हार्मोन )। हालांकि, मैं, व्यायाम व्यायाम प्रेरित जैव रासायनिक परिवर्तन से यांत्रिक प्रेरणा के प्रभावों को अलग करना असंभव है। कुछ अध्ययनों में अभ्यास के जवाब में कुछ परिसंचारी हार्मोन और साइटोकिन्स की अपेक्षित वृद्धि की विशेषता हैई जैसा ऊपर उल्लेख किया गया है, इन विट्रो में ईमानदारी से पुनरावृत्ति करने के लिए ज्ञात और अज्ञात दोनों ही कई कारक हैं । यही है, इन विट्रो अध्ययन के लिए कुछ कारकों को अलग करने से अपर्याप्त जैव रासायनिक प्रतिक्रिया की जटिलता को संबोधित किया गया है। इस अध्ययन में, हमने जांच की कि व्यायाम द्वारा प्रेरित सीरम जैव-रासायनिक वातावरण में परिवर्तन, इंजीनियर लिगमेंट फ़ंक्शन को प्रभावित करता है। जैव रासायनिक परिवर्तन के प्रभाव को अलग करने के लिए, हम प्रतिरोध अभ्यास के पहले और बाद में मानव प्रतिभागियों से सीरम प्राप्त करते थे और इसे मानव पूर्वकाल क्रूजियत बंधन (एसीएल) फाइब्रोब्लास्ट्स का उपयोग करके बनाए गए 3 डी इंजीनियर लिगमेंट्स का इस्तेमाल करते थे। इस मॉडल का उपयोग करके, हम यांत्रिक गुणों और कोलेजन सामग्री पर प्रभाव सहित, कार्यात्मक डेटा प्राप्त कर सकते हैं, साथ ही आणविक संकेतों पर प्रभाव को बढ़ा सकते हैं।
Protocol
निम्नलिखित प्रक्रियाएं एक प्रोटोकॉल का पालन करती हैं जिसे कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस की संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था; प्रारंभिक शोध से पहले स्थानीय नैतिकता बोर्ड से परामर्श करें
1. मानव एसीएल अवशेषों से प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट अलग
नोट: बाध्यता बनाए रखें और जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में सभी चरणों का पालन करें।
- नीचे वर्णित अनुसार मानवीय ऊतकों के संग्रह और उपयोग के लिए उचित नैतिकता समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन प्राप्त करें।
- 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में 100x एंटीबायोटिक / एंटिमाइकोटिक समाधान को कम करके 5x एंटीबायोटिक / एंटिम्यकोटिक (एबीएएम) समाधान तैयार करें
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 5 एक्स एबीएएम समाधान में एसीएल टिशू के टुकड़े ले लीजिए, पाचन चरण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऊपरी को एक रेजर ब्लेड के साथ छोटे टुकड़ों में काटें, यदि आवश्यक हो तो 1 x 1 x 1 सेमी 3 के अधिकतम आकार के लिए
सावधानी: स्थानीय बायोहाजर्ड नियमों का पालन करनाबायोहेज़र्ड कचरे का उचित उपयोग और बायोहाजर्ड कचरे के परिशोधन और निपटान - ऊतक के टुकड़े को डूबने के लिए कोलेजनेज समाधान का एक पर्याप्त मात्रा तैयार करें। उच्च ग्लूकोज डल्बेको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) में 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 0.22 माइक्रोन में फिल्टर कोलेजनेश टाइप II (1 मिलीग्राम / एमएल) भंग करें।
- पीबीएस में एसीएल ऊतक को 3 बार कुल्ला।
- डाइजेस्ट ऊतक एसीएल ऊतक को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और ऊतक को डूबने के लिए पर्याप्त मात्रा में कोलेजनेज समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (~ 17 घंटे) सेते हैं।
- पाचन अवधि पूरी हो जाने से पहले, डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया को 10% एफबीएस और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक के माध्यम से विकास माध्यम (जीएम) तैयार करें।
- पचाने का समय पूरा होने से 15 मिनट पहले, संक्षेप में ऊतक युक्त 50 एमएल ट्यूब 3 बार हर 5 मिनट भंवर।
- 25 एमएल सीरॉलॉजिकल पिपेट का प्रयोग करते हुए, टीआई को तोड़ने के लिए पचाने वाले ऊतक को सख्ती से दबाएंआगे बढ़ाना और कोशिकाओं को निकाल देना।
- 5 मिनट के लिए 1,500 xg पर अपकेंद्रित्र 10 एमएल जीएम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली की Aspirate
- चरण 1.8-1.9 दोहराएं तीन बार
- आखिरी मध्यवर्तीकरण के बाद, 5-10 एमएल जीएम में गोली resuspend हेमोसाइटेटोमीटर के साथ एक सेल गिनती करने के लिए सेल निलंबन के एक छोटे नमूने का प्रयोग करें और ट्रिपन ब्लू का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता का आकलन करें।
- प्रति प्लेट 3-4 x 10 5 कोशिकाओं की घनत्व पर 15 सेमी टिशू कल्चर प्लेट्स पर सेल निलंबन प्लेट।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में बनाए गए बाँझ इनक्यूबेटर में 70% संगम के लिए संस्कृति, जीएम को हर तीन दिनों में बदल रहा है। 5 मार्गों के भीतर कोशिकाओं का उपयोग करें या स्टोर करें (नीचे देखें)
- भविष्य के उपयोग के लिए कोशिकाओं को फ़्रीज़ करें
- 70% संगम पर कोशिकाओं को चयनाएं। पीबीएस के साथ मीडिया की इच्छाशक्ति और धोना कोशिकाओं। टिशू कल्चर प्लेट्स के निचले भाग को कवर करने के लिए पर्याप्त प्री-वार्म (37 डिग्री सेल्सियस) 0.05% ट्रिप्सिन जोड़ें। संस्कृति इन्क्यूब में जगह प्लेटेंकरीब 5 मिनट तक कोशिकाएं अलग हो जाती हैं (सत्यापित करें कि कोशिकाएं एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर तैर रही हैं) कोशिकाओं को एकत्रित करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें और फाल्कन ट्यूब में बांटना।
- गोली कोशिकाओं के लिए अपकेंद्रित्र, और डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया में 20% एफबीएस और 10% डाईमेथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) युक्त रिज़स्पेन्ड कोशिकाएं। कम से कम 24 घंटे के लिए क्रिस्टोवियल्स में विभाज्य सेल निलंबन और -1 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा। तरल नाइट्रोजन में जमे हुए cryovials स्टोर।
2. सिलिकॉन-लेपित प्लेट्स तैयार करें
- 35 मिमी टिशू कल्चर प्लेट्स तैयार करें: लिड्स निकालें और एक सपाट सतह पर खुली प्लेटें लगाएं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिलिकॉन इलस्टोमर किट को मिलाएं।
- प्रति 35 एमएम प्लेट के लिए लगभग 2 एमएल वितरित करने के लिए 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
- कमरे के तापमान पर 2-3 दिनों के लिए सिलिकॉन का इलाज करने की अनुमति दें।
3. ब्रशैइट सीमेंट एंकर तैयार करें
- अग्रिम में, सिलिकॉन रिवर्स-सिलेंडर युक्त मोल्ड तैयार करेंलंगर गठन के लिए एलएलएस। वांछित एंकर आकार और आकार के विनिर्देशों के लिए रिवर्स मोल्ड किया जा सकता है।
- अंतिम एंकर की वांछित ऊंचाई और व्यास का निर्धारण करें। यह प्रोटोकॉल एक 35 मिमी टिशू कल्चर डिश में शिल्प सिलिकॉन से बनाई गई कस्टम-बनाई गई मोल्ड का उपयोग करता है जिसमें लगभग 3.25 मिमी व्यास के प्लास्टिक सिलेंडर रखा गया था, जिससे लगभग 6.5 मिमी की अंतिम साँचा ऊंचाई की अनुमति दी गई थी। अंतिम एंकर आयाम लगभग 3-3.5 मिमी की ऊंचाई और व्यास के बारे में 3.4 मिमी व्यास के साथ 1.5 एंकर के नीचे से निकलने वाला 1.5 मिमी पिन है।
- एक 35 मिमी डिश में ढक्कन बनाया जाएगा जिसमें uncured सिलिकॉन जोड़ें। तदनुसार प्लास्टिक सिलेंडर रखें।
नोट: प्लास्टिक सिलेंडर का आकार अंतिम एंकर का व्यास निर्धारित करेगा। प्लास्टिक के सिलेंडरों और सिलिकॉन की मात्रा को अलग-अलग ऊंचाइयों के एंकर का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। ढालना में कूल्हे के नीचे और ढालना के तल के बीच मोटाई भी घ होगीएन्टर करें कि पिन कितना लंगर के नीचे से फैल सकता है जिससे लंगर को सिलिकॉन लेपित डिश में सुरक्षित रूप से पिन किया जा सकता है। - सिलिकॉन को इलाज के लिए अनुमति देने के बाद, प्लास्टिक सिलेंडर हटा दें और 35 मिमी डिश से मोल्ड को हटा दें।
- एक 3.5 एम orthophosphoric / 100 मिमी साइट्रिक एसिड समाधान तैयार करें। 11.5 एमएल ऑर्थोफोस्फोरिक एसिड में 0.961 ग्राम साइट्रिक एसिड भंग करें। मिलियक्यू पानी के साथ 50 एमएल तक के समाधान की मात्रा लाओ। कमरे के तापमान पर स्टोर समाधान और प्रकाश से बचाने के लिए
- ढालना तैयार करें: मोल्ड में प्रत्येक बेलनाकार अच्छी तरह के केंद्र में एक मिनिटियन पिन रखें।
- एक प्लास्टिक में 1 ग्राम / एमएल एकाग्रता में β-tricalcium फॉस्फेट और ऑर्थोफोस्फोरिक / साइट्रिक एसिड समाधान का मिश्रण बर्फ पर नाव का वजन।
- एक प्लास्टिक सेल खुरचनी का उपयोग करके सीमेंट को सख़्त मिलाएं
- मिक्स और विंदुक मिश्रण को मोल्ड में रखने के लिए सीमेंट को चक्रावून देनी चाहिए
- 1 मिनट के लिए 2,250 x ग्रा पर भरे मोल्ड को अपकेंद्रित करें
- ब्रशट सीमेंट एंकर को कमरे के तापमान पर रातोंरात सेट करने की अनुमति दें।
- मोल्ड से लंगर निकालें और प्रत्येक सिलिकॉन-लेपित प्लेट में 12 एमएम के दो एंकर को पिन करें।
- 70% इथेनॉल के साथ छिड़का कर प्लेटें और ढक्कनों को भरने, और बीएससी में डालकर पिन किए गए प्लेटों को निर्वहन करें। कम से कम 30 मिनट के बाद, प्लेटों की शुभकामनाएं और ढक्कन को प्रतिस्थापित करते हैं, जब तक आवश्यकतानुसार बीएससी में भंडारण नहीं किया जाता है।
4. मानव सीरम प्राप्त करें
- सुनिश्चित करें कि इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त नैतिकता समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदन प्राप्त किया गया है।
- सुनिश्चित करें कि लिखित सूचित सहमति मानव हस्तक्षेप ( जैसे व्यायाम, भोजन या दवा हस्तक्षेप) में भाग लेने के लिए प्राप्त की गई है जो सीरम में वांछित परिवर्तनों को प्रभावित करेगा। यहाँ, हम आराम पर संग्रह का वर्णन करते हैं और प्रतिरोध व्यायाम के बाद 15 मिनट का उपयोग करते हैं।
- एक प्रशिक्षित फ़्लाबुस्टोमिस्ट का उपयोग करके, एक उचित खाली किए गए कंटेनर में वेनिम्पुनचर द्वारा प्रतिभागी द्वारा आराम करने वाला एक रक्त नमूना प्राप्त करें प्रतिभागियों को वांछित व्यायाम प्रोटोकॉल में शामिल होने के बाद 15 मिनट बाद रक्त के नमूने एकत्र करें। जैसा कि पहले वर्णित है 1 , एक अंतर्जात जैव रासायनिक प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए इस प्रयोग में प्रतिरोध व्यायाम प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
- प्रतिभागियों ने सेट के बीच एक मिनट के आराम के साथ पांच सेट पैर प्रेस करवाए इसके बाद, प्रतिभागियों को घुटने के एक्सटेंशन का एक सेट और लगातार आराम से घुंघराले कर्ल का एक सेट नहीं होता है और फिर बैक-टू-बैक अभ्यास दो बार सेटों के बीच 1 मिनट के आराम के साथ दोहराते हैं।
- 10 मिनट के लिए 1,500 xg पर सेंटीफ्यूगिंग से पहले खून को थक्का करने दें बाँझ शर्तों के तहत, भावी मीडिया अनुपूरक (सीरम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) और जैव रासायनिक विश्लेषण (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत सीरम के एक छोटे से विभाज्य) के लिए बाँझ ट्यूबों में सीरम को स्थानांतरित करें।
5. फॉर्म इंजीनियर लिगमेंट्स
नोट: अग्रिम में, प्राथमिक फाई का विस्तार करेंब्रॉब्लास्ट्स और पिन किए गए ब्रशट एंकर के साथ सिलिकॉन-लेपित प्लेट्स तैयार करें।
- अभिकर्मकों को तैयार करें:
- थ्रोम्बिन तैयार करें डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया में 200 यू / एमएल में गोजातीय थ्रोम्बिन भंग करें। 0.22 सुक्ष्ममापी, विभाज्य, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान पर फ़िल्टर करें।
- फाइब्रिनोजेन तैयार करें डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया में 20 मिलीग्राम / एमएल में गोजातीय फाइब्रिनोजेन भंग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 3-4 घंटे के लिए सेते हैं, विघटन की सहायता के लिए हर 30 मिनट घूमता है। 0.22 सुक्ष्ममापी (कई फिल्टर की आवश्यकता हो सकती है) पर फिल्टर, विभाज्य, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एप्रोटिनिन तैयार करें पानी में 10 मिलीग्राम / एमएल में एट्रोटिनिन भंग करें। 0.22 सुक्ष्ममापी, विभाज्य, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान पर फ़िल्टर करें।
- अमीनोहेक्सानिक एसिड तैयार करें पानी में 0.1 ग्रा / एमएल पर अमीनोक्सोनिक एसिड भंग करें। 0.22 माइक्रोन, विभाज्य, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एस्कॉर्बिक एसिड तैयार करें 50 मिमी की एकाग्रता में डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया में एस्कॉर्बिक एसिड भंग करें। 0.22 माइक्रोन पर फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें <Li> एल-प्रोलिन तैयार करें 50 एमएम की एकाग्रता में पीबीएस में एल-प्रोलिन भंग करना 0.22 माइक्रोन पर फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
- परिवर्तन विकास कारक- β1 (टीजीएफ-β1) तैयार करें। 10 μg / एमएल की एकाग्रता में निर्माता के निर्देशों के मुताबिक टीजीएफ-बी 1 की पुनर्निर्धारण करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और स्टोर
नोट: बीएससी में बाँझ परिस्थितियों के तहत निम्नलिखित कदम उठाएं।
6. तन्यता परीक्षण इंजीनियर लिगमेंट्स
नोट: पीएसएस स्नान में कस्टम-निर्मित तन्यता परीक्षक का प्रयोग करके तन्यता परीक्षण किया गया था; रिवर्स-मोल्ड ग्रिप्स, जो बल ट्रांसड्यूसर के साथ मिलकर परीक्षण के दौरान ब्रशट सीमेंट एंकर को पकड़ते हैं।
- डिजिटल कैलिपर के उपयोग से बंधन की लंबाई और चौड़ाई निर्धारित करें; ऊतक के क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र की गणना
- लिगामेंट को प्लेट से बना लें और एंकर को इसमें रखेंरिवर्स ढाला पकड़ वाली, यह सुनिश्चित करना कि पीबीएस में निर्माण जलमग्न है।
- पकड़ के बीच की दूरी को समायोजित करें, इसकी प्रारंभिक लंबाई के निर्माण की लंबाई निर्धारित करें।
- परीक्षण शुरू करें: 0.4 मिमी / एस (या ~ 3% / एस) की तनाव दर पर विफलता के निर्माण के लिए दबाव डालें।
- परीक्षण पूरा करने के बाद, कोलेजन सामग्री के लिए ऊतक अवशेषों को संसाधित करें (अनुभाग 7 देखें)।
- परिणामी लोड-विरूपण डेटा से, तनाव-तनाव डेटा की गणना करें और ब्याज की यांत्रिक गुणों को बढ़ाएं; उदाहरण के लिए, अधिकतम तन्यता भार, अंतिम तन्य शक्ति और मापांक ( यानी , तनाव-तनाव वक्र के एक रेखीय क्षेत्र पर लोचदार संपत्ति)
7. इंजीनियर्स लिगमेंट्स की कोलेजन सामग्री के मात्राकरण
- ब्रशट सीमेंट एंकर से इंजिनियरिंग स्नायुबंधन निकालें और 120 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट तक शुष्क करें।
- सूखी द्रव्यमान निर्माण का निर्धारण करें और व्यक्तिगत 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें। सूखे निर्माण कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता हैआगे की प्रक्रिया तक
- प्रत्येक निर्माण के लिए, 200 μL 6 M एचसीएल जोड़ें। एक धूआं हुड में 2 घंटे के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 120 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें।
सावधानी: एचसीएल बेहद संक्षारक और अम्लीय है, फोड़ा-सबूत / सुरक्षित-लॉक ट्यूबों या ट्यूबों को सुरक्षित करने की अन्य विधि का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। - तरल इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में ट्यूबों को अपकेंद्रित करें, और एक धूआं हुड में 1.5 घंटे के लिए हीटिंग ब्लॉक में 120 डिग्री सेल्सियस पर लुप्त होने के लिए उन्हें बिना छोड़ दें।
- 200 μL हाइड्रॉक्सीप्रोलिन बफर में परिणामी गोली को फिर से खोलें। -20 डिग्री सेल्सियस तक स्टोर करें जब तक आवश्यक न हो।
- हाइड्रॉक्सीप्रोलिन बफर तैयार करें। 300 एमएल पानी में, 16.6 ग्राम साइट्रिक एसिड, 4 एमएल एसिटिक एसिड, 11.4 ग्राम NaOH जोड़ें और भंग तक हलचल। पीएच से 6-6.5 और मात्रा को 500 मिलीलीटर तक लाओ। एक संरक्षक के रूप में 250 μL टोल्यूनि जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित रखें।
- अभिकर्मकों को तैयार करें
- ट्रांस-4-हाइड्रोक्सी-एल-प्रोलिन तैयार करें 4 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए पानी में भंग। <Li> क्लोरामाइन-टी तैयार करें 14.1 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए पानी में भंग।
- एल्डिहाइड-प्रक्लोरेट तैयार करें 6 मिलीलीटर 1-प्रोपेनॉल, 2.6 एमएल प्रक्क्लोरिक एसिड (सावधानी: संक्षारक, मजबूत ऑक्सीडिजर, उचित सावधानी बरतने के लिए) और 0.5 एमएल पानी में 1.5 ग्राम 4-डाइमिथिलेमोबेंज़ाल्डहेड भंग करें।
नोट: नमूना 1: 4 से 1: 1:50 तक हो सकता है: बफर नमूना की अपेक्षित कोलेजन सामग्री पर निर्भर करता है; इस प्रकार कुछ परीक्षण-और-त्रुटि परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है जो एक कमजोर पड़ने वाले कारक को निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नमूना सेट के लिए उपयुक्त है (यानी, नमूने मानक वक्र के बीच की तरफ रखें)।
- प्रत्येक नमूना के लिए हाइड्रॉक्सीप्रोलिन मानक वक्र का उपयोग करके हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन के माइक्रोग्राम को शोषक मूल्य में परिवर्तित करें।
- हाइड्रॉक्सीप्रोलिन की मात्रा की गणना करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 2.5 गुणा करेंपतला नमूना याद रखें कि 500 μL कुल मिश्रण (200 μL पतला नमूना + 150 μL क्लोरामाइन टी +150 μL एपी समाधान) में से केवल 200 प्रत्येक नमूने को अच्छी तरह से जोड़ा जाता है।
- मूल नमूने में हाइड्रॉक्सीप्रोलीन की मात्रा की गणना करने के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक (धारा 7.7) के द्वारा गुणा करें।
- कोलेजन की मात्रा की गणना करने के लिए 0.137 से विभाजित करें (मानता है कि कोलेजन में 13.7% हाइड्रॉक्सीप्रोलिन 20 ) शामिल है।
नोट: कोलेजन में स्तनधारी हाइड्रोक्सीप्रोलीन बहुतायत ऊतकों और स्तनधारी प्रजातियों में थोड़ा भिन्न होती है; उदाहरण के लिए, सुअर और भेड़ अचिलिस टेंडन में क्रमशः 21 , 13.5 और 13.7% (हाइड्रॉक्सीप्रोलिन द्रव्यमान / शुष्क ऊतक द्रव्यमान) होते हैं। यहां, कोलेजन में प्रतिशत हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन का अनुमान लगाने के लिए 13.7% का उपयोग करें, जिसका उपयोग निम्न समीकरण का उपयोग करके ऊतक नमूने के कोलेजन सामग्री की गणना करने के लिए किया जाता है:
- कोलेजन फ्रे की गणना करने के लिए सूखी द्रव्यमान द्वारा विभाजित करेंCtion और एक प्रतिशत में परिवर्तित करें
8. आण्विक समापन बिंदुओं की मात्रा
नोट: तन्य परीक्षण और कोलेजन सामग्री के प्राथमिक परिणामों के अतिरिक्त, आणविक अंत बिंदुओं को यंत्रवत अंतर्दृष्टि जोड़ने के लिए 2 डी या 3 डी ऊतक पर मापा जा सकता है। आणविक अंतबिंदु को निर्धारित करने के लिए जैवसैसेस का उपयोग किया जा सकता है (संदर्भ के लिए नीचे दिए गए खंड को देखें, इन विट्रो लिगमेंट फ़ंक्शन में पोस्ट-सर्जरी सीरम के प्रभाव)।
- 3D ऊतक के लिए:
- उपरोक्त चरण 5 के अनुसार तैयार करें
- उपचार / हस्तक्षेप के निर्माण के बाद, तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रिज निर्माण होता है।
- सूखा बर्फ पर ठंडा होकर मोर्टार और मूसल का उपयोग करना, एक पाउडर में तने का निर्माण करना। चरण 8.4 / 5 पर जारी रखें)।
- 2 डी टिशू के लिए:
- एक मोनो में संगम के लिए मानव एसीएल फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतिडीएमईएम वाले छह अच्छी तरह प्लेटों में ओलेयर
- डीएमईएम की तरक्की करें और अपनी प्रयोग रणनीति के अनुसार उपचार मीडिया को लागू करें ( उदाहरण के लिए , समय का कोर्स या खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग)
- पीबीएस के साथ उपचार मीडिया और वॉश कोशिकाओं का शुभकामनाएं।
- एक उचित निष्कर्षण बफर / अभिकर्मक (अगले देखें) का उपयोग कर एकत्र करने के लिए स्क्रैप कोशिकाओं।
- प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण: प्रोटीन lysates प्राप्त करने के लिए एक साइटोसोलिक निष्कर्षण बफर ( उदाहरण के लिए , 250 एमएम सुक्रोज, 50 एमएम ट्राइस पीएच 7.4, 5 एमएम एमजीएल 2, और प्रोटीज / फॉस्फेटस अवरोधक कॉकटेल) का उपयोग करें। प्रोटीन एकाग्रता परख प्रदर्शन और मानक पश्चिमी ब्लोट प्रक्रियाओं के अनुसार विश्लेषण जारी रखें।
- जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण: उच्च आरएनए प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार 500 μL आरएनए अलगाव अभिकर्मक का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें। मानक प्रक्रियाओं के अनुसार रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन और वास्तविक-समय मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण करना
- डीएनए अलगाव: पृथक और जीवा मात्रा जीनिर्माता के निर्देशों के अनुसार एनोमिक डीएनए डीएनए अलगाव अभिकर्मक का उपयोग करना। 260 एनएम पर नमूना शोषक मापने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को बढ़ाएं।
Representative Results
इंजीनियर अवयव गठन और प्रयोगात्मक हस्तक्षेप का अवलोकन
चित्रा 1 चित्रा 1 इंजीनियर अस्थिभंग के गठन के एक सिंहावलोकन दिखाता है। ब्रशैइट सीमेंट, एक हड्डी के विकल्प की सामग्री 22 बेलनाकार कुओं में β-tricalcium फॉस्फेट के साथ एक orthophosphoric एसिड / साइट्रिक एसिड समाधान के संयोजन के द्वारा तैयार किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, अगर ऊतकों के यांत्रिक फ़ंक्शन को सीधे मापने के लिए नहीं, तो ऊतक के गठन में एंकर के रूप में 3-0 रेशम सिलाई का इस्तेमाल किया जा सकता है। इन्हें सिलिकॉन-लेपित 35 मिमी व्यंजनों के अलावा 12 मिमी और 70% इथेनॉल में भिगोने से निष्फल कर दिया गया है। एसिएल पुनर्निर्माण सर्जरी के दौरान प्राप्त पूर्वकाल क्रूसीएट बंधन अवशेषों से फाइब्रोब्लैस्ट्स अलग हैं। विस्तार के बाद, 2.5 x 10 5 कोशिकाओं को ब्रशट सीमेंट एंकर-पिनयुक्त डिश में बनाई गई एक फाइब्रिन जेल में समझाया जाता है। गठन के बाद, बंधन constrयूके को यांत्रिक गुणों, कोलेजन सामग्री, सेल प्रसार, जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन स्तर और ऊतक के आकारिकी में परिवर्तन के लिए जांच की जा सकती है।
संस्कृति के दौरान, कोशिकाओं में फाइब्रिन जेल का अनुबंध होता है और दो एंकर ( चित्रा 2 ए ) के बीच एक रैखिक ऊतक होता है। संस्कृति में 1-2 दिनों के बाद, कोशिकाओं को फाइब्रिन जेल, विस्तारित सेल प्रक्रियाओं से जुड़ा हुआ है, और कर्षण बलों ( चित्रा 2 बी ) को लागू करना शुरू कर दिया है। जैसे कि फाइब्रिन जेल कर्षण बलों द्वारा अनुबंधित होता है और सेलुलर एंजाइमों से टूट जाता है, दो एंकर बिंदुओं के बीच तनाव उत्पन्न होता है और हमारी कोशिका इस अक्ष ( चित्रा 2 बी ) के समानांतर संरेखित होती है और कोलेजन जमा करना शुरू करते हैं। 4-5 दिनों के बाद, निर्माणों ने एक रैखिक बेलनाकार ऊतक के गठन वाले एंकरों के आसपास अनुबंध किया है ( चित्रा 2 ए ; इस बिंदु पर बाहरी उत्तेजनाओं को सिस्टम पर लागू किया जा सकता है (अंतराल)इस समय एंटियन रेखीय ऊतक गठन प्रक्रिया में बाधा डालने से बचा जाता है)। हस्तक्षेप में मानव या पशु सीरम के साथ किसी भी हस्तक्षेप, बहिर्जात साइटोकिन्स और विकास कारक, यांत्रिक उत्तेजनाओं को नियोजित करने, या ऑक्सीजन तनाव जैसे अन्य पर्यावरणीय कारकों को बदलने के बाद संस्कृति मीडिया के पूरक के रूप में शामिल हो सकते हैं। 200 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड, 50 माइक्रोग्राम एल-प्रोलाइन और 5 एनजी / एमएल टीजीएफ-बी 1 के साथ पूरक विकास माध्यम (10% एफबीएस और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ डीएमईएम) का उपयोग करते हुए हमने निर्धारित किया है कि कोशिका प्रसार 2 सप्ताह की संस्कृति अवधि ( चित्रा 2 सी ) और वास्तव में, प्रकाश माइक्रोस्कोपी संस्कृति के 14 दिनों ( चित्रा 2 बी ) में अत्यधिक संरेखित कोशिकाओं युक्त घने ऊतक का पता चलता है।
इंजीनियर स्नायुबंधन का आकलन
संस्कृति की अवधि के अंत में, इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन का एक विभिन्न प्रकार में मूल्यांकन किया जा सकता हैतरीके के वाई इस प्रणाली का एक प्रमुख लाभ यांत्रिक परीक्षण के माध्यम से ऊतक में कार्यात्मक परिवर्तनों को निर्धारित करने की क्षमता है, जो देशी बंधन की यांत्रिक भूमिका है। यूनिअक्सिअल तन्यता परीक्षण का उपयोग यांत्रिक गुणों को विफलता, अंतिम तन्यता ताकत, और यंग के मापांक सहित लोड करने के लिए किया जा सकता है। Viscoelastic गुणों को भी तनाव छूट और रेंगना परीक्षणों के साथ मापा जा सकता है। चित्रा 3 ए एक कस्टम निर्मित अस्थानिक तन्यता परीक्षक में रिवर्स ढाला पकड़ में आयोजित एक इंजीनियर लिगमेंट दर्शाया गया है। ऊतक विफलता के लिए तनावपूर्ण है के रूप में सही पकड़, बंधन भर में लोड को मापने के लिए एक बल ट्रांसड्यूसर से जुड़ा हुआ है। चित्रा 3 बी विफलता के लिए एक परीक्षण के लिए एक प्रतिनिधि तनाव-तनाव साजिश से पता चलता है। मैकेनिकल टेस्टिंग से गुजरने के बाद, एक ही संरचनाएं सूखे और संसाधित हो सकती हैं, जो हाइड्रॉक्सीप्रोलिन परख के लिए 23 को कुल कोलेजन सामग्री के साथ-साथ अन्य बायोचMical assays प्रति शर्त के लिए पर्याप्त मात्रा में अतिरिक्त नमूने के साथ, एक प्रयोगात्मक हस्तक्षेप की पूरी तरह से जांच की जा सकती है, जिसमें सेल प्रसार, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव और हिस्टोलॉजिकल आकारिकी शामिल हैं। जबकि 14 दिन हमारे अध्ययन के लिए एक विशिष्ट समापन बिंदु है, चित्रा 3 सी में दिखाए गए अनुसार 28 दिनों की संस्कृति के माध्यम से इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन अपने यांत्रिक गुणों और कोलेजन सामग्री में सुधार जारी रखते हैं और संस्कृति 24 में कम से कम 3 महीने तक जीवित रह सकते हैं।
दाता परिवर्तनशीलता प्रयोगात्मक दोहराव के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। चित्रा 4 ली एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए एक प्रतिनिधि प्रयोग को दर्शाता है । 25 पहले वर्णित में 2-सप्ताह की संस्कृति के बाद 7 अलग एसीएल दाताओं (एन = 3 नर और एन = 4 मादा) की तुलना ठेठ तन्यता गुणों और कोलेजन सामग्री का प्रदर्शन करना पूरक मीडिया विकास समान एसीएल संग्रह, दाता की उम्र, चोट के समय, लिंग, आदि से कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन, दालदारों और कोलेजन अंश में अंतर के अपवाद के साथ पुरुष और महिला दाताओं के बीच समान गुणों के बीच कम परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन करते हैं। उपर्युक्त अध्ययन में, इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन का प्रयोग इन विट्रो मॉडल के रूप में किया गया था क्योंकि जांच के लिए महिलाओं की तुलना में एसीएल की चोट का काफी अधिक जोखिम है, और यह दर्शाता है कि महिला दाताओं से अलग एसीएल फाइब्रोब्लास्ट स्वाभाविक रूप से कमजोर और कम कोलेजन्य इंजीनियर इंजीनियर स्नायुमेंट्स नहीं बनाती हैं।
इन विट्रो लैगमेंट फ़ंक्शन में पोस्ट-सर्जरी सीरम के परिवेश का प्रभाव
हमने पहले शारीरिक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इंजीनियर स्नायुबंधन की क्षमता का प्रदर्शन किया है 1 ,एसएस = "एक्सएफ़"> 25 पश्चिम एट अल द्वारा रिपोर्ट के अनुसार निम्नलिखित प्रतिनिधि प्रयोग में 1 , हमने लिगमेंट फ़ंक्शन पर व्यायाम के जैव रासायनिक प्रभाव को निर्धारित किया और यहां कार्यप्रणाली और निष्कर्षों को उजागर किया। मानव एसीएल कोशिकाओं का उपयोग करके हमने इंजिनिअर्ड लिगमेंट्स का निर्माण किया और संस्कृति के 7 दिन पर एक हस्तक्षेप का प्रयोग किया, इसमें मानवता सीरम एकत्रित पूर्व या पोस्ट-कसरत के साथ कथित संस्कृति मीडिया शामिल है। संक्षेप में, हमने स्वस्थ युवा पुरुष प्रतिभागियों को भर्ती किया और प्रतिरोध व्यायाम के एक तीव्र दौर से पहले और बाद में रक्त के नमूनों को एकत्रित किया जो मानव विकास हार्मोन (जीएच) सहित परिसंचारी हार्मोन और साइटोकिन्स बढ़ता है। मानव सीरम पूर्व- और बाद के अभ्यास के रक्त के नमूनों से पृथक किया गया था और इंजीनियर मीडिया में संक्रमित बंधन संस्कृति के दूसरे सप्ताह ( चित्रा 5 ए ) के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के स्थान पर इस्तेमाल किया गया था। जीएच और इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक 1 (आईजीएफ -1) में परिवर्तन के लिए एलीसा के प्रयोग से पूर्व और पोस्ट-व्यायाम सीरम के नमूने का विश्लेषण किया गया था।जिसकी एकाग्रता को व्यायाम द्वारा बदल दिया जा सकता है ( चित्रा 5 बी)। इस जानकारी का उपयोग व्यायाम के जवाब में सीरम में परिवर्तन के साथ इंजीनियर लिग्जेमेंट पर सीरम प्रभावों को सहसंबंधित करने के लिए किया गया था। 14 दिन की संस्कृति अवधि के बाद, मैकेनिकल परीक्षण और कोलेजन सामग्री के एक हाइड्रोक्सीप्रोलाइन निर्धारण के जरिये लिगमेंट निर्माण का मूल्यांकन किया गया और पोस्ट-सर्जरी सीरम के जवाब में अधिकतम तन्यता भार और कोलेजन सामग्री दोनों में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन किया। यह आशय यह है कि यह प्रभाव जीएच या आईजीएफ -1 के व्यायाम-प्रेरित रिलीज से संबंधित था या नहीं, एक अलग प्रयोग में इंजीनियर अभिकर्मक का गठन किया गया था और मानव पुन: संयोजक जीएच या आईजीएफ-1 की खुराक प्रतिक्रिया के साथ इलाज किया गया था। दिलचस्प है, जबकि सीरम जीएच रक्त में वृद्धि हुई है ( चित्रा 5 बी -i), उत्तरोत्तर बढ़ती सांस्कृतिक मीडिया में पुनः संयोजक जीएच एकाग्रता में कोलेजन सामग्री ( चित्रा 5 डी -i) या यांत्रिक वृद्धि नहीं हुईइंजीनियर लिगमेंट्स में गुण (डेटा नहीं दिखाया गया)। इसके विपरीत, अभ्यास के बाद सीरम आईजीएफ -1 के स्तर में वृद्धि नहीं हुई, लेकिन एक खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग से पता चला कि संस्कृति के मीडिया में बढ़ते स्तर ने अस्थायी निर्माण ( चित्रा 4 डी -ii) की कोलेजन सामग्री में सुधार किया। इस प्रकार, जबकि व्यायाम के बाद व्यायाम जीएच में मजबूत वृद्धि हुई है, आरओएचएच का प्रयोग करने वाली खुराक-प्रतिक्रिया का प्रयोग संदेह उठाता है कि क्या जीएच प्रत्यक्ष रूप से इंजीनियर लिगमेंट्स के फेनोटाइपिक वृद्धि के लिए जिम्मेदार है (कम से कम, 22 केडीए isoform अकेले नहीं है जिम्मेदार होना दिखाई देता है)। इसके विपरीत, सीरम आईजीएफ -1 को 15 मिनट के बाद अभ्यास में बदल नहीं किया गया था, एक व्यापक रेंज के सांद्रता पर परीक्षण किया गया था, जो बताता है कि आईजीएफ -1 कोलेजन सामग्री में सुधार करने में सक्षम है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक श्रेणी के माध्यम से बढ़ती हुई rhIGF-1 सांद्रता का अनुमान है कि शारीरिक स्तर कोलेजन सामग्री में काफी वृद्धि नहीं हुई है इस प्रकार, अद्वितीय पोस्ट व्यायाम सीरम enviroएनमेंट इंजीनियर के स्नायुबंधन के मैकेनिक्स और कोलेजन में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण था।
यहां 1 में प्रकाशित अध्ययन में, नैतिक विचारों के कारण प्रयोगात्मक सीरम की मात्रा सीमित थी; इसलिए, अल्पावधि 2 डी जैवसेज, जिनकी सीरम मांग कम थी, कोलेजन में वृद्धि के लिए जिम्मेदार आणविक तंत्रों की जांच करने के लिए उपयोग किया गया था। एसीएल फाइब्रोब्लास्ट 6-अच्छी तरह प्लेटों में संगम के लिए सुसंस्कृत थे और 1 घंटे के लिए बाकी या पोस्ट-सर्जरी सीरम के साथ इलाज किया गया था, और पुनः संयोजक जीएच, आईजीएफ -1, टीजीएफ-बी 1 1 और पीआई 3 के / एमटीओआरसी 1 में लक्ष्य की सक्रियण की तुलना में तुलना की गई थी। , ईआरके 1/2, और स्माड सिग्नलिंग पथ निर्धारित किए गए थे। पोस्ट-व्यायाम सीरम की उपस्थिति में, पीआई 3 के / एमटीओआरसीए 1 और ईआरके 1/2 मार्ग ने क्रमशः एस 6 के फॉस्फोरिलेशन ( चित्रा 5 डी -i) और ईआरके 1/2 ( चित्रा 5 डी -ii) द्वारा मूल्यांकन के रूप में अधिक सक्रियण दिखाया।हार्मोन और साइटोकिन खुराक की प्रतिक्रियाओं की तुलना में, जबकि जीएच का एमटीओआर संकेत ( चित्रा 5 डी -i) पर थोड़ा सा सकारात्मक प्रभाव था और आईजीएफ -1 ने सबसे कम मात्रा में सकारात्मक प्रभाव दिखाया, जीएच, आईजीएफ -1, और टीजीएफ के तीन उपचार -बी 1 ने पीआई 3 के / एमटीओआरसी 1 और ईआरके 1/2 सिग्नलिंग में वृद्धि के लिए खाता नहीं था। एक साथ लिया, हमारे 3 डी इंजीनियर लिगमेंट मॉडल और 2 डी बायोसाइड डेटा से पता चलता है कि पोस्ट-सर्जरी सीरम पर्यावरण पीआई 3 के / एमटीओआरसी 1 और ईआरके 1/2 मार्गों के सक्रियण के माध्यम से इंजीनियर लिगमेंट फ़ंक्शन और कोलेजन सामग्री को सुधारने में सक्षम है।
संक्षेप में, एक इंजीनियर लगीमेंट मॉडल का उपयोग व्यायाम-वातानुकूलित सीरम के साथ मिला, हम सक्षम थे i) इंजीनियर लिगमेंट फ़ंक्शन और कोलेजन पर पोस्ट-सर्जरी सीरम पर्यावरण के प्रभाव की जांच, ii) सीरम हार्मोन एकाग्रता में परिवर्तन के साथ अस्थिबंधन के फेनोटाईप में परिवर्तनों को सहसंबंधित करता है, यह निर्धारित करने के उद्देश्य के साथ कि सीरम में कौन से परिवर्तनों में परिवर्तन हुआइंजेक्शन लिगमेंट्स में ईएस और iii) सीरम बायोकेमिकल परिवेश के आणविक लक्ष्यों की जांच के लिए 2 डी जैवसैप्स का उपयोग करके कार्य के दायरे को आगे बढ़ाते हैं, जो आणविक तंत्र निर्धारित करते हैं जो पोस्ट-सर्जरी सीरम द्वारा सक्रिय होते हैं जो कि लिगमेंट फ़ंक्शन में सुधार के लिए आगे बढ़ते हैं।
चित्रा 1: इंजीनियर अवयवों के गठन और उपयोग के अवलोकन ब्रशैइट सीमेंट एंकर निर्मित होते हैं और सिलिकॉन-लेपित प्लेट्स में पिन किए जाते हैं। प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट अलग और एसीएल अवशेषों से विस्तारित हैं। इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन दो ब्रशट सीमेंट एन्कर्स के आसपास फ़िब्रिन जेल में फाइब्रोब्लास्टों को ढंकाकर बनते हैं। इंजीनियर अवयव सुसंस्कृत और जो भी विशिष्ट रासायनिक या यांत्रिक ( उदाहरण के लिए , एक बायोरेक्टेक्टर के माध्यम से) उत्तेजनाओं के साथ इलाज किया वांछित वांछित समापन बिंदु पर, इंजीनियर अभिकर्मकों को एकत्र किया जा सकता है और मैकेनिक के लिए मूल्यांकन किया जा सकता हैएल गुण, जीन अभिव्यक्ति, कोलेजन सामग्री, प्रोटीन अभिव्यक्ति, और ऊतक विज्ञान। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2. चित्रा 2. प्राइमरी लिगमेंट फायब्रोब्लास्ट्स दो ब्रशट सीमेंट एंकर फैले फैब्रिन आधारित अस्थि-टू-अस्थि इंजीनियर लिगमेंट का निर्माण करती हैं। ( ए ) समय के साथ, फाइब्रोब्लस्ट्स एक रैखिक ऊतक बनाने वाले ब्रशट सीमेंट एंकर के चारों ओर फाइब्रिन जेल का अनुबंध करते हैं। ( बी ) पहले तीन दिनों में, कोशिकाएं फाइब्रिन जेल से जुड़ी होती हैं और कर्षण बलों को लागू करती हैं, निर्माण के लंबे अक्ष के साथ कोशिकाओं को संरेखित करती हैं। 14 दिनों से अधिक, कोशिकाओं के एक उच्च गठबंधन ऊतक के रूप में। स्केल बार = 160 माइक्रोन ( सी ) इंजीनियर लिगमेंट्स की डीएनए सामग्री ओ में वृद्धि जारी हैसंस्कृति में 14 दिनों का व्यवहार करते हैं क्योंकि कोशिकाएं फैली हुई हैं। डेटा को प्रति ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, n = 3-4 प्रति ग्रुप प्रति समूह समूहों। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: इंजीनियर लीगमेंट यांत्रिक गुणों और कोलेजन सामग्री समय के साथ सुधार। ( ए ) लिगमेंट के निर्माण के लिए एक प्रकार का तन्यता परीक्षण किया जाता है जो कि लिगमेंट फ़ंक्शन पर दिए गए हस्तक्षेप के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। जैसा कि दिखाया गया है, दो रिवर्स मोल्ड, 3 डी मुद्रित पकड़ वाली पारस्परिक रूप से आकार वाले एन्कर्स हैं जो इंजीनियर साइनेव द्वारा पाटा रहे हैं। एन्कर्स को स्टेपर मोटर और बल ट्रांसड्यूसर के साथ युग्मित किया जाता है जिससे टेस्ट ऊतक की तनाव / तनाव घट जाती है, जिससे यांत्रिक गुणों को निर्धारित किया जा सकता है। ( बी </ Strong>) प्रतिनिधि तनाव-तनाव वक्र एक इंजीनियर की विफलता से तनावपूर्ण बंधन से। 28 दिनों के दौरान, ( सी ) अंतिम तन्य शक्ति (यूटीएस), ( डी ) अधिकतम तन्यता भार (एमटीएल), ( ई ) यंग के मापांक, और ( एफ ) कोलेजन अंश में सुधार जारी है। डेटा को प्रति ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, n = 5 प्रति समूह का निर्माण होता है * अन्य सभी समूहों से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: कम दाता परिवर्तनशीलता को प्रदर्शित करते हुए, इंजीनियर लिगमेंट्स की कार्यक्षमता और जैव रासायनिक सामग्री के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन 7 अलग दाताओं (एन = 3 पुरुष, एन = 4 मादा) का गठन किया गया था। 2 सप्ताह के बाद ओ( ए ) अधिकतम तन्यता भार, ( बी ) अंतिम तन्य शक्ति (यूटीएस), ( सी ) यंग का मापांक, ( डी ) क्रॉस-आंशिक क्षेत्र (सीएसए), ( ई ) कुल कोलेजन सामग्री में अंतर के लिए मूल्यांकन किया गया निर्माण, और ( एफ ) कोलेजन को शुष्क द्रव्यमान के एक अंश के रूप में डेटा को ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और छात्र का टी-टेस्ट के साथ सांख्यिकीय महत्व होता है। * अन्य समूहों (पी <0.05) से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है ली एट अल से अनुकूलित चित्रा 25 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. चित्रा 5. इंजीनियर लिगमेंट्स बीआईएलओ के जवाब में यांत्रिक और जैव रासायनिक परिवर्तन को प्रदर्शित करते हैंगैलिक हस्तक्षेप ( ए ) सीरम को रक्त से अलग किया गया था विषयों पूर्व- (RestTx) और पोस्ट-कसरत (एक्स्टटीक्स) से एकत्रित किया जाता है और संस्कृति के दूसरे सप्ताह के दौरान इंजीनियर लिगमेंट्स का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। ( बी ) (i) मानव विकास हार्मोन (जीएच) और (ii) इंसुलिन जैसी वृद्धि कारक (आईजीएफ) -1 के स्तर बाकी और व्यायाम सीरम एलिसा के माध्यम से मात्रा निर्धारित किए गए थे। ( सी ) एक्स्टटीक्स के साथ इलाज वाले इंजीनियरीकृत स्नायुबंधन में सुधार हुआ (i) कोलेजन सामग्री और (ii) अधिकतम तन्यता लोड। पी <0.05 पर निर्धारित महत्व स्तर के साथ टी-टेस्ट द्वारा जुड़ी तुलना की पुनरीक्षा (विश्रांति और एक्सटीक्स) का सांख्यिकीय महत्व का विश्लेषण किया गया था। ( डी ) (i) जीएच और (ii) IGF-1 का एक खुराक-प्रतिक्रिया का उपयोग एग्ज़टेक्स के कारण कोलेजन सामग्री में परिवर्तन के लिए इन कारकों के संभावित योगदान का निर्धारण करने के लिए किया गया था। ई) 2 डी बायोसेसेस का इस्तेमाल जीएच, रेस्टटक्स और एक्स्टटीक्स की बढ़ती खुराक के प्रभावों की तुलना करने के लिए किया गया, जैसे कि (i) एस 6 के थ्र 38 के फॉस्फोरेलेशन के आणविक सिग्नलिंग लक्ष्य9 और (ii) ईआरके 1/2 टीआर 202 / टायर 204 एनोवा और तुके के एचएसडी का उपयोग करके दो से अधिक प्रयोगात्मक समूहों की सांख्यिकीय तुलना की गई। डाटा को ± एसडी के रूप में पेश किया गया है * नियंत्रण (पी <0.05) से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है और § 150 एनजी / एमएल और 300 एनजी / एमएल IGF-1 से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। पश्चिम एट अल से अनुकूलित चित्रा 1 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
Discussion
वर्तमान पांडुलिपि में लिगामेंट ऊतक के एक मॉडल का वर्णन किया गया है जो शोधकर्ताओं के अनुसंधान विषयों के व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ ऊतक विकास से अनुवादकारी / नैदानिक प्रश्नों के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक मंच है। यहाँ वर्णित इंजीनियर लिगमेंट मॉडल एक बहुमुखी प्रोटोकॉल पर आधारित है जिसे पूरे कार्यप्रवाह ( चित्रा 1 और चर्चा अनुभाग ) के दौरान विभिन्न बिंदुओं पर रूपांतरित किया जा सकता है। इसके अलावा, इन विट्रो पर्यावरण में स्वाभाविक रूप से कमी जाने वाली प्रकृति को शारीरिक स्थिति के निकट लाया जा सकता है, जो कि वातानुकूलित मानव या पशु सीरम के साथ फ़ीड मीडिया का उपयोग कर सकता है।
निर्माण विभिन्न स्रोतों से फाइब्रोब्लैस्ट्स का उपयोग करके किया जा सकता है
यहां दिखाए गए कार्यप्रणाली और प्रतिनिधि परिणाम प्राथमिक एसीएल फाइब्रोब्लास्ट के उपयोग पर आधारित होते हैं, जबकि सेल अलगाव प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के प्राथमिक फाइब्रोब्लैस्टों को इकट्ठा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। के रूप में वर्णितचित्रा 4 में , युवा मानव दाताओं से अलग प्राथमिक कोशिकाओं के साथ गठित इंजीनियर लिगमेंट्स कम दाता परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। प्रारंभिक अलगाव और पारगमन प्रतिबंध द्वारा प्राथमिक कोशिकाएँ सीमित हैं; सेल लाइनों के उपयोग के प्रयोगों की प्रजनन क्षमता में सुधार हो सकता है। अन्य कोशिका प्रकारों के उपयोग के लिए सेल संस्कृति मीडिया और फाइब्रिन जेल फॉर्मूलेशन में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि मानव मेसेनचेमिकल स्टेम सेल (एमएससी) 2 सप्ताह के दौरान ब्रश सीमेंट एन्कर्स के बीच रैखिक ऊतकों का निर्माण करने में सक्षम नहीं हैं जबकि अश्वशक्ति के बेहतर डिजिटल वैंडल कण्डरा फाइब्रोब्लास्ट, घोड़े का अस्थि मज्जा स्ट्रॉम्बल कोशिकाएं, भ्रूण कंडरा फाइब्रोब्लास्ट , और मूरीन सी 3 एच 10 टी 1/2 एमएससी तेजी से एक रेखीय ऊतक (अप्रकाशित अवलोकन) बनाने के लिए फाइब्रिन जेल को अनुबंध और डाइजेस्ट करते हैं। यह विपरीत कोशिका सिकुड़ना, प्रसार, और फाइब्रिनॉलिटिक एंजाइम उत्पादन में अंतर का एक परिणाम हो सकता है।
रासायनिक के आवेदनऔर यांत्रिक उत्तेजना
यहां वर्णित विधि में, ब्रशट सीमेंट एंकर के आसपास फ़िब्रिन-आधारित टिशू रूपों, एक खिंचाव बायोरेक्टर 11 के माध्यम से यांत्रिक उत्तेजना के आवेदन के साथ-साथ अंत-बिंदु तन्यता परीक्षण के लिए अनुमति देता है। ब्रशट सीमेंट-सॉफ्ट टिशू इंटरफेस (एन्थेसिस) की उपस्थिति में आगे की जांच और सुधार 22 , 26 (नीचे क्लिनिकल एप्लीकेशन अनुभाग देखें) के लिए एक अवसर प्रस्तुत किया गया है। इन विट्रो पर्यावरण में, रासायनिक और यांत्रिक कारकों का योगदान अधिक आसानी से पहचाना जा सकता है; इसका एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है, जिससे व्यायाम के बाद के सीरम के वातावरण के प्रभाव को व्यायाम के यांत्रिक उत्तेजनाओं से अलग किया गया था। प्रयोगात्मक हस्तक्षेप, उपचार की संरचना, और एक सटीक परिवर्तन की उम्मीद करने के लिए उपयुक्त अंत बिंदुओं की समय सीमा निर्धारित करने के लिए पायलट अध्ययन की आवश्यकता हो सकती है। फोउदाहरण के लिए, पोस्ट-सर्जरी सीरम अध्ययन 1 में , प्रयोगात्मक उपचार की लंबाई मीडिया को सप्लाई करने वाली सीरम की आपूर्ति से विवश हुई थी, जिससे निर्माण दूसरे दिन दूसरे दिन खिलाया गया था। इसके अलावा, संस्कृति के दूसरे सप्ताह के दौरान, संस्कृति मीडिया को बाकी या पोस्ट-व्यायाम सीरम के साथ एस्कॉर्बिक एसिड और एल-प्रोलाइन को बनाए रखा गया था जबकि टीजीएफ-बी 1 को हटा दिया गया था। टीजीएफ-β1 एक ज्ञात प्रो-फाइबोटिक विकास कारक है जो व्यायाम के बाद सीरम में बढ़ता है 27 । इसलिए, पोस्ट-व्यायाम सीरम के टीजीएफ-β1- संबंधी प्रभावों को अस्पष्ट करने से बचने के लिए, इस साइटोकिनी को संस्कृति मीडिया में नहीं रखा गया था।
यांत्रिक इंजीनियर के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए यह इंजीनियर इग्नाइजेंट लिगमेंट मॉडल का इस्तेमाल किया जा सकता है। ब्रशट सीमेंट एंकर को रोकने के लिए इंजीनियरिंग रिवर्स मॉडलिंग पकड़ से ( चित्रा 1 में दिखाए गए अक्षीय तन्यता परीक्षक के समान) खिंचाव bioreactors को इंजिन को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है आइएयर लिगमेंट्स हमारी प्रयोगशाला ने पहले से इस मॉडल का इस्तेमाल एक कस्टम-निर्मित बायोरिएक्टर 11 में अनियमित तन्यता वाले खंड के लिए इंजीनियर लिगमेंट्स के आणविक सिग्नलिंग प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए किया है, जो इन विट्रो खिंचाव प्रतिमान के तर्कसंगत डिज़ाइन के लिए या संभवतः, संभावित रूप से, vivo में बेहतर समझ प्रदान करेगा खिंचाव / गतिविधि / चिकित्सीय अनुप्रयोगों
इंजीनियर स्नायुबंधन का आकलन
पारंपरिक मोनोलेयर संस्कृति के साथ, जीन / प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 3 डी निर्माण का परीक्षण किया जा सकता है; इसके अतिरिक्त, उनके 3 डी आकारिकी भी कार्यात्मक और आकारिकी परिवर्तनों का आकलन करने का अवसर प्रदान करती है और दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए निर्माण में बनाए जा सकते हैं ( चित्रा 3 )। जबकि इंजीनियर स्नायुबंधन देशी, परिपक्व स्नायुबंधन के समतुल्य नहीं होते हैं, वे नस्लें / स्नायुबंधन विकसित करने और पोषक तत्वों के जवाब में मूल ऊतकों के समान व्यवहार करने के लिए समानता देते हैं।"> 26, विकास कारक 10 , हार्मोन 25 , और व्यायाम 11 , 28. इस प्रकार, जब इन विट्रो मॉडल से व्यापक सामान्यीकरण करने से पहले सावधानी बरकरार रखी जाती है, तो आघात निर्माण परीक्षण के परिणाम प्रकट हो सकते हैं या किसी विशेष शारीरिक तंत्र को सूचित कर सकते हैं जो अन्यथा हो सकता है विवो में जांच करना असंभव
विस्तृत अनुप्रयोगों के साथ लचीला और गतिशील मॉडल के लिए वातानुकूलित सीरम के साथ फ़ीड मीडिया को पूरक
मानव सीरम मेटाबोलिम 4,500 यौगिकों का एक परिवेश है, जिसमें ग्लाइकोप्रोटीन, लिपोप्रोटीन, लिपिड डेरिवेटिव, ऊर्जा सबस्ट्रेट्स, मेटाबोलाइट्स, विटामिन, एंजाइम, हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, और बिल्डिंग ब्लॉकों / इंटरमीडिएट के बहुत सारे शामिल हैं, लेकिन इन तक सीमित नहीं है। 29 यौगिक कक्षाओं के अनुसार इंसुलिन सीरम मेटाबोलोम के आगे निरीक्षण 29 से पता चला हैइन विट्रो प्रयोगों में प्रयोगात्मक सीरम को एकीकृत करने के लाभ यही है, सीरम में ~ 4500 यौगिकों में से अधिकांश हाइड्रोफोबिक या लिपिड-व्युत्पन्न हैं, परिवहन / solubilization के लिए बाइंडिंग प्रोटीन के महत्व को रेखांकित करते हैं। यह प्रयोगात्मक रूप से अंतर्जात मिश्रित परिवहन गतिशीलता को पुनरावृत्त करता है, और इसलिए जैवउपलब्धता और परिसर-लक्ष्य बातचीत, लगभग असंभव होगी। इस प्रकार, प्रयोगात्मक सीरम यौगिकों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से प्रभावी है जो कि सुलभ बनाने, परिवहन, बाध्यकारी लक्ष्य और कार्रवाई की व्यवस्था के लिए सहायक अणुओं पर निर्भर होने के लिए जाना जाता है।
व्यायाम के स्वास्थ्य लाभों में हमारी प्रयोगशाला में लंबे समय तक रुचि है। व्यायाम पूरे शरीर में 12 विभिन्न प्रकार के ऊतकों में सेलुलर और अंग फ़ंक्शन में सुधार करता है, एक प्रभाव जिसके कारण विभिन्न कारकों (जैसे आईएल -6 13 , आईएल -15 14 , मेटोरिन-जैसी 15 ,Exosomes 16 , 17 ) कि प्रणालीगत संचलन में जारी कर रहे हैं। पोस्ट-व्यायाम जैव-रसायन संबंधी परिवेश, कंकाल की मांसपेशियों के व्यायाम-उत्तरदायी हार्मोनों के साथ-साथ उन कारकों को जारी करता है जो सक्रिय ग्रंथियों के सहानुभूति तंत्रिका तंत्र उत्तेजना के परिणाम के रूप में जारी होते हैं ( जैसे , अधिवृक्क ग्रंथि 18 और कॉरटेक्लामाइन के कारण अधिवृक्क ग्रंथि 18 , और विकास पूर्वकाल पिट्यूटरी से हार्मोन 1 9 ) हमने हाल ही में इंजीनियर-टिशू पर व्यायाम-प्रेरित बायोकेमिकल परिवेश के प्रभावों की जांच के लिए पूर्व और पोस्ट-व्यायाम सीरम के एक मॉडल का उपयोग किया था। 1 जबकि कई महत्वपूर्ण अभ्यास से संबंधित अनुसंधान प्रश्न रहते हैं, मॉडल इस तरह से सीमित नहीं है। उदाहरण के लिए, आहार या औषधीय हस्तक्षेप, या विभिन्न आयु समूहों या नैदानिक आबादी के बाद, पशु या मानव स्रोतों से सीरम प्राप्त किया जा सकता हैएस 30 इस तरह, ब्याज के बहिर्जात या अंतर्जात यौगिकों को सीरम और उपचार मीडिया में उपलब्ध होगा, जो जैव उपलब्ध मात्रा में होंगे और अंतर्जात परिवेश ( यानी , अधिक शारीरिक संदर्भ में) के साथ संगीत में लक्ष्य ऊतक के साथ बातचीत करेंगे। यह दृष्टिकोण गतिशील है क्योंकि यह अत्यधिक संभावना है कि दी गई हस्तक्षेप एक बहु-अंग (और बहु-परिसर) प्रभाव को लागू करेगा और इस प्रकार शारीरिक परिवेश को सह-संशोधित किया जाएगा हालांकि यह दृष्टिकोण कुछ चुनौतियों को प्रस्तुत करता है, क्योंकि कई सिस्टमिक जैव रासायनिक वैरिएबल एक साथ बदल जाते हैं, यह एक ऐसा दृष्टिकोण है जो विशुद्ध रूप से कम करने वाले प्रयोगात्मक पद्धति 31 , 32 की कमियों को दूर करने में मदद कर सकता है। एक साथ ली गई, वातानुकूलित सीरम को एक साथ टिट्यू इंजीनियर ( विट्रो बायोमिमेनेटिक ) ऊतक के साथ क्रियान्वित किया जा सकता है जिससे शरीर विज्ञान, पोषण और नैदानिक अनुसंधान प्रश्नों के लिए एक उपकरण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में इस ऊतक इंजीनियरिंग मॉडल 25 <का उपयोग किया है/ Sup> दूसरी आबादी, महिला एथलीटों को मॉडल करने के लिए, जो संयोजी ऊतक चोटों के जोखिम पर हैं: एसीएल की चोट की घटना लगभग 35 पुरुष प्रति पुरुषों की तुलना में लगभग पांच गुना अधिक है। चोटों में इस सेक्स-आधारित असमानता को कम करने की संभावित तंत्रिकाएं मासिक धर्म के निर्माण के माध्यम से महिला सेक्स हार्मोन, एस्ट्रोजेन के सांद्रता के साथ-साथ माहवारी चक्र के चरणों की सांद्रता पर ध्यान देते हैं। दिलचस्प बात यह है कि एस्ट्रोजन की उच्च मात्रा में जीन की अभिव्यक्ति और lysl oxidase की गतिविधि को रोक दिया गया था, लिजीमेंट्स और टण्डोन्स के कोलेजन मैट्रिक्स में लाइसिन-लाइसिन क्रॉस-लिंक बनाने के लिए जिम्मेदार प्राथमिक एंजाइम। महत्वपूर्ण रूप से, उच्च एस्ट्रोजेन (कूपिक चरण को अनुकरण करने के लिए) के 48 घंटे में कमी ने बांधों के कोलेजन घनत्व को बदलने के बिना अस्थिभंग का निर्माण किया। एक शारीरिक परिप्रेक्ष्य से, यह पता चलता है कि महिलाओं में अस्थिरता ढीली हो सकती है, कम से कम भाग में, कम हो सकती हैक्रॉस-लिंक गठन एक प्रयोगात्मक परिप्रेक्ष्य से, ये निष्कर्ष 25 3 डी निर्माण मॉडल की उपयोगिता को उजागर करते हैं, जो कि कार्यात्मक क्रॉस-लिंकिंग गतिविधि को जांचने की अनुमति देता है। क्लिनिकल परिप्रेक्ष्य से, यह मॉडल अब उन हस्तक्षेपों के लिए तेजी से स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जो लिगमेंट फ़ंक्शन के एस्ट्रोजन के नकारात्मक प्रभाव को रोक सकते हैं।
अंतिम शब्द
यहां हमने इन विट्रो टिशू मॉडल में 3 डी के रूप में इंजीनियर लिगमेंट्स और उनकी उपयोगिता के गठन के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रस्तुत की है। यह मॉडल कई प्रकार के उद्देश्यों के लिए अनुकूल है, सेल प्रकार में लचीलापन प्रदान करता है, हस्तक्षेप करता है, और ब्याज के परिणाम उपाय करता है। वातानुकूलित सीरम के साथ फ़ीड मीडिया का अनुपूरक एक शारीरिक संदर्भ जोड़ता है जो विविरो पर्यावरण में पारंपरिक रूप से प्राप्त नहीं किया जा सकता है, विवो फिजियोलॉजी के मॉडलिंग में सुधार कर सकता है। संक्षेप में, हम मानते हैं कि यह एक मोटे तौर पर लागू मोड हैभौतिक विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग दोनों क्षेत्रों को आगे बढ़ाने के लिए रोमांचक प्रभाव के साथ एल।
Disclosures
लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है
Acknowledgments
यह काम एनएसईआरसी पोस्टडोक्चरल फेलोशिप (डीडब्ल्यूडीडब्ल्यू), एआरसीएस फाउंडेशन छात्रवृत्ति (एएल), और यूसी डेविस कॉलेज ऑफ जैवोलॉजिकल साइंसेज अनुदान (केबी) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors |
| β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors |
| o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
| Falcon 35 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
| 1x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
| 100x antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
| Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
| 100x penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
| Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
| DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
| Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
| Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 - 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
| CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
| Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
| BD Vacutainer Red Plastic 10 mL | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
| Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
| Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| 6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C. |
| Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6 M |
| 4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
| Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
| trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
| Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
| Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
| Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |
References
- West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
- Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
- Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
- Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
- Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
- Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
- Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
- Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
- Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
- Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
- Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
- Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
- Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).
- Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
- Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
- Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
- Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
- Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
- Woessner, J. F. Jr The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
- Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
- Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
- Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
- Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
- Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
- Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
- Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
- Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
- Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists? J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
- Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
- Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
- Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).
