विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones साथ nucleosomes का पुनर्गठन
Summary
इस प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones युक्त nucleosomes के पुनर्गठन का वर्णन है। इसी समय, asymmetrically के बाद translationally संशोधित nucleosomes एक premodified हिस्टोन प्रतिलिपि उपयोग करने के बाद उत्पन्न किया जा सकता है। इन तैयारियों आसानी से दोनों बहन histones पर संशोधन crosstalk तंत्र का अध्ययन करने के लिए, एक साथ उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है।
Abstract
Asymmetrically संशोधित nucleosomes एक हिस्टोन की दो प्रतियां (बहन histones) बाद translational संशोधनों (PTMs) के अलग सेट के साथ सजाया होते हैं। वे नव स्थापना और कार्यात्मक प्रभाव की अज्ञात साधन के साथ प्रजातियों की पहचान कर रहे हैं। वर्तमान विश्लेषणात्मक तरीकों nucleosomal बहन histones पर PTMs की प्रति विशेष घटना का पता लगाने के लिए अपर्याप्त हैं। इस प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones युक्त nucleosomes की इन विट्रो पुनर्गठन के लिए एक जैव रासायनिक विधि प्रस्तुत करता है। उत्पन्न परिसर में भी विषम संशोधित किया जा सकता, हिस्टोन subcomplexes की refolding के दौरान एक premodified हिस्टोन पूल सहित के बाद। इन विषम nucleosome तैयारियों आसानी से हो सकता है संशोधन पार बात परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग asymmetrically पूर्व शामिल PTM द्वारा लगाए गए तंत्र का अध्ययन करने हिस्टोन संशोधित एंजाइमों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की। विशेष रूप से, में संशोधन प्रतिक्रियाओंवास्तविक समय एनएमआर सहसंबंध के प्रयोगों के विभिन्न प्रकार, संबंधित आइसोटोप प्रकार अनुरूप प्रदर्शन से दो बहन histones पर स्वतंत्र रूप से मैप किया जा सकता है। इस पद्धति crosstalk तंत्र है कि nucleosomal परिसरों पर गठन और विषम PTM पैटर्न के प्रचार-प्रसार के लिए योगदान अध्ययन करने के लिए साधन प्रदान करता है।
Introduction
यूकेरियोटिक डीएनए कसकर क्रोमेटिन में सेल नाभिक के भीतर पैक किया जाता है। क्रोमेटिन के मौलिक निर्माण खंड nucleosome कोर कण जिसमें एक octameric दो प्रतियां चार कोर histones के प्रत्येक (H3, H4, H2A, H2B) से बना परिसर के आसपास लिपटे डीएनए के ~ 147 बीपी है। हिस्टोन प्रोटीन बाद translational संशोधनों (PTMs) की अधिकता के बंदरगाह। ये सहसंयोजक प्रतिस्थापन, दोनों सीधे प्रणाली के भौतिक रसायन शास्त्र को प्रभावित करने से और परोक्ष रूप से क्रोमेटिन-remodeling गतिविधियों 1, 2, 3 की भर्ती द्वारा क्रोमेटिन संरचना में परिवर्तन के लिए प्रेरित। उन तरह से, हिस्टोन PTMs क्रोमेटिन पहुंच को नियंत्रित करने और, इसलिए, सभी डीएनए आधारित सेलुलर कार्यों 4 विनियमित।
PTMs मुख्य रूप से nucleosome-कोर शामिल histo के असंरचित एन टर्मिनल खंडों (पूंछ) पर हिस्टोन संशोधित एंजाइम सिस्टम द्वारा स्थापित कर रहे हैंएनईएस। हिस्टोन पूंछ के अपेक्षाकृत छोटे दृश्य पर कई संशोधन साइटों के कारण, PTMs उत्प्रेरण या बाद में संशोधन प्रतिक्रियाओं, एक प्रभाव संशोधन पार बात 5 के रूप में जाना अवरुद्ध करके एक दूसरे को प्रभावित करते हैं। nucleosome के समग्र सममित वास्तुकला की वजह से, संशोधन प्रतिक्रियाओं और crosstalk तंत्र प्रत्येक nucleosomal हिस्टोन (बहन histones) की दो प्रतियां पर इसी तरह घटित करने के लिए लगा रहे थे। इस अवधारणा को हाल ही में चुनौती दी गई थी और बाद में गलत साबित। विशेष रूप से, मुक्त हिस्टोन H3 पूंछ पेप्टाइड्स पर और nucleosomes पर इन विट्रो enzymatic assays प्रदर्शन किया है कि H3 kinases का एक सेट एक असममित ढंग 6 में पेश फोस्फोराइलेशन। इसके अतिरिक्त, आत्मीयता शुद्धि आधारित नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण कोशिकाओं 7 के कई प्रकार में asymmetrically H3-methylated nucleosomes के अस्तित्व का पता चला। इस प्रकार, asymmetrically संशोधित nucleosomes उपन्यास प्रजातियों का गठन, औरउपकरण तंत्र है कि उनके निर्माण को नियंत्रित करने और crosstalk प्रभाव है कि इस विषमता लागू हो सकता है विश्लेषण करने के लिए उजागर करने के लिए आवश्यक हैं।
आमतौर पर, पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण हिस्टोन PTMs पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसकी आसान आवेदन के बावजूद पश्चिम बंगाल विशिष्टता / पार जेट समस्याओं से ग्रस्त है। उस के शीर्ष पर, यह एक साथ बहु-PTM विश्लेषण और संशोधन प्रतिक्रियाओं 8 के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने में असमर्थ है। दूसरी ओर, एमएस विश्लेषण परिष्कृत उपकरण है कि उच्च स्तर के प्रशिक्षण की आवश्यकता को रोजगार, लेकिन उच्च विशिष्टता के साथ ही एक साथ मानचित्रण और कई PTMs 9 की मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। हालांकि, दोनों तरीकों विघटनकारी हैं और nucleosomal परिसरों विश्लेषण से पहले अलग कर रहे हैं, histones और / या हिस्टोन व्युत्पन्न पेप्टाइड्स का एक मिश्रण को जन्म दे रही है। इस हेरफेर स्वतंत्र भेद करने की क्षमता को हटासंशोधन प्रतिक्रियाओं है कि दो बहन histones में से प्रत्येक पर पाए जाते हैं और nucleosomal histones की प्रति विशेष संशोधन स्थिति रिपोर्ट करने के लिए।
परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी एक वैकल्पिक तरीका PTM प्रतिक्रियाओं नक्शा करने के लिए के रूप में विकसित हुआ। एनएमआर nondisruptive 11 है और इस तरह का पुनर्गठन मिश्रण में एक वास्तविक समय तरीके से PTM घटनाओं की निगरानी की अनुमति देता है, और भी बरकरार कोशिकाओं 10 में। 2 डी के आधार पर तेजी से डाटा अधिग्रहण के लिए दिनचर्या के साथ ही उच्च संकल्प मानचित्रण के लिए विकास असमलैंगिक परमाणु आइसोटोप लेबल (15 एन और / या 13 सी) के नमूनों के सहसंबंध तरीकों 12 PTMs के विभिन्न प्रकार के एक साथ मानचित्रण की अनुमति दी है, ऐसे के रूप में सेरीन / threonine / tyrosine फोस्फोराइलेशन, लाइसिन एसिटिलीकरण / मेथिलिकरण, और arginine मेथिलिकरण 13। जांच के तहत PTM पर निर्भर करता है, 15 या 13 सी एन-लेबलिंग जनसंपर्कotocols प्रोटीन कार्यात्मक समूह है कि एक संशोधन पत्रकार के रूप में कार्य करता है चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। नतीजतन, PTM मानचित्रण इसी कार्यात्मक समूह 'संवेदन' रासायनिक पर्यावरण पर परिवर्तन की विशेषता रासायनिक पारी विस्थापन का पालन करके किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, दोनों राष्ट्रीय राजमार्ग और सीएच रासायनिक समूहों के हित के PTM के विकास रिपोर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones युक्त nucleosomes की पीढ़ी का वर्णन है। यह एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लचीलेपन का चयन किया पुनर्गठन हिस्टोन परिसरों की शुद्धि के लिए अलग अलग प्रोटीन आत्मीयता के टैग के उपयोग के साथ दोनों 1 एच 15 एन 1 और एच 13 सी के सहसंबंध स्पेक्ट्रा का उपयोग कर PTMs नक्शा करने के लिए को जोड़ती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल nucleosome पुनर्गठन के लिए एक विशेष हिस्टोन की दो अलग अलग ताल कार्यरत हैं। इन पूल के विभिन्न आइसोटोप लेबल (एक साथ हैं <sup> 15 एन, 13 सी के साथ अन्य), और वे एक polyhistidine और एक streptavidin आत्मीयता के टैग के लिए क्रमश: जुड़े हुए हैं। नी NTA और streptavidin आधारित क्रोमैटोग्राफी के साथ मिलकर एक आत्मीयता शुद्धि योजना शुरू वोइट एट अल द्वारा इस्तेमाल किया। 7 सममित समकक्षों (चित्रा 1 ए) से विषम प्रजातियों को शुद्ध करने के लिए कार्यरत है। असममित हिस्टोन octamers, बराबर nucleosomal परिसरों (चित्रा 1 बी) को पुनर्गठित करने के लिए बाद में इस्तेमाल मानक नमक डायलिसिस विधि 14 का उपयोग कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, एक ही प्रक्रिया के माध्यम से और हिस्टोन पूल में से एक होने से पूर्व संशोधित, एक PTM asymmetrically जिसके परिणामस्वरूप nucleosomes पर शामिल किया जा सकता है। हिस्टोन संशोधित एंजाइमों और संशोधन की घटनाओं के बाद एनएमआर मानचित्रण के साथ इन substrates की प्रतिक्रिया crosstalk तंत्र के लक्षण वर्णन दोनों में सीआईएस (premodified हिस्टोन प्रतिलिपि) और में ट्रांस सक्षम (unmodifiएड हिस्टोन प्रतिलिपि) (चित्रा 1 सी)।
Protocol
Representative Results
Discussion
Nucleosome पुनर्गठन के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक 165 बीपी लंबे डीएनए 601 Widom nucleosome स्थिति अनुक्रम 20 से युक्त टेम्पलेट का इस्तेमाल करता है, लेकिन इसी तरह के प्रदर्शन डीएनए टेम्पलेट्स के विभिन्न लंबाई का उपय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक धन्यवाद डॉ फिलिप Selenko (एफएमपी-बर्लिन) गीला अंतरिक्ष प्रयोगशाला और बुनियादी सुविधाओं को उपलब्ध कराने के एक शोध अनुदान के माध्यम से काम के वित्तपोषण के लिए प्रयोगों और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) प्रदर्शन करने के लिए (लाइट 2402 / 2-1)।
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
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