Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Behandling af ligamentkonstruktioner med træningskonditioneret serum: en translational tissue engineering model

Published: June 11, 2017 doi: 10.3791/55339
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3
1Department of Neurobiology, Physiology, and Behavior, University of California, Davis, 2Department of Physiology and Membrane Biology, University of California, Davis, 3Faculty of Kinesiology and Physical Education, University of Toronto

Summary

Vi præsenterer en model af ligamentvæv, hvor tredimensionelle konstruktioner behandles med det menneskelige træningskonditionerede serum og analyseres for kollagenindhold, funktion og cellulær biokemi.

Abstract

In vitro eksperimenter er essentielle for at forstå biologiske mekanismer; Imidlertid er kløften mellem monolagsvævskultur og humanfysiologi stor, og oversættelse af resultater er ofte dårlig. Således er der rig mulighed for alternative eksperimentelle tilgange. Her præsenterer vi en fremgangsmåde, hvor humane celler isoleres fra menneskelige forreste korsbåndsvævrester, udvides i kultur og bruges til at danne manipulerede ledbånd. Øvelse ændrer det biokemiske miljø i blodet, således at funktionen af ​​mange væv, organer og kropslige processer forbedres. I dette eksperiment blev ligamentkonstruktionskulturmedier suppleret med eksperimentelt humant serum, der er blevet "konditioneret" ved motion. Interventionen er således mere biologisk relevant, da et eksperimentelt væv udsættes for det fulde endogene biokemiske miljø, herunder bindingsproteiner og hjælpestoffer, der kan ændres i tandem med aktiviteten af ​​enUkendt agent af interesse. Efter behandling kan manipulerede ledbånd analyseres for mekanisk funktion, kollagenindhold, morfologi og cellulær biokemi. Samlet set er der fire store fordele i forhold til traditionelle monolagskulturer og dyremodeller, af den fysiologiske model af ligamentvæv, der præsenteres her. For det første er ligamentkonstruktioner tredimensionelle, hvilket giver mulighed for mekaniske egenskaber ( dvs. funktion) som ultimativ trækspænding, maksimal trækbelastning og modul, der skal kvantificeres. For det andet kan entesheden, grænsefladen mellem boney og sengeelementer, undersøges i detaljer og inden for funktionel sammenhæng. For det tredje gør forberedelsen af ​​medier med efter-motion-serum mulighed for at undersøge virkningerne af det øvelsesinducerede biokemiske miljø, som er ansvarligt for den brede vifte af sundhedsfordele ved motion, på en upartisk måde. Endelig fremmer denne eksperimentelle model videnskabelig forskning på en human og etisk måde ved at erstatte brugen afDyr, et kernemandat for de nationale institutter for sundhed, Center for sygdomsbekæmpelse, og Food and Drug Administration.

Introduction

Tendon og ledbåndskader er almindelige og kan have svækkende konsekvenser for normal mobilitet og livskvalitet. Kirurgisk indgreb er ofte nødvendig, men kan have begrænset og varieret succes 4 , 5 . Den nuværende forståelse af hvordan sener og ledbånd udvikler sig, modnes og reagerer på skade er ufuldstændige, og der er derfor behov for effektive forskningsmodeller for at give indsigt i udviklingen af ​​mere effektive behandlinger 5 . For at imødegå dette vidensforskel kan dyremodeller anvendes, men in vivo undersøgelser er i sagens natur komplekse med vanskeligheder med at kontrollere miljøet og direkte målrette indgreb til det tilsigtede væv. I modsætning hertil kan det eksperimentelle miljø let styres og overvåges in vitro med traditionel monolagscellekultur. Denne teknik kan imidlertid oversimplificere det kemiske og mekaniske miljø og kan derfor ikke genopbyggeSen in vivo opførsel af cellerne. Vævsteknik er i stand til at gifte sig med fordelene ved det komplekse in vivo miljø i dyremodeller med kontrol af in vitro- miljøet og giver et ekstra værktøj til at studere fysiologi. Derudover bevæbnet med en bedre forståelse af ligamentudvikling kan vævsteknik også give en kilde til graftvæv, når kirurgisk genopbygning er påkrævet 6 . Således validerer den her beskrevne metode et in vitro 3D-konstrueret væv, som kan anvendes til at studere ligamentfunktion og morfologi.

Fibrinbaserede sener eller ligamentkonstruktioner er blevet anvendt som en in vitro- model til at studere fysiologiske processer, herunder kollagenfibrillogenese 7 og senudvikling 8 såvel som translationelle anvendelser, hvor deres anvendelighed som transplantatvæv er blevet evalueret i en fårmodel af anterior cruCiate ligament (ACL) rekonstruktion 9 . Vores laboratorium har tidligere etableret en 3D-konstrueret ligamentmodel, der spænder over to børster, et calciumphosphatben-substitutionsmateriale, cementankre. Denne model kan med lethed underkastes forskellige eksperimentelle betingelser ved blot at supplere kulturmediet med biologiske faktorer 10 eller anvende mekanisk stimulering 11 . Det er vigtigt, at denne ben-til-ben-ligamentmodel giver mulighed for en dybdegående analyse af entesheden, grænsefladen mellem boney og sinuselementer, som er udsat for skade.

I undersøgelsen fremhævet 1 her for at præsentere denne metode var vi interesserede i effekten af ​​træningsfremkaldte ændringer i det biokemiske miljø på ligamentfunktionen. Øvelse forbedrer cellulær og organfunktion i en række forskellige væv i hele kroppen 2 , 3 , 12 , en virkning, der kan tilskrives frigivelsen af ​​forskellige kendte (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-lignende 15 , exosomer 16 , 17 ) og andre ukendte, biokemiske faktorer frigivet til systemisk cirkulation . Desuden er det biokemiske miljø efter træning beriget med træningsfølsomme hormoner, hvis frigivelse stimuleres af sympatisk nervesystemstimulering af sekretoriske kirtler ( f.eks . Cortisol og catecholaminer fra binyren 18 og væksthormon fra den forreste hypofyse 19 ). Imidlertid er det ikke muligt at differentiere virkningerne af den mekaniske stimulus af motion fra træningsfremkaldte biokemiske ændringer. Mens nogle undersøgelser har karakteriseret den forventede stigning i visse cirkulerende hormoner og cytokiner som reaktion på exercisE som nævnt ovenfor, er der for mange faktorer, både kendte og ukendte, til trofast at rekapitulere in vitro. Det vil sige at isolere nogle få faktorer til en in vitro- undersøgelse tager ikke tilstrækkeligt hensyn til kompleksiteten af ​​det biokemiske respons. I denne undersøgelse undersøgte vi, hvordan ændringer i det serum biokemiske miljø, som følge af motion, påvirker manipuleret ligamentfunktion. For at isolere virkningerne af de biokemiske forandringer opnåede vi serum fra menneskelige deltagere før og efter en kamp mod modstandsdygtighed og brugte den til at behandle 3D-manipulerede ledbånd dannet ved hjælp af human-anterior-korsbånds fibrometre. Ved hjælp af denne model kan vi opnå funktionelle data, herunder effekter på mekaniske egenskaber og kollagenindhold, samt kvantificere effekter på molekylær signalering.

Protocol

Følgende procedurer overholder en protokol, der blev godkendt af Institutional Review Board of University of California, Davis; Konsultere det lokale etiske bestyrelse inden begyndelsen af ​​undersøgelsen.

1. Isolér primære fibroblaster fra humane ACL-rester

BEMÆRK: Vedligehold sterilitet og udfør alle trin i et biologisk sikkerhedsskab (BSC).

  1. Indhent godkendelse fra det relevante etiske reviewskort til indsamling og brug af humane væv som beskrevet nedenfor.
  2. Forbered 5x antibiotikum / antimykotisk (ABAM) opløsning ved at fortynde 100x antibiotikum / antimykotisk opløsning i 1X phosphatbufret saltvand (PBS)
  3. Saml ACL vævsfragmenter i 5X ABAM opløsning i et 50 ml konisk rør, opbevar ved 4 ° C indtil fordøjelsestrin. Skær væv i mindre fragmenter med et knivblad om nødvendigt til en maksimal størrelse på 1 x 1 x 1 cm 3 .
    FORSIGTIG: Overhold lokale biohazardregler forKorrekt brug af biohazard materiale og dekontaminering og bortskaffelse af biohazard affald.
  4. Forbered et tilstrækkeligt volumen af ​​kollagenaseopløsning til nedsænkning af vævsfragmenterne. Dollbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 1x penicillin / streptomycin og 20% ​​føtalt bovint serum (FBS) og filter ved 0,22 μm opløses kollagenase type II (1 mg / ml).
  5. Skyl ACL væv 3 gange i PBS.
  6. Fordøjes væv. Overfør ACL væv til et nyt 50 ml konisk rør og tilsæt et tilstrækkeligt volumen af ​​collagenase opløsning til nedsænkning af vævet. Inkuber ved 37 ° C natten over (~ 17 timer).
  7. Inden fordøjelsesvarigheden er afsluttet, skal du forberede vækstmedier (GM) ved at supplere DMEM-højglucosemedier med 10% FBS og 100 U / ml penicillin.
  8. 15 minutter inden fordøjelsestiden er færdig, hvirvles det vævsholdige 50 ml rør 3 gange hver 5 min.
  9. Brug en 25 ml serologisk pipette, triturat det fordøjede væv kraftigt for at bryde tiSsue op længere og dislodge celler.
  10. Centrifuge ved 1500 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 10 ml GM.
  11. Gentag trin 1.8-1.9 tre gange.
  12. Efter den sidste centrifugering resuspenderes pelleten i 5-10 ml GM. Brug en lille prøve af cellesuspensionen til at udføre et celleantal med et hæmocytometer og vurdere celle-levedygtighed ved hjælp af Trypan Blue.
  13. Plader cellesuspensionen på 15 cm vævskulturplader ved en tæthed på 3-4 x 105 celler pr. Plade.
  14. Kultur til 70% sammenflydelse i en steril inkubator vedligeholdt ved 37 ° C og 5% CO2, ændring af GM hver tredje dag. Brug eller opbevar (se nedenfor) celler inden for 5 passager.
  15. Fryse celler til fremtidig brug.
    1. Trypsiniser celler ved 70% konfluens som følger. Aspirere medier og vaske celler med PBS. Tilsæt nok forvarmet (37 ° C) 0,05% trypsin til kun at dække bunden af ​​vævskulturplader. Placer plader i dyrkningsinkubAtor i ~ 5 minutter, indtil cellerne løsnes (kontroller celler flyder ved hjælp af et lysmikroskop). Brug en pipette til at samle celler og dispensere ind i et Falcon-rør.
    2. Centrifuger til pelletsceller og resuspender celler i DMEM højglucosemedier indeholdende 20% FBS og 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Aliquot cellesuspension i cryovials og afkøles ved -1 ° C / min i mindst 24 timer. Opbevar frosne cryovials i flydende nitrogen.

2. Forbered silikonebelagte plader

  1. Forbered 35 mm vævskulturplader: Fjern låg og læg åbne plader på en plan overflade.
  2. Bland silikone elastomer kit ifølge producentens anvisninger.
  3. Brug en 10 ml sprøjte til at dispensere ca. 2 ml pr. 35 mm plade.
  4. Lad siliconen hærde ved stuetemperatur i 2-3 dage.

3. Forbered Brushite cementankre

  1. I forvejen skal du forberede silikone-omvendte forme, der indeholder cylindriske viLls for ankerdannelse. Omvendte forme kan laves til specifikationerne for den ønskede ankerform og størrelse.
    1. Bestem den ønskede højde og diameter af det endelige anker. Denne protokol anvender en skræddersyet skimmel dannet af håndværkssilicone i en 35 mm vævskulturskål, hvori plastikcylindre med en diameter på ca. 3,25 mm blev anbragt, hvilket muliggjorde en endelig formhøjde på ca. 6,5 mm. Endelige ankermål er ca. 3-3,5 mm i højden og ca. 3,4 mm i diameter med 1,5 mm pin udragende fra bunden af ​​ankeret.
    2. Tilsæt uhærdet silikone til en 35 mm skål, i hvilken formen bliver lavet. Placer plastikflasker i overensstemmelse hermed.
      BEMÆRK: Plastflaskernes størrelse bestemmer diameteren af ​​de endelige ankre. Placeringen af ​​plastikflaskerne og den anvendte mængde silicone kan modificeres til fremstilling af ankre af forskellig højde. Tykkelsen mellem bunden af ​​brøndene i formen og bunden af ​​formen selv vil dEtermin hvor meget af stiften kan stikke ud fra bunden af ​​ankeret, så ankeret senere kan fastgøres sikkert i den silikonebelagte skål.
    3. Efter at have ladet siliconen hærde, skal du fjerne plastikflaskerne og fjerne formen fra 35 mm skålen.
  2. Forbered en 3,5 M orthophosphoric / 100 mM citronsyreopløsning. Opløs 0,961 g citronsyre i 11,5 ml orthophosphorsyre. Opløs opløsningens opløsning op til 50 ml med MilliQ vand. Opbevares ved stuetemperatur og beskyttes mod lys.
  3. Forbered støber: Placer en minutien pin i midten af ​​hver cylindrisk brønd i forme.
  4. Kombiner β-tricalciumphosphat og orthophosphoric / citronsyreopløsning ved en koncentration på 1 g / ml i en plastvægtbåd på is.
  5. Bland cementet kraftigt ved hjælp af en plastcelleskraber.
  6. Triturat cementet for at fortsætte blanding og pipette blanding i formen
  7. Centrifug den fyldte form i 1 min ved 2.250 x g.
  8. Tillad borstetscementankre til at indstille ved stuetemperatur natten over.
  9. Fjern ankre fra formen og pin to ankre 12 mm fra hinanden i hver silikonebelagt plade.
  10. Sterilisér pinnede plader ved at sprøjte med 70% ethanol, fylde både pladerne og lågene og placere dem i en BSC. Efter mindst 30 minutter, aspirer plader og udskift låg, opbevar i BSC, indtil det er nødvendigt.

4. få humant serum

  1. Sørg for, at godkendelse fra det relevante etiske reviewskort er opnået for denne protokol.
  2. Sørg for, at der er opnået skriftligt informeret samtykke fra mennesker til at deltage i en given intervention ( f.eks . Motion, mad eller stofindgreb), som vil påvirke ønskede ændringer i serum. Her beskriver vi samlingen i ro og 15 minutter efter modstandsøvelse.
  3. Ved hjælp af en trænet phlebotomist opnås en hvilende blodprøve fra en deltager ved venepunktur i en passende evakueret beholder. Indsamle en blodprøve efter 15 minutter efter at have deltagerne i den ønskede øvelsesprotokol. Som tidligere beskrevet 1 , brug motstandsøvelsesprotokollen i dette eksperiment til at stimulere et endogent biokemisk respons.
    1. Har deltagerne udført fem sæt benpress med et minuts hvile mellem sæt. Dernæst skal deltagerne udføre et sæt knæforlængelser og et sæt hamstringkrøller i træk uden hvile og gentag derefter back-to-back øvelserne tre gange med 1 min hvile mellem sæt.
  4. Lad blodet størkne før centrifugering ved 1500 xg i 10 minutter. Under sterile betingelser overføres serum til sterile rør til fremtidig medietilskud (serum lagret ved 4 ° C) og biokemisk analyse (en lille aliquot af serum opbevaret ved -20 ° C).

5. Form Engineered Ligaments

BEMÆRK: Udvid primært fiBroblaster og forberede silikone-coatede plader med pinnede børstetankere.

  1. Forbered reagenser:
    1. Forbered trombin. Opløs trombin opløses ved 200 U / ml i DMEM-højglucosemedium. Filtrer ved 0,22 μm, alikvot og opbevar ved -20 ° C.
    2. Forbered fibrinogen. Opløs fibrinogen opløses ved 20 mg / ml i DMEM-højglucosemedium. Inkuber i 3-4 timer i et 37 ° C vandbad, hvirvle hvert 30 min for at hjælpe opløsningen. Filter ved 0,22 μm (flere filtre kan være nødvendige), alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    3. Forbered aprotinin. Opløs aprotinin i 10 mg / ml i vand. Filtrer ved 0,22 μm, alikvot og opbevar ved -20 ° C.
    4. Forbered aminohexansyre. Opløs aminohexansyre ved 0,1 g / ml i vand. Filtrer ved 0,22 μm, alikvot og opbevar ved 4 ° C.
    5. Forbered ascorbinsyre. Opløs askorbinsyre i DMEM høj glukose medier i en koncentration på 50 mM. Filtrer ved 0,22 μm og opbevar ved 4 ° C.
      6. <Li> Forbered L-prolin. Opløs L-prolin i PBS i en koncentration på 50 mM. Filtrer ved 0,22 μm og opbevar ved 4 ° C.
    6. Forbered transformationsvækstfaktor-β1 (TGF-β1). Rekonstituer TGF-β1 ifølge producentens anvisninger i en koncentration på 10 μg / ml. Aliquot og opbevar ved -20 ° C.
  2. Bestem antallet af konstruktioner, der kræves til eksperimentet, og sørg for, at der er tilberedt tilstrækkeligt mange spindeplader. Både biologiske og tekniske replikater anbefales. I undersøgelsen 1, der fremhæves her, skal du bruge to eksemplarer af tekniske replikater og 12 biologiske replikater (serum fra 12 personer i hvile og efter træning).
    BEMÆRK: Udfør følgende trin under sterile forhold i en BSC.
  3. Udvid celler ved at dyrke i 15 cm plader til 70% konfluens. 2,5 x 105 celler kræves pr. Konstruktion.
  4. Trypsiniser celler og resuspenderer i GM i en koncentration på 3,67 x 105 celler / ml.
  5. Generer en master mix for antallet af konstruktioner, der kræves: For 1 konstruktion indeholder masterblandingen 681 μL cellesuspension (indeholdende 2,5 x 10 5 celler), 29 μL thrombin, 2 μl aprotinin og 2 μL aminohexansyre.
  6. Efter blanding af masterblandingen godt tilsættes 714 μL til hver stiftplade i et 'figur 8' mønster omkring børstet cementanker. Sørg for, at master mixen direkte kontakter siderne af forankringerne.
  7. Tryk let på hver plade forsigtigt for at fordele masterblandingen jævnt over pladen.
  8. Til en plade ad gangen tilføjes 286 μl fibrinogen dråbevist jævnt over en plade og glider pladen frem og tilbage og side om side over overfladen af ​​BSC for at distribuere fibrinogenet til dannelse af de celleindlejrede fibringeler . Fortsæt til næste plade.
  9. Anbring konstruktionerne i en steril inkubator vedligeholdt ved 37 ° C og 5% CO2 og inkuberI mindst 15 minutter for at tillade polymerisering af fibrinogenet.
  10. Forbered tilstrækkeligt fodermedium (FM) til 2 ml pr. Konstruktion. Supplement GM med 200 μM ascorbinsyre, 50 μM prolin og 5 ng / ml TGF-β1.
  11. Tilsæt 2 ml FM til at dække hver konstruktion. Kultur konstruktionerne i en steril inkubator opretholdt ved 37 ° C og 5% CO2 i i alt 14 dage eller til det ønskede endepunkt, forfriskning medierne hver anden dag med 2 ml FM

6. Trækstesting Engineered Ligaments

BEMÆRK: Trækprøvning blev udført ved hjælp af en specialbygget trækprøve i et PBS-bad; Omvendte støbte greb, der er koblet til krafttransduceren, fastholder børstelitcementankre på plads under testen.

  1. Bestem længden og bredden af ​​ligamentkonstruktionerne ved hjælp af digitale kalipre; Beregne tværsnitsarealet af vævet.
  2. Løsne ligamentkonstruktionen fra pladen og læg ankre iOmvendte støbte greb, hvilket sikrer at konstruktionen er nedsænket i PBS.
  3. Juster afstanden mellem grebene, indstil længden af ​​konstruktionen til dens indledende længde.
  4. Start testen: Træk konstruktionen til svigt ved en belastning på 0,4 mm / s (eller ~ 3% / s).
  5. Efter afslutning af testen behandles vævsresterne for kollagenindhold (se afsnit 7).
  6. Ud fra de resulterende belastningsdeformationsdata beregner stress-stamdata og kvantificerer mekaniske egenskaber af interesse; For eksempel maksimal trækbelastning, maksimal trækstyrke og modul ( dvs. elastisk egenskab over en lineær region af stress-belastningskurven).

7. Kvantificering af kollagenindholdet af konstruerede ligamenter

  1. Fjern manipulerede ledbånd fra borstetcementankre og tør ved 120 ° C i 25 minutter.
  2. Bestem den tørre masse af konstruktioner og anbring i individuelle 1,5 ml rør. Tørre konstruktioner kan opbevares ved stuetemperaturIndtil videre behandling.
  3. Til hver konstruktion tilsættes 200 μl 6 M HCI. Kog ved 120 ° C i en varmeblok i 2 timer i en dampplade.
    FORSIGTIG: HCI er stærkt ætsende og sur, det anbefales at anvende kogesikker / sikker låsrør eller anden metode til sikring af rør.
  4. Centrifuger rørene kort for at opsamle væske, og lad dem være uafskårne for at fordampe ved 120 ° C i en varmeblok i 1,5 time i en dampplade.
  5. Resuspender den resulterende pellet i 200 μl hydroxyprolinpuffer. Opbevares ved -20 ° C indtil det er nødvendigt.
    1. Forbered hydroxyprolinpuffer. I 300 ml vand tilsættes 16,6 g citronsyre, 4 ml eddikesyre, 11,4 g NaOH og omrøres indtil opløsning. PH til 6-6,5 og bringe volumen op til 500 ml. Tilsæt 250 μL toluen som konserveringsmiddel og opbevar ved 4 ° C beskyttet mod lys.
  6. Forbered reagenser.
    1. Forbered trans-4-hydroxy-L-prolin. Opløs i vand for at lave en 4 mg / ml opløsning.
      2. <Li> Forbered chloramin-T. Opløs i vand for at gøre en 14,1 mg / ml opløsning.
    2. Forbered aldehyd-perchlorat. Opløs 1,5 g 4-dimethylaminobenzaldehyd i 6 ml 1-propanol, 2,6 ml perchlorinsyre (FORSIGTIG: ætsende, stærk oxidator, brug passende forholdsregler) og 0,5 ml vand.
  7. I et sæt nye 1,5 ml rør fortyndes en prøve af hver resuspenderet pellet i hydroxyprolinpuffer til et volumen på 200 μl.
    BEMÆRK: Fortyndinger kan variere fra 1: 4 til 1:50 af prøven: puffer afhængig af det forventede kollagenindhold i prøven; Det kan derfor være nødvendigt med en prøve- og fejlprøvning for at bestemme en fortyndingsfaktor, der passer til det givne stikprøve (dvs. placere prøverne mod midten af ​​standardkurven).
  8. Forbered hydroxyprolinestandarder. Fortynd hydroxyprolin i hydroxyprolinpuffer (se afsnit 7.5.1) til 80 μg / ml. Udfør serielle fortyndinger for at gøre 6-8 200 μL standarder mellem 0-20 μg / mL.
  9. Tilsæt 150 μl 14,1 mg /Ml chloramin T opløsning til hver standard og fortyndet prøve. Vortex og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
  10. Tilsæt 150 μL aldehyd-perchloratopløsning til hver prøve og fortyndet prøve. Vortex og inkuber i en varmeblok ved 60 ° C i 15 min. Bortskaf den overskydende aldehyd-perchloratopløsning som farligt affald i henhold til lokale bestemmelser (indeholder perchlorinsyre).
  11. Tillad, at standarder og prøver afkøles, før alikvotering af 200 μl af hver, i to eksemplarer, til 96-brøndsplader.
  12. Læs plade ved 550 nm i et spektrofotometer. Bortskaf plade og resterende mængde i 1,5 ml rør som farligt affald i henhold til lokale bestemmelser (indeholder perchlorinsyre).
  13. Beregning af total kollagen og kollagen fraktion.
    1. Konverter absorbansværdien for hver prøve til mikrogram hydroxyprolin ved hjælp af hydroxyprolin standardkurven.
    2. Multiplicer hver brønd med 2,5 for at beregne mængden af ​​hydroxyprolin iDen fortyndede prøve. Husk, at kun 200 af den 500 μl samlede blanding (200 μl fortyndet prøve + 150 μl chloramin T +150 μL AP opløsning) tilsættes til hver prøvebrønd.
    3. Multipliceres med fortyndingsfaktor (afsnit 7.7) for at beregne mængden af ​​hydroxyprolin i originalprøven.
    4. Opdel med 0,137 for at beregne mængden af ​​kollagen (forudsætter at kollagen indeholder 13,7% hydroxyprolin 20 ).
      BEMÆRK: Flydende hydroxyprolin-overflod i kollagen varierer lidt på tværs af væv og pattedyrarter; For eksempel indeholder akillesænder med svin og får 13,5 og 13,7% (hydroxyprolinmasse / tørvævsmasse) henholdsvis 21 . Brug her 13,7% til at estimere procent hydroxyprolin i collagen, som bruges til at beregne collagenindholdet i en vævsprøve under anvendelse af følgende ligning:
      Ligning 1
    5. Opdel efter tørmassen for at beregne collagen fraCtion og konverter til en procentdel.
      Ligning 2

8. Kvantificering af molekylære endepunkter

BEMÆRK: Udover de primære resultater af trækprøvning og kollagenindhold kan molekylære endepunkter måles på 2D eller 3D-væv for at tilføje mekanistisk indsigt. Bioassays kan anvendes til at bestemme molekylære endepunkter (se følgende afsnit nedenfor for konteksten Virkningen af ​​serumemiljøet efter udøvelse af in vitro- ligamentfunktionen).

  1. Til 3D-væv:
    1. Forbered konstruktioner som i trin 5 ovenfor.
    2. Efter konstruktionsbehandling / intervention, snapfrysekonstruktioner i flydende nitrogen.
    3. Ved hjælp af en mørtel og pestle afkølet på tøris, konstruerer grind i et pulver. Fortsæt i trin 8.4 / 5).
  2. Til 2D væv:
    1. Kultur humane ACL fibroblaster til sammenflydelse i en mundOlayer i 6-brøndsplader indeholdende DMEM.
    2. Aspirer DMEM og anbring behandlingsmedier i overensstemmelse med din forsøgsstrategi ( f.eks . Tidskurs eller dosisresponsforsøg).
    3. Aspirer behandlingsmedier og vask celler med PBS.
    4. Skraber cellerne op for at indsamle ved hjælp af en passende ekstraktionsbuffer / reagens (se næste).
  3. Proteinekspressionanalyse: Anvend en cytosolisk ekstraktionsbuffer ( f.eks . 250 mM saccharose, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM MgCl2 og protease / phosphataseinhibitor cocktail) for at opnå proteinlysater. Udfør proteinkoncentrationsassay og fortsæt analysen ifølge standard western blot-procedurer.
  4. Genekspression analyse: Isolér totalt RNA ved hjælp af 500 μL RNA isolationsreagens i henhold til producentens anvisninger for at opnå høj kvalitet RNA. Udfør reverse-transkription og realtids kvantitativ PCR analyse i overensstemmelse med standardprocedurer.
  5. DNA isolering: Isolere og kvantificere gEnomisk DNA ved anvendelse af DNA-isolationsreagens i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kvantificer DNA-koncentration ved anvendelse af et spektrofotometer til måling af prøveabsorbansen ved 260 nm.

Representative Results

Oversigt over konstrueret ligamentdannelse og eksperimentel intervention

Figur 1 viser en oversigt over dannelsen af ​​konstruerede ledbånd. Brushitcement, et knoglesubstitutionsmateriale 22 fremstilles ved at kombinere en orthophosphorsyre / citronsyreopløsning med p-tricalciumphosphat i cylindriske brønde. Alternativt, hvis ikke direkte måling af vævs mekaniske funktion, kan 3-0 silkesuturer anvendes som ankre i dannelsen af ​​et væv. Disse er fastgjort 12 mm fra hinanden i silicone-belagte 35 mm skåle og steriliseret ved blødning i 70% ethanol. Fibroblaster isoleres fra forreste korsbåndsrester opnået under ACL-rekonstruktionskirurgi. Efter ekspansion indkapsles 2,5 x 10 5 celler i en fibrin gel dannet i den børstet cement anker-spids skål. Efter dannelse, ligament constrUcts kan undersøges for ændringer i mekaniske egenskaber, collagenindhold, celleproliferation, genekspression, proteinniveauer og vævsmorfologi.

Gennem hele kulturen samler cellerne fibrin-gelen og danner et lineært væv mellem de to ankre ( figur 2A ). Efter 1-2 dage i dyrkning har cellerne bundet til fibrin-gel-, forlængede celleprocesser og begyndt at udøve trækkraft ( figur 2B ). Da fibrin-gelen kontraheres af trækkraft og nedbrydes af cellulære enzymer, genereres spænding mellem de to ankerpunkter og vores celler ligger parallelt med denne akse ( figur 2B ) og begynder at deponere collagen. Efter 4-5 dage har konstruktionerne indgået omkring ankre danner et lineært cylindrisk væv ( figur 2A ; på dette tidspunkt kan eksterne stimuli påføres systemetEntion på dette tidspunkt undgår at forstyrre den lineære vævsdannelsesproces). Interventioner kan bestå i at supplere kulturmedierne med humant eller dyre serum efter en given intervention, eksogene cytokiner og vækstfaktorer ved anvendelse af mekanisk stimulering eller ændring af andre miljøfaktorer såsom iltspænding. Ved anvendelse af vækstmedier (DMEM med 10% FBS og 100 U / ml penicillin) suppleret med 200 μM ascorbinsyre, 50 μM L-prolin og 5 ng / ml TGF-β1 har vi fastslået, at celleproliferation fortsætter i løbet af en 2 ugers kultur Periode ( figur 2C ) og i virkeligheden afslører lysmikroskopi et tæt væv indeholdende højtjusterede celler ved 14 dages dyrkning ( figur 2B ).

Vurdering af konstruerede ledbånd

I slutningen af ​​kulturperioden kan manipulerede ledbånd bedømmes i en sortY af måder. En stor fordel ved dette system er evnen til at bestemme funktionelle ændringer i vævet via mekanisk afprøvning, en vigtig vurdering givet den mekaniske rolle af nativ ligament. Uniaxial trækprøvning kan anvendes til at måle mekaniske egenskaber, herunder belastning til fiasko, ultimativ trækstyrke og Youngs modul. Viskoelastiske egenskaber kan også måles med stress afslapning og krybprøver. Figur 3A viser et konstrueret ligament, der holdes i omvendt støbte greb i en specialbygget uniaxial tensile tester. Det rigtige greb er fastgjort til en kraft transducer for at måle belastningen over ligamentet som vævet er anstrengt for fiasko. Figur 3B viser et repræsentativt spændingsstamplot for en test til fiasko. Efter at have gennemgået mekanisk afprøvning kan de samme konstruktioner tørres og forarbejdes til et hydroxyprolinassay 23 for at vurdere total kollagenindhold såvel som andre biocheMiske analyser. Med et tilstrækkeligt antal yderligere prøver pr. Tilstand kan en grundig undersøgelse af en eksperimentel indgriben udføres, herunder dens virkninger på celleproliferation, gen- og proteinekspression og histologisk morfologi. Mens 14 dage er et typisk endepunkt for vores studier, fortsætter de konstruerede ledbånd i deres mekaniske egenskaber og kollagenindhold gennem 28 dages dyrkning som vist i figur 3C og kan overleve i mindst 3 måneder i kultur 24 .

Donorvariation er en vigtig overvejelse for eksperimentel repeterbarhed. Figur 4 viser et repræsentativt forsøg rapporteret af Lee et al. 25 sammenligne 7 forskellige ACL-donorer (n = 3 mænd og n = 4 hun), der demonstrerer typiske træk egenskaber og kollagenindhold efter en 2 ugers kultur i den tidligere beskrevne Suppleret vækstmedie. Ved anvendelse af celler fra lignende ACL-samlinger, donorens alder, tid efter skade, køn mv. Viser de konstruerede ligamenter lav variabilitet mellem donorer og lignende egenskaber mellem mandlige og kvindelige donorer med undtagelse af forskellen i kollagenfraktion. I ovennævnte undersøgelse blev manipulerede ledbånd anvendt som en in vitro- model til at undersøge, hvorfor kvinder har en signifikant større risiko for ACL-skade end mænd og demonstreret, at ACL-fibroblaster isoleret fra kvindelige donorer ikke i sig selv danner svagere og mindre kollagenholdige ledbånd 25 .

Virkningen af ​​serummiljøet efter udøvelse af in vitro- ligamentfunktionen

Vi har tidligere vist evne til manipulerede ledbånd til at blive anvendt til at sonde fysiologiske processer 1 ,Ss = "xref"> 25. I det følgende repræsentative forsøg som rapporteret af West et al. 1 , fastslog vi de biokemiske virkninger af motion på ligamentfunktion og fremhæver metoden og fundene her. Vi dannede manipulerede ledbånd ved hjælp af humane ACL-celler og påbegyndte en intervention på kulturdag 7, der bestod af kulturmedier, der var konditioneret med humant serum samlet før eller efter øvelse. Kort fortalt rekrutterede vi sunde unge mandlige deltagere og indsamlede blodprøver før og efter en akut modstandsøvelse, der øger cirkulerende hormoner og cytokiner, herunder humant væksthormon (GH). Humant serum blev isoleret fra præ- og post-øvelse blodprøver og anvendt i stedet for føtalt bovint serum i dyrkningsmedierne i den anden uge af manipuleret ligamentkultur ( Figur 5A ). Præ- og efter-øvelse serumprøver blev analyseret under anvendelse af ELISA for ændringer i GH og insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF-1), denHvis koncentration kan ændres ved træning ( figur 5B ). Disse oplysninger blev brugt til at korrelere serumvirkninger på de konstruerede ledbånd med ændringer i serum som reaktion på motion. Efter en 14 dages dyrkningsperiode blev ligamentkonstruktionerne evalueret under anvendelse af mekanisk afprøvning og en hydroxyprolinbestemmelse af kollagenindholdet og påvist en signifikant forøgelse i både maksimal trækbelastning og kollagenindhold som reaktion på efterøvelsesserumet. Med henblik på at vurdere om denne virkning var relateret til øvelsesinducerede udslip af GH eller IGF-1, blev manipulerede ledbånd dannet i et separat forsøg og behandlet med et dosisrespons af enten humant rekombinant GH eller IGF-1. Interessant nok øgede gradvis stigende rekombinant GH-koncentration i dyrkningsmediet ikke kollagenindholdet ( Figur 5D -i) eller mekanisk, mens serum GH steg i blodet ( Figur 5B -i).Egenskaber (data ikke vist) i konstruerede ledbånd. I kontrast forhøjede serum-IGF-1-niveauerne ikke efter træning, men et dosisresponsforsøg viste, at stigende niveauer i kulturmedierne forbedrede kollagenindholdet af ligamentkonstruktioner ( figur 4D- iii). Således medens øvelse resulterede i robuste stigninger i efter-motion-GH, hævder dosisresponseksperimentet, der anvender rhGH, tvivl om, hvorvidt GH er direkte ansvarlig for den fænotypiske forbedring af de manipulerede ledbånd (i det mindste gør 22 kDa isoformen alene ikke Synes at være ansvarlig). Omvendt, mens serum-IGF-1 ikke blev ændret efter 15 minutter efter øvelsen, viste testen rhIGF-1 over en bred vifte af koncentrationer, at IGF-1 er i stand til at forbedre kollagenindholdet; Det skal imidlertid bemærkes, at stigende rhIGF-1 koncentrationer gennem en rækkevidde, som estimerede fysiologiske niveauer ikke signifikant øger kollagenindholdet. Således er den unikke post-motion serum enviroNment var vigtig i forhold til forbedring af mekanik og kollagen af ​​manipulerede ledbånd.

I undersøgelsen fremhævet her 1 var volumenet af forsøgsserum begrænset på grund af etiske overvejelser; Så blev kortvarige 2D bioassays, som havde lavere serumkrav, anvendt til yderligere at sonde de molekylære mekanismer, der var ansvarlige for stigningen i kollagen, der blev observeret. ACL-fibroblaster blev dyrket til sammenflydning i 6-brøndsplader og behandlet i 1 time med hvile eller efterøvelse serum og sammenlignet med dosisresponser af rekombinant GH, IGF-1, TGF-β1 og aktiveringen af ​​mål i PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2 og Smad signalveje blev bestemt. I nærvær af serum efter udøvelse viste PI3K / mTORC1 og ERK1 / 2-bane større aktivering som vurderet ved phosphorylering af henholdsvis S6K ( Figur 5D- i) og ERK1 / 2 ( Figur 5D -ii).Sammenlignet med hormon- og cytokin-dosisresponset, mens GH havde en lille positiv effekt på mTOR-signalering ( Figur 5D- i) og IGF-1 viste en positiv effekt ved den laveste dosis, blev de tre behandlinger af GH, IGF-1 og TGF -P1 tegnede ikke for stigningen i PI3K / mTORC1 og ERK1 / 2 signalering. Tværtimod antyder vores 3D-konstruerede ligamentmodel og 2D bioassay data, at serummiljøet efter træning er i stand til at forbedre den konstruerede ligamentfunktion og kollagenindholdet ved aktivering af PI3K / mTORC1 og ERK1 / 2-veje.

Sammenfattende kunne vi ved hjælp af en manipuleret ligamentmodel kombineret med træningskonditioneret serum i) undersøge virkningen af ​​serummiljø efter udøvelse på manipuleret ligamentfunktion og kollagen, ii) korrelere ændringer i ligamentfænotype med ændringer i serumhormonkoncentration, Med det formål at bestemme hvilke ændringer i serum der førte til changEs i manipulerede ledbånd og iii) yderligere omfanget af arbejdet ved at anvende 2D bioassays til at sonde molekylære mål i det serum biokemiske miljø for at bestemme molekylære mekanismer, der aktiveres af post-motion serum, der fører til forbedringer i ligamentfunktionen.

figur 1
Figur 1: Oversigt over dannelsen og brugen af ​​manipulerede ledbånd. Brushite cementankere fremstilles og fastgøres til silikonebelagte plader. Primære fibroblaster isoleres og ekspanderes fra ACL rester. Konstruerede ledbånd dannes ved indkapsling af fibroblaster i en fibringel omkring to børstelitcementankre. Bearbejdede ledbånd dyrkes og behandles med det specifikke kemiske eller mekaniske ( f.eks . Via en bioreaktor) stimuli, der ønskes. På det ønskede endepunkt kan manipulerede ledbånd opsamles og vurderes for mekanikL egenskaber, genekspression, kollagenindhold, proteinekspression og histologi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2. Primære ligamentfibroblaster danner et fibrinbaseret ben-til-ben-konstrueret ligament, der strækker sig over to børstelitcementankre. ( A ) Over tid sammentrækker fibroblaster fibringelen omkring borstetcementankerne, der danner et lineært væv. ( B ) I de første tre dage binder cellerne sig til fibrin-gelen og udøver trækkraft, idet cellerne tilpasses med konstruktionens lange akse. I løbet af 14 dage danner cellerne et stærkt justeret væv. Målestang = 160 μm. ( C ) DNA-indholdet af de konstruerede ledbånd fortsætter med at øge oVer 14 dage i kultur som cellerne proliferere. Data præsenteres som middel ± SD med n = 3-4 konstruktioner pr. Gruppe. grupper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Konstruerede ligamentmekaniske egenskaber og kollagenindhold forbedres over tid. ( A ) Ligamentkonstruktioner testes ensidigt i træk for at bestemme virkningen af ​​en given intervention på ligamentfunktionen. Som vist viser to omvendte, 3D-trykte greb gensidigt formede ankre, der er broet af den konstruerede senge. Ankre er koblet til en stepper motor og kraftoverføreren til at generere stress / belastningskurver af det testede væv, hvilket gør det muligt at bestemme mekaniske egenskaber. ( B </ Strong>) Repræsentativ stress-belastningskurve fra en konstrueret ligament anstrengt til fiasko. I løbet af 28 dage fortsætter med at forbedre ( C ) ultimativ trækkraft (UTS), ( D ) maksimal trækbelastning (MTL), ( E ) Youngs modulus og ( F ) kollagenfraktion. Data præsenteres som middel ± SD med n = 5 konstruktioner pr. Gruppe. * Angiver signifikant forskel fra alle andre grupper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Konstruerede ledbånd kan vurderes for funktionalitet og biokemisk indhold, der viser lav donorvariabilitet. Konstruerede ledbånd blev dannet 7 forskellige donorer (n = 3 mand, n = 4 hun). Efter 2 uger oF) blev de vurderet for forskelle i ( A ) maksimal trækbelastning, ( B ) ultimativ trækstyrke (UTS), ( C ) Youngs modulus, ( D ) tværsnitsareal (CSA), ( E ) totalt kollagenindhold pr. Konstruere og ( F ) kollagen som en brøkdel af tør masse. Data præsenteres som gennemsnit ± SD og statistisk signifikans var med Studentens t-test. * Angiver signifikant forskel fra andre grupper (p <0,05). Figur tilpasset fra Lee et al. 25 Klik venligst her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5. Konstruerede ledbånd demonstrerer mekaniske og biokemiske ændringer som reaktion på bioloGiske interventioner. ( A ) Serum blev isoleret fra bloddragninger indsamlet fra forsøgspersoner (RestTx) og post-motion (ExTx) og anvendt til behandling af manipulerede ledbånd i den anden uge af kulturen. ( B ) (i) Humant væksthormon (GH) og (ii) insulinlignende vækstfaktor (IGF) -1 niveauer i resten og øvelsesserum blev kvantificeret gennem ELISA. ( C ) Konstruerede ledbånd behandlet med ExTx viste forbedret (i) kollagenindhold og (ii) maksimal trækbelastning. Statistisk betydning af parret sammenligninger (RestTx og ExTx) blev analyseret ved en t-test med signifikansniveau sat til p <0,05. ( D ) En dosisrespons af (i) GH og (ii) IGF-1 blev anvendt til at bestemme mulige bidrag af disse faktorer til ændringerne i kollagenindhold på grund af ExTx. E) 2D bioassays blev anvendt til at sammenligne virkningerne af stigende doser af GH, RestTx og ExTx på molekylære signalmål, såsom phosphoryleringen af ​​(i) S6K Thr389 og (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Statistisk sammenligning af mere end to eksperimentelle grupper blev udført ved anvendelse af ANOVA og Tukey's HSD. Data præsenteres som præsenteret som middel ± SD. * Angiver en signifikant forskel fra kontrol (p <0,05) og § indikerer signifikant forskel fra 150 ng / mL og 300 ng / ml IGF-1. Figur tilpasset fra West et al. 1 Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Det nuværende manuskript beskriver en model af ligamentvæv, som er en nyttig forsøgsplatform for efterforskere med et bredt spektrum af forskningsemner, fra vævsudvikling til translationelle / kliniske spørgsmål. Den konstruerede ligamentmodel, der beskrives her, er baseret på en alsidig protokol, som kan tilpasses på forskellige punkter i hele arbejdsprocessen ( Figur 1 og Diskussionsafdeling ). Endvidere kan den iboende reduktionstype af in vitro- miljøet bringes nærmere til det fysiologiske område ved at supplere fodermedier med konditioneret humant eller dyre serum.

Konstruktioner kan dannes under anvendelse af fibroblaster fra en række forskellige kilder
Mens de metodologier og repræsentative resultater, der er vist her, er baseret på anvendelsen af ​​primære ACL-fibroblaster, kan celleisoleringsprotokollen justeres til indsamling af andre typer af primære fibroblaster. Som beskrevetI figur 4 viser manipulerede ledbånd dannet med primære celler isoleret fra unge humane donorer lav donorvariabilitet. Primære celler er begrænset af indledende isolering og passagebegrænsning; Brugen af ​​cellelinier kan forbedre reproducerbarheden af ​​forsøgene. Anvendelsen af ​​andre celletyper kan kræve modifikationer i cellekulturmedier og fibringelformulering. For eksempel har vi observeret, at humane mesenkymale stamceller (MSC'er) ikke er i stand til at danne lineære væv mellem pensitcementcementankrene i løbet af 2 uger, mens heste overlegen digitale flexor tendon fibroblaster, hestbenmargstromaceller, kyllingembryonale senebenfibblaster , Og murine C3H10T1 / 2 MSC'er kontraherer hurtigt og fordøjer fibringelen til dannelse af et lineært væv (upublicerede observationer). Denne kontrast kan være en konsekvens af forskelle i cellekontraktilitet, proliferation og fibrinolytisk enzymproduktion.

Anvendelse af kemikalierOg mekanisk stimulering
I den her beskrevne fremgangsmåde danner fibrinbaseret væv omkring borstelitcementankre, hvilket tillader anvendelse af mekanisk stimulering via en strækbioreaktor 11 såvel som til endepunktstræksprøvning. Tilstedeværelsen af ​​brushite cement-blødt vævsinterface (enthesis) giver også mulighed for yderligere undersøgelse og forbedring 22 , 26 (se afsnittet Kliniske applikationer nedenfor). I dette in vitro- miljø kan bidraget fra kemiske og mekaniske faktorer lettere identificeres; Et eksempel på dette er vist i figur 5 , hvorved effekten af ​​det post-øvende serummiljø blev skilt fra de mekaniske stimuli af motion. Pilotundersøgelser kan være nødvendige for at bestemme tidsrammen for forsøgsinterventioner, sammensætning af behandlinger og passende endepunkter for at forvente en observerbar ændring. foFor eksempel i undersøgelsen efter udøvelse af serum 1 blev længden af ​​forsøgsbehandling begrænset af forsyningen af ​​serum anvendt til at supplere medier, hvorfra konstruktioner blev fodret hver anden dag. I løbet af den anden kulturuge blev der desuden suppleret dyrkningsmedier med hvile eller efterøvelse serum med ascorbinsyre og L-prolin bibeholdt, mens TGF-β1 blev fjernet. TGF-β1 er en kendt profibrotisk vækstfaktor, som øges i serum efter øvelse 27 . For at undgå at forhindre TGF-β1-relaterede virkninger af post-motion-serumet blev dette cytokin ikke bibeholdt i dyrkningsmediet.

Denne konstruerede ligamentmodel kan også bruges til at teste effekten af ​​mekanisk strækning. Ved at konstruere omvendt modellerede greb til at holde penselt cement ankerendene (svarende til den uniaxiale trækstester, der er vist i figur 1 ), kan strækbioreaktorer være designet til at rumme eng Inerede ledbånd. Vores laboratorium har tidligere brugt denne model til at undersøge det molekylære signalrespons af manipulerede ledbånd til uniaxial trækspænding i en skræddersyet bioreaktor 11, som vil give en bedre forståelse for det rationelle design af et in vitro strækparadigme eller endog potentielt in vivo Stretch / aktivitet / terapeutiske applikationer.

Vurdering af konstruerede ledbånd
Som med traditionel monolagskultur kan 3D-konstruktioner analyseres for gen / proteinekspression; Desuden giver deres 3D-morfologi mulighed for at vurdere funktionelle og morfologiske ændringer, og konstruktioner kan opretholdes i kultur til langsigtede studier ( figur 3 ). Mens manipulerede ledbånd ikke er ækvivalente med native, modne ledbånd, har de lighed med at udvikle sener / ledbånd og opfører sig på samme måde som nativt væv som reaktion på næringsstoffer"> 26, vækstfaktorer 10 , hormoner 25 og øvelse 11 , 28. Selvom forsigtighed er berettiget, inden der foretages brede generaliseringer fra en hvilken som helst in vitro model, kan resultater fra ligamentkonstruktionstest muligvis afsløre eller oplyse en bestemt fysiologisk mekanisme, som ellers kunne være Umuligt at undersøge in vivo.

Suppler fodermedier med konditioneret serum til en fleksibel og dynamisk model med brede anvendelser
Det humane serummetabolom er et miljø med ~ 4.500 forbindelser, herunder, men ikke begrænset til, glycoproteiner, lipoproteiner, lipidderivater, energisubstrater, metabolitter, vitaminer, enzymer, hormoner, neurotransmittere og en overflod af byggesten / mellemprodukter. 29 Yderligere undersøgelse af det humane serummetabolom ifølge forbindelsesklasser 29 afslører additiOnal fordele ved at integrere eksperimentelt serum i in vitro eksperimenter. Det vil sige, at størstedelen af ​​de ~ 4500 forbindelser i serum er hydrofobe eller lipidafledte, hvilket understreger vigtigheden af ​​bindende proteiner til transport / solubilisering. Det følger heraf, at eksperimentelt rekapitulerende endogene forbindelser transportdynamik, og dermed biotilgængelighed og sammensatte mål-interaktioner, ville være næsten umulige. Eksperimentelt serum er således særligt effektivt til undersøgelse af forbindelser, som er kendt for at afhænge af tilbehørsmolekyler til opløselighed, transport, målbinding og virkningsmekanisme.

Vores laboratorium har en langvarig interesse for de sundhedsmæssige fordele ved motion. Øvelse forbedrer cellulær og organfunktion i en række forskellige væv i hele kroppen 12 , en virkning, som kan tilskrives en række faktorer (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-lignende 15 ,Exosomer 16 , 17 ), der frigives til systemisk cirkulation. Det biokemiske miljø efter træning afspejler faktorer, der frigives både fra kontraherende skelettmuskulære træningsresponsive hormoner samt faktorer, der frigives som følge af sympatisk nervesystemstimulering af sekretoriske kirtler ( f.eks . Cortcholaminer og catecholaminer fra binyren 18 og vækst Hormon fra den forreste hypofyse 19 ). Vi har for nylig brugt en model af præ- og post-motion serum til at undersøge virkningerne af det motion-inducerede biokemiske miljø på manipuleret væv. 1 Mens mange vigtige øvelsesrelaterede forskningsspørgsmål forbliver, er modellen på ingen måde begrænset på denne måde. For eksempel kan serum opnås enten fra dyr eller mennesker, efter diæt eller farmakologisk intervention eller fra forskellige aldersgrupper eller klinisk populationS 30 . På denne måde vil eksogene eller endogene forbindelser af interesse være til stede i serum og behandlingsmedier i biotilgængelige mængder og vil interagere med målvævet i samspil med det endogene miljø ( dvs. i en mere fysiologisk sammenhæng). Denne fremgangsmåde er dynamisk, da det er højst sandsynligt, at en given intervention vil udøve en multi-organ (og multi-compound) effekt, og således vil det fysiologiske miljø blive co-modificeret. Selvom denne tilgang præsenterer visse udfordringer, da flere systemiske biokemiske variable ændres samtidigt, er det en fremgangsmåde, der kan hjælpe med at overvinde ulemperne ved rent reduktionsistisk eksperimentel metode 31 , 32 . Tværtimod kan implementering af konditioneret serum sammen med et vævsmonteret ( in vitro biomimetisk ) væv anvendes som et redskab til fysiologi, ernæring og kliniske forskningsspørgsmål.

Den tissue engineering model, der præsenteres her, kan bruges til at undersøge anatomiske og kliniske forsknings spørgsmål, som traditionelle in vitro modeller ikke kan. Et ligament eller en senge in vivo indeholder en soft-to-hard tissue-overgangsregion kaldet enthesis. Induktionen, som er sårbar over for mekanisk stressrelateret skade 33 , kan studeres i tværsnit via histokemiske og elektronmikroskopiteknikker 22 , 26 . Denne unikke grænseflade er dobbelt vigtig for dem med lav eller begrænset mobilitet, da fysisk inaktivitet vanskeliggør bindevævets evne til at overføre belastning til regioner med lav til høj overensstemmelse 34 , hvilket resulterer i et generelt fald i vævsoverensstemmelse og øget risiko for skade.

Vores laboratorium har for nylig brugt denne tissue engineering model 25 </ Sup> at modelere en anden befolkning, kvindelige atleter, der er i fare for bindevævskader: forekomsten af ​​ACL-skade er cirka fem gange større end deres mandlige modparter 35 . Potentielle mekanismer, der understøtter denne kønsbestemte forskel i skade, blev undersøgt ved behandling af ligamentkonstruktioner med fysiologiske koncentrationer af det kvindelige kønshormon, østrogen, i koncentrationer, der efterlignede stadier af menstruationscyklussen. Interessant hæmmede høje koncentrationer af østrogen genekspression og aktivitet af lysloxidase, det primære enzym, der var ansvarlig for dannelse af lysin-lysin-tværbindinger i collagenmatrixen af ​​ledbånd og sener. Det er vigtigt, at 48 h høj østrogen (til simulering af follikelfasen) nedsatte ligamentkonstruktiviteten uden at ændre kollagendensiteten af ​​konstruktionerne. Ud fra et fysiologisk perspektiv antyder dette, at stigninger i ligamentlaksighed hos kvinder kan skyldes, i det mindste delvist, at formindskesTværbindingsdannelse. Fra et eksperimentelt perspektiv fremhæver disse fund 25 brugen af ​​3D-konstruktormodellen, hvilket tillod funktionel tværbinderaktivitet, der skal undersøges. Fra et klinisk synspunkt kan denne model nu bruges til hurtigt at skærmme for interventioner, som kan forhindre de negative virkninger af ligamentfunktion østrogen.

Afsluttende bemærkninger
Her har vi præsenteret en detaljeret metode til dannelse af manipulerede ledbånd og deres anvendelighed som en 3D in vitro vævsmodel. Modellen er yderst tilpasselig til en bred vifte af målsætninger, der giver fleksibilitet i celletype, interventioner og udfaldsmålinger af interesse. Supplerende fodermedier med konditioneret serum tilføjer en fysiologisk kontekst, der ikke kan opnås i et traditionelt in vitro- miljø, hvilket forbedrer modelleringen af in vivo- fysiologi. Kort sagt mener vi, at dette er en bredt anvendelig tilstandL med spændende konsekvenser for at fremme både fysiologi og vævsteknologi.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et NSERC postdoktoralt stipendium (DWDW), et ARCS Foundation Scholarship (AL) og en UC Davis College of Biological Sciences grant (KB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 Entomoravia N/A For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) N/A For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w) EMD Millipore PX0995 For brushite cement anchors
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500g For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772A For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 4019862 For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific SH3002802 For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution VWR 45000-616 For cell isolation
Type II collagenase Thermo Fisher Scientific 17101015 For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution Thermo Fisher Scientific 15140122 For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated EMD Millipore SCGP00525 For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine VWR 10-013-CV For cell and tissue culture
Fetal bovine serum BioSera FBS2000 Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt MP Biomedicals 0219453680 - 100 MU Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) VWR 82050-598 For cell culture
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282 For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL Fisher Scientific 367820 For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle Fisher Scientific 354221 For human serum collection
Thrombin, bovine origin Sigma-Aldrich T4648-1KU For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin Sigma-Aldrich F8630-5G For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A3428 For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid Sigma-Aldrich 07260-100g For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960-5G Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline Sigma-Aldrich P5607-25G Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1 Peprotech 100-21 Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized EMD Millipore SCGPU02RE For reagent sterilization
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-212 Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde Sigma-Aldrich 39070-50g For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate Sigma-Aldrich 402869-100g For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline Sigma-Aldrich H54409-100g For hydroxyproline assay
1-propanol Sigma-Aldrich 279544-1L For hydroxyproline assay
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421-250ml For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial EMD Millipore AX0073-9 For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous Sigma-Aldrich 244511-1L For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-656 For hydroxyproline assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
  2. Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
  3. Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
  4. Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
  5. Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
  6. Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
  7. Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
  8. Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
  9. Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
  10. Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
  11. Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
  12. Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
  13. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
  14. Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
  15. Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
  16. Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
  17. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).
  18. Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
  19. Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
  20. Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
  21. Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
  22. Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
  23. Woessner, J. F. Jr The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
  24. Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
  25. Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
  26. Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
  27. Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
  28. Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
  29. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
  30. Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
  31. Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
  32. Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists? J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
  33. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  34. Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
  35. Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).

Tags

Bioengineering udgave 124 vævsteknik anterior korsbånd trækprøvning kollagen motion endogent biokemisk miljø
Behandling af ligamentkonstruktioner med træningskonditioneret serum: en translational tissue engineering model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D.… More

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D. W. D. Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model. J. Vis. Exp. (124), e55339, doi:10.3791/55339 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter