Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Behandling av ligamentkonstruktioner med träningskonditionerad serum: en translationsvävnadsteknikmodell

Published: June 11, 2017 doi: 10.3791/55339
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3
1Department of Neurobiology, Physiology, and Behavior, University of California, Davis, 2Department of Physiology and Membrane Biology, University of California, Davis, 3Faculty of Kinesiology and Physical Education, University of Toronto

Summary

Vi presenterar en modell av ligamentvävnad, i vilken tredimensionella konstruktioner behandlas med det humana träningskonditionerade serumet och analyseras för kollagenhalt, funktion och cellulär biokemi.

Abstract

In vitro- experiment är väsentliga för att förstå biologiska mekanismer; Klyftan mellan monolagsvävnadskultur och humanfysiologi är emellertid stor, och översättningen av fynd är ofta dålig. Således finns det gott om möjlighet till alternativa experimentella tillvägagångssätt. Här presenterar vi ett tillvägagångssätt i vilket humana celler isoleras från mänskliga främre korsbindiga vävnadsrester, expanderade i kultur och användes för att bilda manipulerade ledband. Övning förändrar den biokemiska miljön i blodet så att funktionen hos många vävnader, organ och kroppsliga processer förbättras. I detta experiment kompletterades ligamentkonstruktionskulturmedia med experimentellt humant serum som har "konditionerats" genom träning. Sålunda är ingreppet mer biologiskt relevant, eftersom en experimentell vävnad utsätts för den fullständiga endogena biokemiska miljön, innefattande bindande proteiner och tillsatsföreningar som kan förändras i takt med aktiviteten hos enOkänd agent av intresse. Efter behandling kan manipulerade ledband analyseras för mekanisk funktion, kollagenhalt, morfologi och cellulär biokemi. Sammantaget finns det fyra stora fördelar gentemot traditionell monolagskultur och djurmodeller, av den fysiologiska modellen av ligamentvävnad som presenteras här. För det första är ligamentkonstruktioner tredimensionella, vilket gör det möjligt att kvantifiera mekaniska egenskaper ( dvs. funktion) såsom ultimat dragspänning, maximal dragbelastning och modul. För det andra kan ingreppet, gränssnittet mellan bont och senelement, undersökas i detalj och inom funktionellt sammanhang. För det tredje möjliggör man att undersöka på ett opartiskt sätt förberedelserna av medier med efter-träningsserum, vilket gör att effekterna av den träningsinducerade biokemiska miljön, som är ansvarig för det stora utbudet av hälsoeffekter av motion, kan undersökas. Slutligen utvecklar den experimentella modellen vetenskaplig forskning på ett humant och etiskt sätt genom att ersätta användningen avDjur, ett kärnmandat för National Institutes of Health, Center for Disease Control och Food and Drug Administration.

Introduction

Tendon och ligamentskador är vanliga och kan ha försvagande konsekvenser för normal rörlighet och livskvalitet. Kirurgisk ingrepp är ofta nödvändig men kan ha begränsad och varierad framgång 4 , 5 . Den nuvarande förståelsen av hur senor och ledband utvecklas, mognar och svarar på skador är ofullständiga och därmed behövs effektiva forskningsmodeller för att ge insikt i utvecklingen av effektivare behandlingar 5 . För att ta itu med denna kunskapsskillnad kan djurmodeller användas men in vivo- studier är i sig komplexa med svårigheter att styra miljön och direkt rikta in åtgärder mot den avsedda vävnaden. I motsats härtill kan den experimentella miljön lätt kontrolleras och övervakas in vitro med traditionell monolagscellkultur. Denna teknik kan emellertid överskrida den kemiska och mekaniska miljön och kan således inte återförasSena in vivo beteendet hos cellerna. Vävnadsteknik kan gifta sig med fördelarna med den komplexa in vivo- miljön i djurmodeller med kontrollen av in vitro- miljön och ger ett ytterligare verktyg för att studera fysiologi. Dessutom beväpnad med en bättre förståelse av ligamentutveckling kan vävnadsteknik också ge en källa till ympvävnad när kirurgisk rekonstruktion krävs 6 . Således validerar metoden som beskrivs häri en in vitro 3D-konstruerad vävnad som kan användas för att studera ligamentfunktion och morfologi.

Fibrinbaserade senor eller ligamentkonstruktioner har använts som en in vitro- modell för att studera fysiologiska processer innefattande kollagenfibrillogenes 7 och senutveckling 8 såväl som translationella tillämpningar, i vilka deras användbarhet som ympvävnad har utvärderats i en fårmodell av främre cruCiate ligament (ACL) rekonstruktion 9 . Vårt laboratorium har tidigare etablerat en 3D-konstruerad ligamentmodell som spänner över två pensit, ett kalciumfosfatben-substituerande material, cementankare. Denna modell kan enkelt underkastas olika experimentella förhållanden genom att komplettera kulturmediet med biologiska faktorer 10 eller tillämpa mekanisk stimulering 11 . Viktigt är att denna ben-till-ben-ligamentmodell möjliggör en djup analys av entesen, gränssnittet mellan bont och senelement, vilket är mottagligt för skada.

I studien framhävd 1 för att presentera denna metodik var vi intresserade av effekten av träningsinducerade förändringar i den biokemiska miljön på ligamentfunktionen. Övning förbättrar cell- och organfunktionen i en mängd olika vävnader genom kroppen 2 , 3 , 12 , en effekt som kan hänföras till frisättningen av olika kända (t.ex. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-liknande 15 , exosomer 16 , 17 ) och andra okända, biokemiska faktorer frisläppta i systemcirkulationen . Vidare berikas den biokemiska miljön efter träning med träningsreaktiva hormoner, vars frisättning stimuleras genom stimulering av sekretoriska körtlar i sympatiskt nervsystem ( t.ex. kortisol och katekolaminer från binjuren 18 och tillväxthormon från den främre hypofysen 19 ). Men jag är n vivo , det är omöjligt att skilja effekterna av den mekaniska stimulansen av motion från träningsinducerade biokemiska förändringar. Medan vissa studier har karakteriserat den förväntade ökningen av vissa cirkulerande hormoner och cytokiner som svar på exercisE som nämnts ovan finns det för många faktorer, både kända och okända, att troligt rekapitulera in vitro. Det vill säga att isolera några faktorer för en in vitro- studie behandlar otillräckligt komplexiteten hos det biokemiska svaret. I den här undersökningen undersökte vi hur förändringar i den biokemiska biologiska miljön, som orsakas av träning, påverkar funktionell ligamentfunktion. För att isolera effekterna av de biokemiska förändringarna erhöll vi serum från humana deltagare före och efter en kamp mot motståndsövning och använde den för att behandla 3D-konstruerade ligament som bildades med hjälp av mänskliga främre korsband (ACL) fibroblaster. Med hjälp av denna modell kan vi få funktionella data, inklusive effekter på mekaniska egenskaper och kollageninnehåll, samt kvantifiera effekter på molekylär signalering.

Protocol

Följande förfaranden följer ett protokoll som godkändes av Institutional Review Board of University of California, Davis; Samråda med den lokala etikknämnden före början av forskningen.

1. Isolera primära fibroblaster från humana ACL-rester

OBS: Behåll sterilitet och utför alla steg i ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC).

  1. Hämta godkännande från lämplig etikbedömningskort för insamling och användning av mänskliga vävnader enligt beskrivningen nedan.
  2. Förbered 5x antibiotikum / antimykotisk (ABAM) lösning genom att späda 100x antibiotikum / antimykotisk lösning i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
  3. Samla ACL-vävnadsfragment i 5X ABAM-lösning i ett 50 ml koniskt rör, förvara vid 4 ° C tills matssteget. Skär vävnad i mindre fragment med ett rakblad om nödvändigt till en maximal storlek av 1 x 1 x 1 cm 3 .
    FÖRSIKTIGT: Följ lokala miljöhinderegler förKorrekt användning av biohazard-material och dekontaminering och bortskaffande av biohazard-avfall.
  4. Förbered en tillräcklig volym kollagenaslösning för att sänka vävnadsfragmenten. Lös kollagenas typ II (1 mg / ml) i hög glukos Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 1x penicillin / streptomycin och 20% fetalt bovint serum (FBS) och filter vid 0,22 μm.
  5. Skölj ACL-vävnad 3 gånger i PBS.
  6. Digest vävnad. Överför ACL-vävnad till ett nytt 50 ml koniskt rör och tillsätt en tillräcklig volym kollagenaslösning för att nedsänka vävnaden. Inkubera vid 37 ° C över natten (~ 17 h).
  7. Innan matsmältningsperioden är fullständig, förbered tillväxtmediet (GM) genom att komplettera DMEM-högglukosmedia med 10% FBS och 100 U / ml penicillin.
  8. 15 min innan matsmältningstiden är klar, vortexar det vävnadsinnehållande 50 ml röret 3 gånger var 5: e minut.
  9. Använd en 25 ml serologisk pipett, triturera den digererade vävnaden kraftigt för att bryta tiSsue upp längre och dislodge celler.
  10. Centrifugera vid 1500 xg i 5 min. Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 10 ml GM.
  11. Upprepa steg 1.8-1.9 tre gånger.
  12. Efter den sista centrifugeringen resuspenderar pelleten i 5-10 ml GM. Använd ett litet urval av cellsuspensionen för att utföra ett celltal med en hemocytometer och utvärdera cellens livskraft med hjälp av Trypan Blue.
  13. Placera cellsuspensionen på 15 cm vävnadsodlingsplattor vid en densitet av 3-4 x 10 ^ celler per platta.
  14. Kultur till 70% sammanflöde i en steril inkubator upprätthållen vid 37 ° C och 5% CO2, förändring av GM varje tredje dag. Använd eller lagra (se nedan) celler inom 5 passager.
  15. Frysceller för framtida användning.
    1. Trypsiniserar celler vid 70% sammanflöde enligt följande. Aspirera media och tvätta celler med PBS. Tillsätt tillräckligt med förvärmt (37 ° C) 0,05% trypsin för att bara täcka botten av vävnadskulturplattor. Placera plattorna i odlingsinkubenAtor i ~ 5 min tills cellerna lossnar (kontrollera cellerna flyter med hjälp av ett ljusmikroskop). Använd en pipett för att samla in celler och skingra in i ett Falcon-rör.
    2. Centrifugera till pelletsceller och resuspendera celler i DMEM-högt glukosmedium innehållande 20% FBS och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Alikvotscellsuspension i cryovials och kyla vid -1 ° C / min i minst 24 timmar. Förvara frysta cryovials i flytande kväve.

2. Förbered silikonbelagda tallrikar

  1. Förbered 35 mm vävnadskulturplattor: Avlägsna lock och lägg ut öppna plattor på en plan yta.
  2. Blanda silikon elastomersats enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Använd en 10 ml spruta för att dispensera ca 2 ml per 35 mm platta.
  4. Låt silikon härda vid rumstemperatur i 2-3 dagar.

3. Förbered Brushite Cement Anchors

  1. I förväg bereda silikonformiga omformar som innehåller cylindriska viLls för ankarbildning. Omvänd formar kan göras enligt specifikationerna för önskad förankringsform och storlek.
    1. Bestäm önskad längd och diameter för det sista ankaret. Detta protokoll använder en skräddarsydd gjutform gjord av hantverkssilikon i en 35 mm vävnadskulturskål där plastcylindrar med en diameter av omkring 3,25 mm placerades, vilket möjliggör en slutlig formhöjd av ca 6,5 ​​mm. Slutförankringsdimensionerna är ca 3-3,5 mm i höjd och ca 3,4 mm i diameter med 1,5 mm stift utskjutande från ankarets botten.
    2. Lägg till ohärdad silikon i en 35 mm skål i vilken formen kommer att tillverkas. Placera plastcylindrar i enlighet med detta.
      OBS: Plastflaskans storlek bestämmer diametern på de sista ankrarna. Placeringen av plastcylindrarna och mängden silikon som används kan modifieras för att producera ankare av olika höjder. Tjockleken mellan botten av brunnarna i formen och botten av formen i sig kommer dEtermin hur mycket stiftet kan sticka utifrån ankarets botten så att ankaret senare kan sättas fast i den silikonbelagda skålen.
    3. Efter att silikonet har botats, ta bort plastcylindrarna och ta bort formen från 35 mm skålen.
  2. Förbered en 3,5 M ortofosfor / 100 mM citronsyra lösning. Lös upp 0,961 g citronsyra i 11,5 ml ortofosforsyra. Lös volymen av lösningen upp till 50 ml med MilliQ vatten. Förvara lösningen vid rumstemperatur och skydda mot ljus.
  3. Förbered formar: Placera en minutienstift i mitten av varje cylindrisk brunn i formarna.
  4. Kombinera β-tricalciumfosfat och ortofosforsyra / citronsyralösning vid en koncentration av 1 g / ml i en plastvägbåt på is.
  5. Blanda cementet kraftigt med en plastcellskrapa.
  6. Triturera cementet för att fortsätta blanda och pipettblandningen i formen
  7. Centrifugera den fyllda formen under 1 min vid 2 250 x g.
  8. Låt borstascementankar sätta rumstemperatur över natten.
  9. Ta bort ankare från formen och stift två ankare 12 mm ifrån varandra i varje silikonbelagd platta.
  10. Sterilisera pinnplattor genom att spruta med 70% etanol, fylla både plåtarna och locken och placera i en BSC. Efter minst 30 min, suga upp plattor och byt ut lock, lagra i BSC tills det behövs.

4. Skaffa humant serum

  1. Se till att godkännande av lämplig etikutvärderingskort har erhållits för detta protokoll.
  2. Se till att skriftligt informerat samtycke har erhållits från människor för att delta i ett givet ingrepp ( t.ex. motion, mat eller drogintervention) som kommer att påverka önskade förändringar i serum. Här beskriver vi samlingen i vila och 15 minuter efter motionsövning.
  3. Med hjälp av en utbildad phlebotomist får du ett vilande blodprov från en deltagare genom venipunktur i en lämplig evakuerad behållare. Samla ett blodprov efter träning 15 minuter efter att deltagarna har deltagit i det önskade träningsprotokollet. Som tidigare beskrivet 1 , använd motståndsövningsprotokollet i detta experiment för att stimulera ett endogent biokemiskt svar.
    1. Har deltagare utföra fem uppsättningar benpress med en minuters vila mellan uppsättningar. Därefter ska deltagarna utföra en uppsättning knäförlängningar och en uppsättning hamstringkrullar i följd utan vila och upprepa sedan back-to-back-övningarna tre gånger med 1 min vila mellan uppsättningar.
  4. Låt blodet stryka före centrifugering vid 1500 xg under 10 minuter. Under sterila förhållanden överför serum till sterila rör för framtida medietillskott (serum lagrat vid 4 ° C) och biokemisk analys (en liten alikvot serum lagrad vid -20 ° C).

5. Form Engineered Ligaments

OBS! I förväg, utöka primär fiBroblaster och förbereda silikonbelagda plattor med pinnade borstaritankar.

  1. Beredda reagens:
    1. Förbered trombin. Upplösning av bovint trombin vid 200 U / ml i DMEM-högt glukosmedium. Filtrera vid 0,22 μm, alikvot och förvara vid -20 ° C.
    2. Förbered fibrinogen. Lös upp bovint fibrinogen vid 20 mg / ml i DMEM-hög glukosmedium. Inkubera i 3-4 timmar i ett 37 ° C vattenbad och virvla runt var 30: e minut för att hjälpa upplösningen. Filtrera vid 0,22 μm (flera filter kan behövas), alikvot och lagra vid -20 ° C.
    3. Förbered aprotinin. Lös aprotinin i 10 mg / ml i vatten. Filtrera vid 0,22 μm, alikvot och förvara vid -20 ° C.
    4. Förbered aminohexansyra. Lös upp aminohexansyra vid 0,1 g / ml i vatten. Filtrera vid 0,22 μm, alikvot och förvara vid 4 ° C.
    5. Förbered askorbinsyra. Lös askorbinsyra i DMEM hög glukosmedium i en koncentration av 50 mM. Filtrera vid 0,22 μm och lagra vid 4 ° C.
      6. <Li> Förbered L-prolin. Lös upp L-prolin i PBS vid en koncentration av 50 mM. Filtrera vid 0,22 μm och lagra vid 4 ° C.
    6. Förbered transformationstillväxtfaktor-β1 (TGF-β1). Rekonstituera TGF-β1 enligt tillverkarens anvisningar i en koncentration av 10 μg / ml. Aliquot och lagra vid -20 ° C.
  2. Bestäm det antal konstruktioner som krävs för försöket och se till att tillräckligt många plåtar är beredda. Både biologiska och tekniska replikat rekommenderas. I undersökning 1 som framhävs här använder du dubbla tekniska replikat och 12 biologiska replikat (serum från 12 personer i vila och efter träning).
    OBS! Utför följande steg under sterila förhållanden i en BSC.
  3. Expandera celler genom odling i 15 cm plattor till 70% sammanflöde. 2,5 x 10 ^ celler krävs per konstruktion.
  4. Trypsiniserar celler och resuspenderar i GM vid en koncentration av 3,67 x 105 celler / ml.
  5. Generera en masterblandning för antal konstruktioner som krävs: För 1 konstruktion innehåller masterblandningen 681 μL cellsuspension (innehållande 2,5 x 10 5 celler), 29 μl trombin, 2 μl aprotinin och 2 μL aminohexansyra.
  6. Efter att ha blandat huvudblandningen väl, tillsätt 714 μL till varje pinnad platta i ett "figur 8" mönster runt borstettcementankarna. Se till att huvudmixen direkt kontaktar ankarnas sidor.
  7. Tryck försiktigt på varje platta för att fördela masterblandningen jämnt över plattan.
  8. För en platta åt gången tillsätt 286 μL fibrinogen på droppvis sätt jämnt över en platta och släng försiktigt plattan fram och tillbaka och sida vid sida över ytan av BSC för att fördela fibrinogenet för att bilda de cellinbäddade fibringelerna . Fortsätt till nästa platta.
  9. Placera konstruktionerna i en steril inkubator hållen vid 37 ° C och 5% CO2 och inkuberaI minst 15 minuter för att tillåta polymerisation av fibrinogenet.
  10. Förbered tillräckligt med matningsmedier (FM) för 2 ml per konstruktion. Supplement GM med 200 | iM askorbinsyra, 50 | iM prolin och 5 ng / ml TGF-P1.
  11. Tillsätt 2 ml FM för att täcka varje konstruktion. Kultur konstruktionerna i en steril inkubator upprätthålls vid 37 ° C och 5% CO2 i totalt 14 dagar eller till önskad slutpunkt, uppfriskande media varje andra dag med 2 ml FM

6. Dragmotorerande ligament

OBS: Dragprovning utfördes med hjälp av en specialbyggd dragprovare i ett PBS-bad; Omvändformade grepp som är kopplade till krafttransducerens hållbrickitcement ankrar på plats under provet.

  1. Bestäm längden och bredden av ligamentkonstruktionerna med hjälp av digitala kaliper; Beräkna tvärsnittet av vävnaden.
  2. Lossa ligamentkonstruktionen från plattan och placera ankarna iOmvänd gjutna grepp, vilket säkerställer att konstruktionen är nedsänkt i PBS.
  3. Justera avståndet mellan grepparna, sätt konstruktionens längd till dess ursprungliga längd.
  4. Börja testet: töm konstruktionen för att misslyckas med en belastning på 0,4 mm / s (eller ~ 3% / s).
  5. Efter avslutad test, bearbeta vävnadsresterna för kollagenhalten (se avsnitt 7).
  6. Utifrån de resulterande belastningsdeformationsdataen, beräkna spännings-stamdata och kvantifiera mekaniska egenskaper av intresse; Till exempel maximal dragbelastning, ultimat draghållfasthet och modul ( dvs elastisk egenskap över en linjär region av stress-belastningskurvan).

7. Kvantifiering av kollageninnehåll av konstruerade ligament

  1. Ta bort manipulerade ledband från borstettcementankar och torka vid 120 ° C i 25 minuter.
  2. Bestäm torrmassa av konstruktioner och placera i individuella 1,5 ml rör. Torra konstruktioner kan lagras vid rumstemperaturTills vidare bearbetning.
  3. Till varje konstruktion sätt 200 μl 6 M HCl. Koka vid 120 ° C i ett värmeblock i 2 timmar i en avluftningsugn.
    FÖRSIKTIGHET: HCl är mycket frätande och surt. Det rekommenderas att man använder koka / säkra låsrör eller annan metod för att säkra rör.
  4. Centrifugera rören kortfattat för att samla vätska och låt dem vara oförskjutna för att avdunsta vid 120 ° C i ett värmeblock i 1,5 h i en avluftningsdragning.
  5. Resuspendera den resulterande pelleten i 200 pl hydroxiprolinbuffert. Förvaras vid -20 ° C tills det behövs.
    1. Beredning av hydroxiprolinbuffert. I 300 ml vatten tillsättes 16,6 g citronsyra, 4 ml ättiksyra, 11,4 g NaOH och rör om tills den är upplöst. PH till 6-6,5 och bringa volymen upp till 500 ml. Tillsätt 250 μL toluen som konserveringsmedel och förvara vid 4 ° C skyddad mot ljus.
  6. Förbered reagens.
    1. Förbered trans-4-hydroxi-L-prolin. Lös upp i vatten för att ge en 4 mg / ml lösning.
      2. <Li> Förbered kloramin-T. Lös i vatten för att göra en 14,1 mg / ml lösning.
    2. Förbered aldehyd-perklorat. Lös 1,5 g 4-dimetylaminobensaldehyd i 6 ml 1-propanol, 2,6 ml perklorsyra (VARNING: frätande, stark oxidationsmedel, använd lämpliga försiktighetsåtgärder) och 0,5 ml vatten.
  7. I en uppsättning nya 1,5 ml rör späd ut ett prov av varje resuspenderad pellet i hydroxiprolinbuffert till en volym av 200 pl.
    OBS: Spädningar kan sträcka sig från 1: 4 till 1:50 av provet: buffert beroende på det förväntade kollagenhalten i provet. Därför kan det krävas en provning och felprovning för att bestämma en utspädningsfaktor som är lämplig för den givna provuppsättningen (dvs. placera proverna mot mitten av standardkurvan).
  8. Förbereda hydroxyprolinstandarder. Späd hydroxyprolin i hydroxiprolinbuffert (se avsnitt 7.5.1) till 80 μg / ml. Utför seriella utspädningar för att göra 6-8 200 μL-standarder mellan 0-20 μg / ml.
  9. Tillsätt 150 μl 14,1 mg /Ml kloramin T lösning till varje standard och utspädd prov. Virvel och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
  10. Tillsätt 150 μL aldehyd-perkloratlösning till varje prov och utspätt prov. Virvel och inkubera i ett värmeblock vid 60 ° C under 15 minuter. Kassera överskott av aldehyd-perkloratlösningen som farligt avfall i enlighet med lokala bestämmelser (innehåller perklorsyra).
  11. Låt normer och prov svalna, innan man alikvoterar 200 μl av vardera, i dubbletter, i plattor med 96 brunnar.
  12. Läs plattan vid 550 nm i en spektrofotometer. Kassera tallrik och resterande volym i 1,5 ml rör som farligt avfall enligt lokala föreskrifter (innehåller perklorsyra).
  13. Beräkning av totalt kollagen och kollagenfraktion.
    1. Konvertera absorbansvärdet för varje prov till mikrogram hydroxiprolin med användning av hydroxiprolinstandardkurvan.
    2. Multiplicera varje brunn med 2,5 för att beräkna mängden hydroxiprolin iDet utspädda provet. Minns att endast 200 av 500 μl totalblandning (200 μl utspätt prov + 150 μl kloramin T +150 μL AP-lösning) tillsättes till varje provbrunn.
    3. Multiplicera med utspädningsfaktorn (avsnitt 7.7) för att beräkna mängden hydroxiprolin i originalprovet.
    4. Dela med 0,137 för att beräkna mängden kollagen (förutsätter att kollagen innehåller 13,7% hydroxiprolin 20 ).
      ANMÄRKNING: Mammalisk hydroxyprolinöverskott i kollagen varierar något över vävnader och däggdjursarter; Till exempel innehåller pigg och får Achilles senor 13,5 och 13,7% (hydroxiprolinmassa / torrvävnadsmassa) respektive 21 . Använd här 13,7% för att uppskatta procent hydroxiprolin i kollagen, vilket används för att beräkna kollagenhalten i ett vävnadsprov med användning av följande ekvation:
      Ekvation 1
    5. Del av torrmassan för att beräkna kollagen frånCtion och konvertera till en procentandel.
      Ekvation 2

8. Kvantificering av molekylära ändpunkter

OBS! Förutom de primära resultaten av dragprovning och kollagenhalt kan molekylära ändpunkter mätas på 2D eller 3D-vävnad för att lägga till mekanisk inblick. Bioassays kan användas för att bestämma molekylära ändpunkter (se följande avsnitt nedan för sammanhanget Effekten av serummiljön efter träning på in vitro- ligamentfunktionen).

  1. För 3D-vävnad:
    1. Förbered konstruktioner enligt steg 5 ovan.
    2. Efter konstruktionsbehandling / intervention, snäppfrysningskonstruktioner i flytande kväve.
    3. Genom att använda en mortel och pestle kyld på torris, konstruerar grind i ett pulver. Fortsätt i steg 8.4 / 5).
  2. För 2D vävnad:
    1. Kultur mänskliga ACL fibroblaster till sammanflöde i en månOljare i plattor med 6 brunnar innehållande DMEM.
    2. Aspirera DMEM och applicera behandlingsmedia enligt din experimentstrategi ( t.ex. tidskurs eller dosreaktionsexperiment).
    3. Aspirera behandlingsmedia och tvättceller med PBS.
    4. Skrapa celler att samla med en lämplig extraktionsbuffert / reagens (se nästa).
  3. Proteinuttrycksanalys: Använd en cytosolisk extraktionsbuffert ( t ex 250 mM sackaros, 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM MgCl2 och proteas / fosfatasinhibitorcocktail) för erhållande av proteinlysat. Utför proteinkoncentrationsanalys och fortsätt analys enligt standard western blot-förfaranden.
  4. Genuttrycksanalys: Isolera totalt RNA med användning av 500 μl RNA-isoleringsreagens enligt tillverkarens instruktioner för att erhålla högkvalitativt RNA. Utför omvänd transkription och realtids kvantitativ PCR-analys enligt standardprocedurer.
  5. DNA-isolering: Isolera och kvantifiera gEnom-DNA med användning av DNA-isoleringsreagens enligt tillverkarens instruktioner. Kvantifiera DNA-koncentrationen genom att använda en spektrofotometer för mätning av provabsorbansen vid 260 nm.

Representative Results

Översikt över konstruerad ligamentbildning och experimentell ingrepp

Figur 1 visar en överblick över bildandet av manipulerade ledband. Brushitcement, ett benutbytesmaterial 22 framställes genom att kombinera en ortofosforsyra / citronsyralösning med p-tricalciumfosfat i cylindriska brunnar. Alternativt, om inte direkt mätning av vävnadens mekaniska funktion kan 3-0 silkesuturer användas som ankare vid bildandet av en vävnad. Dessa är fastsatta 12 mm från varandra i silikonbelagda 35 mm rätter och steriliseras genom blötläggning i 70% etanol. Fibroblaster isoleras från främre korsbindningar som erhållits under ACL-rekonstruktionskirurgi. Efter expansion inkapslas 2,5 x 10 ^ celler i en fibringel som bildas i borstettcement-ankarspinnskålen. Efter bildning, ligament constrUcts kan undersökas för förändringar i mekaniska egenskaper, kollagenhalt, cellproliferation, genuttryck, proteinnivåer och vävnadsmorfologi.

Under hela cellen samlar cellerna fibringelén och bildar en linjär vävnad mellan de två ankrarna ( Figur 2A ). Efter 1-2 dagar i odling har cellerna kopplats till fibringelen, utvidgade cellprocesser och började utöva dragkraftar ( Figur 2B ). Eftersom fibringelen kontraheras av dragkrafter och bryts ned av cellulära enzymer genereras spänning mellan de två ankarpunkterna och våra celler är parallella med denna axel ( Figur 2B ) och börjar deponera kollagen. Efter 4-5 dagar har konstruktionerna dragit sig runt ankarna som bildar en linjär cylindrisk vävnad ( Figur 2A , vid denna tidpunkt kan externa stimuli appliceras på systemet (intervjuEntion vid denna tid undviker störning av den linjära vävnadsbildnings processen). Interventioner kan bestå av att komplettera odlingsmediet med humant eller djurserum efter ett givet ingrepp, exogena cytokiner och tillväxtfaktorer, med användning av mekanisk stimulering eller förändring av andra miljöfaktorer såsom syrspänning. Med användning av tillväxtmedier (DMEM med 10% FBS och 100 U / ml penicillin) kompletterat med 200 | jM askorbinsyra, 50 | iM L-prolin och 5 ng / ml TGF-P1 har vi bestämt att cellproliferation fortsätter under en 2 veckors kultur Period ( Figur 2C ) och i själva verket avslöjar ljusmikroskopi en tät vävnad innehållande höggradigt inriktade celler vid 14 dagars odling ( Figur 2B ).

Bedömning av manipulerade ledband

I slutet av odlingsperioden kan de konstruerade ligamenten bedömas i en varietypY av sätt. En stor fördel med detta system är förmågan att bestämma funktionella förändringar i vävnaden via mekanisk provning, en vital bedömning med tanke på den mekaniska rollen som nativ ligament. Uniaxiell dragprovning kan användas för att mäta mekaniska egenskaper inklusive belastning till misslyckande, ultimat draghållfasthet och Youngs modul. Viskoelastiska egenskaper kan också mätas med stressavslappning och kryptest. Figur 3A visar en konstruerad ligament hållen i omvänd gjutna grepp i en specialbyggd enaxlig dragprovning. Det högra greppet är fäst vid en kraftomvandlare för att mäta lasten över ligamentet eftersom vävnaden är ansträngd för misslyckande. Figur 3B visar ett representativt spänningsstamplot för ett test till misslyckande. Efter att ha genomgått mekanisk provning kan samma konstruktioner torkas och bearbetas för en hydroxiprolinanalys 23 för att bedöma totalt kollageninnehåll såväl som andra bioMiska analyser. Med ett tillräckligt antal ytterligare prover per tillstånd kan en grundlig undersökning av ett experimentellt ingrepp utföras, inklusive dess effekter på cellproliferation, gen- och proteinuttryck och histologisk morfologi. Medan 14 dagar är en typisk slutpunkt för våra studier, fortsätter de manipulerade ligamenten att förbättras i deras mekaniska egenskaper och kollagenhalt genom 28 dygn av kultur som visas i figur 3C och kan överleva i minst 3 månader i kultur 24 .

Donorvariation är ett viktigt övervägande för experimentell repeterbarhet. Figur 4 visar ett representativt experiment rapporterat av Lee et al. 25 jämförande 7 olika ACL-donatorer (n = 3 hane och n = 4 hona) som demonstrerar typiska dragegenskaper och kollagenhalt efter en 2 veckors kultur i det tidigare beskrivna Kompletterade tillväxtmedia. Användning av celler från liknande ACL-samlingar, ålder av givare, tid efter skada, kön etc., de konstruerade ligamenten visar låg variation mellan givare och liknande egenskaper mellan manliga och kvinnliga givare, med undantag för skillnaden i kollagenfraktion. I den ovannämnda studien användes manipulerade ledband som en in vitro- modell för att undersöka varför kvinnor har en signifikant större risk för ACL-skada än män och visade att ACL-fibroblaster isolerade från kvinnliga donatorer inte i sig utgör svagare och mindre kollagena manipulerade ligament 25 .

Effekten av serummiljön efter träning på in vitro- ligamentfunktionen

Vi har tidigare visat förmågan hos manipulerade ledband att användas för att söka fysiologiska processer 1 ,Ss = "xref"> 25. I följande representativa experiment som rapporterats av West et al. 1 , bestämde vi de biokemiska effekterna av övning på ligamentfunktionen och lyfter fram metod och resultat här. Vi bildade manipulerade ledband som använde mänskliga ACL-celler och tillämpade ett ingrepp på kultursdag 7, som bestod av kulturmedia konditionerat med humant serum uppsamlat före eller efter träning. I korthet rekryterade vi friska unga manliga deltagare och samlade blodprover före och efter en akut insats av motståndsövning som ökar cirkulerande hormoner och cytokiner inklusive humant tillväxthormon (GH). Humant serum isolerades från blodprover före och efter träning och användes i stället för fetalt bovint serum i odlingsmediet under den andra veckan av manipulerad ligamentkultur ( Figur 5A ). Före- och efterövande serumprover analyserades med användning av ELISA för förändringar i GH och insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1), denKoncentrationen av vilken kan förändras genom träning ( Figur 5B ). Denna information användes för att korrelera serumeffekter på de konstruerade ligamenten med förändringar i serum som svar på motion. Efter en 14 dagars odlingsperiod utvärderades ligamentkonstruktionerna med användning av mekanisk provning och en hydroxiprolinbestämning av kollagenhalten och påvisade en signifikant ökning av både maximal dragbelastning och kollagenhalt som svar på efterövningsserumet. I syfte att bedöma huruvida denna effekt var relaterad till övningsinducerad frisättning av GH eller IGF-1 bildades manipulerade ligament i ett separat experiment och behandlades med ett dosrespons av antingen humant rekombinant GH eller IGF-1. Intressant, medan serum-GH ökade i blodet ( Figur 5B -i) ökade gradvis ökande rekombinant GH-koncentration i odlingsmediet inte kollagenhalten ( Figur 5Di) eller mekaniskEgenskaper (data ej visade) i manipulerade ledband. I kontrast ökade inte serum-IGF-1-nivåerna efter träning, men ett dosresponsexperiment visade att ökande nivåer i odlingsmediet förbättrade kollagenhalten i ligamentkonstruktionerna ( Figur 4D -ii). Således, medan övning resulterade i robusta ökningar av GH efter utövande, uppvisar dosreaktionsexperimentet med användning av rhGH tvivel om huruvida GH är direkt ansvarig för fenotypisk förbättring av de manipulerade ligamenten (åtminstone utgör 22 kDa isoformen inte ensam Verkar vara ansvarig). Omvänt, medan serum-IGF-1 inte förändrades vid 15 min efterövning visade testning av rhIGF-1 över ett brett spektrum av koncentrationer att IGF-1 kan förbättra kollagenhalten; Det bör dock noteras att ökande rhIGF-1-koncentrationer genom ett område som uppskattade fysiologiska nivåer inte signifikant ökade kollagenhalten. Således är det unika post-motion serum enviroNment var viktigt för att förbättra mekaniken och kollagen av manipulerade ledband.

I studien framhävd här 1 var volymen av experimentellt serum begränsat på grund av etiska överväganden; Så användes kortvariga 2D bioassays, som hade lägre serumkrav, för att ytterligare sondra de molekylära mekanismerna som var ansvariga för ökningen av kollagen som observerades. ACL-fibroblaster odlades till sammanflöde i plattor med 6 brunnar och behandlades i 1 timme med vila eller efterövningsserum och jämfördes med dosresponser av rekombinant GH, IGF-1, TGF-β1 och aktiveringen av mål i PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2 och Smad-signaleringsvägar bestämdes. I närvaro av serum efter övning visade PI3K / mTORC1 och ERK1 / 2-vägen större aktivering, såsom bedömdes genom fosforylering av S6K ( Figur 5D -i) respektive ERK1 / 2 ( Figur 5D -ii).Jämfört med hormon- och cytokindosresponserna, medan GH hade en liten positiv effekt på mTOR-signaleringen ( Figur 5D -i) och IGF-1 visade en positiv effekt vid den lägsta dosen, var de tre behandlingarna av GH, IGF-1 och TGF -P1 tog inte hänsyn till ökningen av PI3K / mTORC1 och ERK1 / 2-signaleringen. Tillsammans föreslår vår 3D-konstruerade ligamentmodell och 2D bioassay-data att serummiljön efter träning kan förbättra den mekaniserade ligamentfunktionen och kollagenhalten genom aktivering av PI3K / mTORC1 och ERK1 / 2-vägarna.

Sammanfattningsvis kunde vi, med hjälp av en konstruerad ligamentmodell kombinerad med träningskonditionerat serum, undersöka effekten av serummiljö efter träning på mekaniserad ligamentfunktion och kollagen, ii) korrelera förändringar i ligamentfenotyp med förändringar i serumhormonkoncentration, Med sikte på att bestämma vilka förändringar i serumet som ledde till changEs i manipulerade ledband, och iii) vidare arbetets omfattning genom att använda 2D bioanalyser för att sondra molekylära mål i den biokemiska biologiska miljön för bestämning av molekylära mekanismer som aktiveras genom post-motion serum som leder till förbättringar i ligamentfunktionen.

Figur 1
Figur 1: Översikt över bildandet och användningen av manipulerade ledband. Brushite cementankare tillverkas och fastas i silikonbelagda plattor. Primär fibroblaster isoleras och expanderas från ACL-rester. Konstruerade ledband bildas genom inkapsling av fibroblaster i en fibringel kring två borstitcementankare. Konstruerade ligament odlas och behandlas med vilken specifik kemisk eller mekanisk ( t.ex. via en bioreaktor) stimuli som önskas. Vid önskad slutpunkt kan manipulerade ledband samlas in och utvärderas för mekanikL egenskaper, genuttryck, kollageninnehåll, proteinuttryck och histologi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2. Primära ligamentfibroblaster bildar ett fibrinbaserat ben-till-ben-konstruerat ligament som spänner över två borstitcementankare. ( A ) Över tiden sammandrag fibroblasterna fibringelen runt borstettcementankarna som bildar en linjär vävnad. ( B ) Under de första tre dagarna bifogas cellerna till fibringelen och utövar dragkrafter, varvid cellerna anpassas med konstruktionens längdaxel. Under 14 dagar bildar cellerna en starkt inriktad vävnad. Skalstång = 160 μm. ( C ) DNA-halten hos de konstruerade ligamenten fortsätter att öka oVer 14 dagar i odling när cellerna prolifererar. Data presenteras som medelvärde ± SD med n = 3-4 konstrukt per grupp. grupper. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Mekaniska egenskaper hos mekaniska mekanismer och kollagenhalt förbättras över tiden. ( A ) Ligamentkonstruktioner testas enhälligt för att bestämma effekten av ett givet ingrepp på ligamentfunktionen. Såsom visas, håller två omvänd gjutna, 3D-tryckta grepp ihop framkantsformade ankare som är överbryggade av den konstruerade senan. Ankare är kopplade till en stegmotor och kraftöverförare för att generera spännings / belastningskurvor hos den testade vävnaden, vilket möjliggör bestämning av mekaniska egenskaper. ( B </ Strong>) Representativ stress-stamkurva från en konstruerad ligament ansträngd till misslyckande. Under 28 dagar fortsätter ( C ) ultimat draghållfasthet (UTS), ( D ) maximal dragbelastning (MTL), ( E ) Youngs modulus och ( F ) kollagenfraktion att förbättras. Data presenteras som medelvärde ± SD med n = 5 konstrukt per grupp. * Indikerar signifikant skillnad från alla andra grupper. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Konstruerade ledband kan utvärderas för funktionalitet och biokemiskt innehåll, vilket visar låg donorvariabilitet. Konstruerade ligament bildades 7 olika donatorer (n = 3 man, n = 4 kvinnlig). Efter 2 veckor oF-kulturen bedömdes de för skillnader i ( A ) maximalt dragbelastning, ( B ) ultimat draghållfasthet (UTS), ( C ) Youngs modulus, ( D ) tvärsnittsarea (CSA), ( E ) totalt kollagenhalt per Konstruera och ( F ) kollagen som en fraktion av torr massa. Data presenteras som medelvärde ± SD och statistisk signifikans var med Studentens t-test. * Indikerar signifikant skillnad från andra grupper (p <0,05). Figur anpassad från Lee et al. 25 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5. Konstruerade ledband visar mekaniska och biokemiska förändringar som svar på bioloGical interventioner. ( A ) Serum isolerades från bloddragningar samlade från ämnen före (RestTx) och efterövning (ExTx) och användes för att behandla manipulerade ligament under den andra veckan av kulturen. ( B ) (i) Humant tillväxthormon (GH) och (ii) insulinliknande tillväxtfaktor (IGF) -1 nivåer i resten och övningsserum kvantifierades genom ELISA. ( C ) Konstruerade ligament behandlade med ExTx visade förbättrad (i) kollagenhalt och (ii) maximal dragbelastning. Statistisk signifikans av parade jämförelser (RestTx och ExTx) analyserades med ett t-test med signifikansnivå satt till p <0,05. ( D ) Ett dosrespons av (i) GH och (ii) IGF-1 användes för att bestämma eventuella bidrag av dessa faktorer till förändringarna i kollageninnehåll på grund av ExTx. E) 2D bioassays användes för att jämföra effekterna av ökande doser av GH, RestTx och ExTx på molekylära signaleringsmål såsom fosforyleringen av (i) S6K Thr389 och (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Statistisk jämförelse av mer än två experimentella grupper utfördes med användning av ANOVA och Tukey's HSD. Data presenteras som presenterad som medelvärde ± SD. * Indikerar en signifikant skillnad från kontroll (p <0,05) och § indikerar signifikant skillnad från 150 ng / ml och 300 ng / ml IGF-1. Figur anpassad från West et al. 1 Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Det nuvarande manuskriptet beskriver en modell av ligamentvävnad som är en användbar experimentell plattform för utredare med ett brett spektrum av forskningsämnen, från vävnadsutveckling till translationella / kliniska frågor. Den konstruerade ligamentmodellen som beskrivs här baseras på ett mångsidigt protokoll som kan anpassas på olika punkter genom arbetsflödet ( Figur 1 och Diskussionsavsnittet ). Vidare kan den naturligt reduktiva naturen hos in vitro- miljön bringas närmare det fysiologiska området genom att komplettera matningsmedier med konditionerat humant eller djurserum.

Konstruktioner kan bildas med användning av fibroblaster från en mängd olika källor
Medan de metodologiska och representativa resultaten som visas här är baserade på användningen av primära ACL-fibroblaster kan cellisoleringsprotokollet justeras för att samla andra typer av primära fibroblaster. Som beskrivenI figur 4 visar konstruerade ligament bildade med primära celler isolerade från unga humana donatorer låg donatorvariabilitet. Primärceller begränsas av initial isolering och passagebegränsning; Användningen av cellinjer kan förbättra reproducerbarheten av experimenten. Användningen av andra celltyper kan kräva modifieringar i cellodlingsmedia och fibrin-gelformulering. Till exempel har vi observerat att mänskliga mesenkymala stamceller (MSCs) inte kan bilda linjära vävnader mellan borstitcementankrarna under 2 veckor medan hästens överlägsna digitala flexor-tendonfibroblaster, hästbenmärgsstromala celler, embryonala tendonfibroblaster , Och murina C3H10T1 / 2 MSCs kontraherar snabbt och smälter fibringelen för att bilda en linjär vävnad (obublicerade observationer). Denna kontrast kan vara en följd av skillnader i cellkontraktilitet, proliferation och fibrinolytisk enzymproduktion.

Användning av kemikalierOch mekanisk stimulering
I det här beskrivna förfarandet bildar fibrinbaserad vävnad kring borstitcementankar, vilket möjliggör applicering av mekanisk stimulering via en sträckbioreaktor 11 såväl som för slutpunktstestningstestning. Närvaron av borsteitcement-mjukvävnadsgränssnittet (enthesis) ger också möjlighet till ytterligare undersökning och förbättring 22 , 26 (se avsnittet Kliniska tillämpningar nedan). I denna in vitro- miljö kan bidraget från kemiska och mekaniska faktorer lättare identifieras; Ett exempel på detta visas i figur 5 , varigenom effekten av serummiljön efter träningen separerades från den mekaniska stimulansen för motion. Pilotstudier kan behövas för att bestämma tidsramen för försöksinterventioner, sammansättning av behandlingar och lämpliga slutpunkter för att förvänta sig en observerbar förändring. FoExempelvis, i efterstudie-serumstudien 1 , begränsades längden av experimentell behandling av tillförseln av serum som användes för att komplettera media, varifrån konstruktionerna matades varannan dag. Under den andra veckan av odling kompletterades odlingsmediet med resten eller efter-övningsserum med askorbinsyra och L-prolin bibehölls medan TGF-β1 avlägsnades. TGF-β1 är en känd profibrotisk tillväxtfaktor som ökar i serum efter övning 27 . För att undvika att dämpa TGF-β1-relaterade effekter av efter-övningsserumet behölls detta cytokin inte i odlingsmediet.

Denna konstruerade ligamentmodell kan också användas för att testa effekten av mekanisk sträckning. Genom att konstruera omvänd modellerade grepp för att hålla borstettcementankarändarna (liknar den enhälliga dragprovningen som visas i Figur 1 ) kan sträckbioreaktorer konstrueras för att rymma eng Ineered ligament. Vårt laboratorium har tidigare använt denna modell för att undersöka det molekylära signaleringssvaret hos manipulerade ligament till enaxlig dragsträcka i en skräddarsydd bioreaktor 11 som kommer att ge en bättre förståelse för den rationella utformningen av ett in vitro sträckparadigm eller till och med potentiellt in vivo Stretch / aktivitet / terapeutiska applikationer.

Bedömning av manipulerade ledband
Som med traditionell monolagskultur kan 3D-konstruktioner analyseras för gen / proteinuttryck; Dessutom ger deras 3D-morfologi möjlighet att bedöma funktionella och morfologiska förändringar och konstruktioner kan bibehållas i kultur för långsiktiga studier ( Figur 3 ). Medan manipulerade ligament inte är ekvivalenta med naturliga, mogna ligament, har de likhet med att utveckla senor / ligament och uppför sig på liknande sätt som nativa vävnader som svar på näringsämnen"> 26, tillväxtfaktorer 10 , hormoner 25 och övning 11 , 28. Sålunda är försiktighet innan man gör breda generaliseringar från vilken in vitro- modell som helst, kan resultaten från ligamentkonstruktionstest avslöja eller informera en viss fysiologisk mekanism som annars kan vara Omöjligt att undersöka in vivo.

Komplettera matningsmedier med konditionerat serum för en flexibel och dynamisk modell med breda applikationer
Det humana serummetabolomen är en miljö av ~ 4500 föreningar inkluderande, men inte begränsat till, glykoproteiner, lipoproteiner, lipidderivat, energisubstrat, metaboliter, vitaminer, enzymer, hormoner, neurotransmittorer och en mängd byggstenar / intermediärer. 29 Ytterligare kontroll av den humana serummetabolomen enligt föreningsklasserna 29 avslöjar additiOnal fördelar med att integrera experimentellt serum i in vitro-experiment. Det vill säga majoriteten av de ~ 4500 föreningarna i serum är hydrofoba eller lipid-härledda, vilket understryker vikten av bindande proteiner för transport / solubilisering. Det följer att experimentell rekapitulering av endogena föreningstransportdynamik, och därmed biotillgänglighet och sammansatta mål-interaktioner, skulle vara nästan omöjligt. Sålunda är experimentellt serum särskilt effektivt för studier av föreningar som är kända för att bero på tillsatsmolekyler för solubilisering, transport, målbindning och verkningsmekanism.

Vårt laboratorium har ett långvarigt intresse för hälsoeffekterna av motion. Övning förbättrar cellulär och organfunktion i en mängd olika vävnader genom kroppen 12 , en effekt som kan hänföras till en mängd olika faktorer (t.ex. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-liknande 15 ,Exosomer 16 , 17 ) som frisätts i systemisk cirkulation. Den biokemiska miljön efter träningen reflekterar faktorer som frigörs både från kontrakterande skelettmuskulatur-reaktionshämmande hormoner samt faktorer som frigörs som resultat av sympatiskt nervsystemstimulering av sekretoriska körtlar ( t.ex. kortisol och katekolaminer från binjuren 18 och tillväxt Hormon från den främre hypofysen 19 ). Vi har nyligen använt en modell av före- och efterövande serum för att undersöka effekterna av den träningsinducerade biokemiska miljön på manipulerad vävnad. 1 Medan många viktiga träningsrelaterade forskningsfrågor kvarstår är modellen på ingen sätt begränsad på detta sätt. Exempelvis kan serum erhållas, antingen från djur eller mänskliga källor, efter diet eller farmakologiska ingrepp eller från olika åldersgrupper eller klinisk populationS 30 . På detta sätt kommer exogena eller endogena föreningar av intresse att finnas närvarande i serum och behandlingsmedia i biotillgängliga kvantiteter och kommer att interagera med målvävnaden i samverkan med den endogena miljön ( dvs. i ett mer fysiologiskt sammanhang). Detta tillvägagångssätt är dynamiskt eftersom det är högst sannolikt att en given intervention kommer att utöva en multi-organ (och multi-compound) effekt och således kommer den fysiologiska miljön att modifieras. Medan detta tillvägagångssätt presenterar vissa utmaningar, eftersom flera systemiska biokemiska variabler ändras samtidigt, är det ett tillvägagångssätt som kan bidra till att övervinna nackdelarna med rent reduktivistisk experimentell metodik 31 , 32 . Tillsammans kan implementering av konditionerat serum tillsammans med en vävnadsteknisk ( in vitro biomimetisk ) vävnad användas som ett verktyg för fysiologi, näring och kliniska forskningsfrågor.

Den vävnadsteknikmodell som presenteras här kan användas för att undersöka anatomiska och kliniska forskningsfrågor som traditionella in vitro- modeller inte kan. En ligament eller sena in vivo innehåller en mjuk-till-hård vävnadsövergångsområde som kallas enthesisen. Induktionen, som är sårbar mot mekanisk stressrelaterad skada 33 , kan studeras i tvärsnitt via histokemiska och elektronmikroskopitekniker 22 , 26 . Detta unika gränssnitt är dubbelt viktigt för dem med låg eller begränsad rörlighet, eftersom fysisk inaktivitet försvårar bindvävens förmåga att överföra belastning till regioner med låg till hög överensstämmelse 34 , vilket resulterar i en övergripande minskning av vävnadsöverensstämmelse och ökad skaderisk.

Vårt lab har nyligen använt denna vävnadstekniska modell 25 </ Sup> att modellera en annan befolkning, kvinnliga idrottare, som riskerar för biverkningar i bindväv: incidensen av ACL-skada är ungefär fem gånger större än deras manliga motsvarigheter 35 . Potentiella mekanismer som ligger till grund för denna könsbaserade skillnad i skada undersöktes genom behandling av ligamentkonstruktioner med fysiologiska koncentrationer av det kvinnliga könshormonet östrogen i koncentrationer som efterliknade stadier av menstruationscykeln. Intressant hämmade höga koncentrationer av östrogen genuttrycket och aktiviteten hos lvs-oxidas, det primära enzymet som är ansvarigt för att skapa lysin-lysin-tvärbindningar i kollagenmatrisen av ligament och senor. Viktigt är att 48 h hög östrogen (för att simulera follikulärfasen) minskade ligamentkonstruktiv styvhet utan att ändra konstruktionens kollagendensitet. Ur ett fysiologiskt perspektiv tyder detta på att ökningen av ligamentslakhet hos kvinnor kan bero på att åtminstone delvisTvärbindningsbildning. Ur ett experimentellt perspektiv markerar dessa fynd 25 nyttan av 3D-konstruktmodellen, vilket medger att funktionell tvärbindningsaktivitet kan undersökas. Ur ett kliniskt perspektiv kan denna modell nu användas för att snabbt skärpa efter ingrepp som kan förhindra de negativa effekterna av östrogen av ligamentfunktionen.

Avslutande kommentarer
Här har vi presenterat en detaljerad metod för bildandet av manipulerade ledband och deras användbarhet som en 3D- in vitro- vävnadsmodell. Modellen är mycket anpassningsbar till ett brett spektrum av mål, vilket ger flexibilitet i celltyp, interventioner och resultatåtgärder av intresse. Tillägg av matningsmedier med konditionerat serum lägger till ett fysiologiskt sammanhang som inte kan uppnås i en traditionell in vitro- miljö, vilket förbättrar modelleringen av in vivo- fysiologi. Kortfattat anser vi att detta är ett brett tillämpligt lägeL med spännande konsekvenser för att främja både fysiologiska och vävnadstekniska områden.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett NSERC-postdoktoralt stipendium (DWDW), ett ARCS Foundation Scholarship (AL) och en UC Davis College of Biological Sciences-bidrag (KB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 Entomoravia N/A For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) N/A For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w) EMD Millipore PX0995 For brushite cement anchors
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500g For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772A For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 4019862 For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific SH3002802 For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution VWR 45000-616 For cell isolation
Type II collagenase Thermo Fisher Scientific 17101015 For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution Thermo Fisher Scientific 15140122 For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated EMD Millipore SCGP00525 For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine VWR 10-013-CV For cell and tissue culture
Fetal bovine serum BioSera FBS2000 Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt MP Biomedicals 0219453680 - 100 MU Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) VWR 82050-598 For cell culture
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282 For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 472301 For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL Fisher Scientific 367820 For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle Fisher Scientific 354221 For human serum collection
Thrombin, bovine origin Sigma-Aldrich T4648-1KU For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin Sigma-Aldrich F8630-5G For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A3428 For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid Sigma-Aldrich 07260-100g For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960-5G Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline Sigma-Aldrich P5607-25G Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1 Peprotech 100-21 Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized EMD Millipore SCGPU02RE For reagent sterilization
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-212 Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde Sigma-Aldrich 39070-50g For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate Sigma-Aldrich 402869-100g For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline Sigma-Aldrich H54409-100g For hydroxyproline assay
1-propanol Sigma-Aldrich 279544-1L For hydroxyproline assay
Perchloric acid Sigma-Aldrich 311421-250ml For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial EMD Millipore AX0073-9 For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous Sigma-Aldrich 244511-1L For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-656 For hydroxyproline assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
  2. Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
  3. Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
  4. Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
  5. Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
  6. Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
  7. Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
  8. Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
  9. Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
  10. Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
  11. Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
  12. Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
  13. Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
  14. Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
  15. Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
  16. Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
  17. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).
  18. Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
  19. Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
  20. Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
  21. Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
  22. Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
  23. Woessner, J. F. Jr The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
  24. Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
  25. Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
  26. Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
  27. Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
  28. Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
  29. Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
  30. Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
  31. Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
  32. Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists? J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
  33. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  34. Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
  35. Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).

Tags

Bioengineering vävnadsteknik främre korsband dragprovning kollagen motion endogen biokemisk miljö
Behandling av ligamentkonstruktioner med träningskonditionerad serum: en translationsvävnadsteknikmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D.… More

Lee-Barthel, A., Baar, K., West, D. W. D. Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model. J. Vis. Exp. (124), e55339, doi:10.3791/55339 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter