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Cancer Research

कोलोरेक्टल कैंसर के ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल में ट्यूमर कोशिकाओं को प्रसारित करने का अलगाव

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/55357
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1, 1,2,3
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

Summary

हम इस मॉडल से ट्यूमर कोशिकाओं या ऑर्गोइओड्स के चूहों के सीक्यूम में इंजेक्शन और ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) को परिचालित करने के बाद के अलगाव के माध्यम से ऑर्थोपोटीक कोलोर्टेटल ट्यूमर की स्थापना का वर्णन करते हैं।

Abstract

आसान प्रयोज्यता और लागत-प्रभावशीलता के फायदे होने के बावजूद, चमड़े के नीचे के माउस मॉडल में गंभीर सीमाएं होती हैं और ट्यूमर जीव विज्ञान और ट्यूमर सेल के प्रसार को सही रूप से अनुकरण नहीं करते हैं। ऑर्थोप्ोटिक माउस मॉडल इन सीमाओं को दूर करने के लिए पेश किया गया है; हालांकि, ऐसे मॉडल तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, खासकर खोखले अंगों जैसे बड़ी आंत में ट्यूमर कोशिका तैयार करने और इंजेक्शन की मानकीकृत तकनीकों के लिए महत्वपूर्ण ट्यूमर का निर्माण करने के लिए जो मज़बूती से बढ़ते हैं और मेटास्टाजइज होते हैं

हमने कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के एक ओर्थोपोटीक माउस मॉडल विकसित किया है जो अत्यधिक वर्दी ट्यूमर विकसित करता है और ट्यूमर जीव विज्ञान के अध्ययन के साथ-साथ चिकित्सीय परीक्षणों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। या तो प्राथमिक ट्यूमर, 2-आयामी (2 डी) सेल लाइनों या 3-आयामी (3 डी) ऑर्गोइओड्स से ट्यूमर कोशिकाओं को सीकेम में अंतःक्षिप्त किया जाता है और इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता पर निर्भर करता है, अत्यधिक मेटास्टैटिक ट्यूमर बनाती है। इसके साथ - साथ,सीटीसी नियमित रूप से पाया जा सकता है। हम यहां ट्यूमर सेल की तैयारी की तकनीक का वर्णन 2 डी सेल लाइनों और 3 डी अंगोइड्स के साथ-साथ प्राथमिक ट्यूमर के ऊतक, सर्जिकल और इंजेक्शन तकनीकों के साथ-साथ ट्यूमर-असरिंग माइस से सीटीसी की अलगाव, और समस्या निवारण के लिए वर्तमान टिप्स का वर्णन करते हैं।

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) पश्चिमी देशों में कैंसर की मृत्यु के सबसे सामान्य कारणों में से एक है। 1 जबकि प्राथमिक ट्यूमर को अक्सर शोध किया जा सकता है, दूरस्थ मेटास्टेस की घटना नाटकीय रूप से पूर्वानुमान के कारण बिगड़ती है और अक्सर मृत्यु की ओर जाता है। 2 , 3 मेटास्टेसिस का जैविक सहसंबंध ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) को परिचालित करता है, जो ट्यूमर से अलग होता है, संचलन में जीवित रहता है, लक्ष्य अंग में एपिथेलियम को संलग्न करता है, अंग पर आक्रमण करता है और अंत में नए घावों के लिए बड़ा हो जाता है। 4 यद्यपि सीटीसी प्रजनन संबंधी प्रासंगिकता के लिए जाना जाता है, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 सीआरसी में उनकी अति दुर्लभता के परिणामस्वरूप उनके जीव विज्ञान को आंशिक रूप से समझा जाता है। 10

माउस मॉडल एक शक्तिशाली टी हैंकैंसर जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए ओओल शास्त्रीय, चमड़े के नीचे के ट्यूमर मॉडलों को प्राप्तकर्ता चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के चमड़े के नीचे के इंजेक्शन द्वारा उत्पादित किया जाता है, जो कि या तो प्रतिरक्षी हो सकता है (यदि syngeneic murine ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है) या immunodeficient चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल सस्ती हैं और डेटा का तेजी से उत्पादन करते हैं; उनके अंत-बिंदु ट्यूमर के विकास को आसानी से और गैर-इनवेसिली मापा जा सकता है। हालांकि, 88% नए यौगिकों ने इस तरह के मॉडल में एंटीट्यूमर गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जो नैदानिक ​​परीक्षणों में विफल होते हैं। 11 यह अंतःप्रेरणा के कारण मानव और चूहों के बीच अंतर है; हालांकि, इस विफलता का एक बड़ा हिस्सा चमड़े के नीचे माउस मॉडल के कम भविष्य कहनेवाले मूल्य के कारण है।

ऑर्थोपाइक माउस मॉडल, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं को मूल के अंग में अंतःक्षिप्त किया जाता है और इस प्रकार उनके मूल सूक्ष्म ऊर्जा में बढ़ता है, इसलिए कैंसर के अनुसंधान में इसका तेजी से उपयोग किया जाता है। 11 , 12 , 13 , 14 ऑर्थोपेनिक मॉडल न केवल स्थानीय ट्यूमर के विकास की स्थिति अनुकरण करते हैं; ट्यूमर विकास की शारीरिक रूप से सही साइट के परिणामस्वरूप, ऑर्थोपीक माउस मॉडल भी मेटास्टेसिस के यथार्थवादी सिमुलेशन की अनुमति देता है और इसलिए सीटीसी जीव विज्ञान 8 , 15 , 16 या सीआरसी में विभिन्न उपचारों के प्रति उनका जवाब देने के लिए उपयोग किया जाता है। 13 , 17

ऑर्थोपाइक माउस मॉडल का एक बड़ा नुकसान उनकी तकनीकी जटिलता है। उस अंग के आधार पर जिसमें कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, तब तक सीखने की वक्र जब तक प्रयोगकर्ता प्रजननक्षम ट्यूमर को प्रेरित करने में सक्षम नहीं होता है, तब तक यह लंबे समय तक होता है। यह विशेष रूप से कोलोरेक्टल कैंसर के मॉडल पर लागू होता है, क्योंकि ट्यूमर कोशिकाओं को आंत्र की दीवार में इंजेक्ट करने की आवश्यकता होती है, जो अक्सर छिद्र, ट्यूमर सेल रिसाव या एंडोलुमाइनल ट्यूमर सेल के नुकसान का परिणाम है। यह ऐकआरटीआईएल का लक्ष्य प्राथमिक ऊतक नमूनों, 2 डी कोशिका लाइनों और 3 डी आर्नोजेड संस्कृति से सेल तैयारी की विधि और चूहों के सिकम में उनके इंजेक्शन का वर्णन करना है। यहां वर्णित तकनीक अत्यधिक वर्दी ट्यूमर की ओर जाता है और, प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के ट्यूमर जीव विज्ञान, दूर के मेटास्टेस के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संरचना और सीटीसी के आधार पर। 15

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Protocol

यहां प्रस्तुत पशु प्रयोगों की स्वतंत्र रूप से समीक्षा की गई और उन्हें एक संस्थागत और एक सरकारी पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और इसे प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघ (एफईएलएएसए) के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया। संज्ञाहरण और दर्दनाशकता सहित पीड़ितों को कम करने के लिए या यदि आवश्यक हो, समय से पहले इच्छामृत्यु के लिए सभी संभव उपाय किए गए थे।

1. कोशिकाओं और Organoids की तैयारी

नोट: प्रत्येक इंजेक्शन के लिए 100,000 कोशिकाओं के साथ 20 μL का एक मात्रा का प्रयोग करें। रिसाव को रोकने और मानकीकृत इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम) का उपयोग करें। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए, नियमित अंतरालों पर सेल लाइन प्रमाणीकरण assays ( उदाहरण के लिए , एसटीआर प्रोफाइलिंग के माध्यम से ) आचरण करें।

  1. ताजा ऊतक से प्राथमिक सेल निलंबन की तैयारी
    नोट: हमेशा बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं। ताज़ी रूप से ताज़ा हस्तांतरणऑपरेटिंग कमरे से बर्फ पर प्रयोगशाला के लिए ऊतक को परिशोधित करना आवश्यक है ताकि कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित हो सके।
    रोगी की भलाई और इष्टतम उपचार हमेशा प्राथमिकता होना चाहिए। इसलिए, अनुसंधान के लिए ऊतक के नमूनों को ऐसे तरीके से प्राप्त किया जाना चाहिए, जो बाद के रोग संबंधी कार्य-अप और शोधित ट्यूमर की स्थिति में हस्तक्षेप न करें। ज्यादातर मामलों में, इसलिए, रोग निदान के साथ गैर हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए एक प्रशिक्षित रोगविज्ञानी द्वारा प्राप्त अनुसंधान के लिए नमूने उचित हैं।
    1. शोधित नमूनों (आदर्श रूप से ~ 1 सेमी 3 ) से बाँझ हटाने के तुरंत बाद, 50 मिलीलीटर ट्यूब में फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के 20-30 मिलीलीटर से पहले से भरा हुआ टिशू नमूना रखें। ट्यूब को बर्फ पर स्टोर करें और प्रयोगशाला में तुरंत स्थानांतरण करें।
    2. पेट्री डिश में ऊतक डालें और पीबीएस के साथ-साथ शेष खून को हटाने के लिए इसे दो बार धो लें।
    3. ऊतक को छोटे टुकड़ों (~ 2-4 मिमी) में एक स्कै के साथ काटेंएलपीएल ( जैसे , # 20 या # 36 ब्लेड के साथ)
    4. एक एकल सेल निलंबन के लिए ट्यूमर के ऊतकों को अलग करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार विसंशोधक का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एंजाइमेटिक ट्यूमर पाचन के अन्य प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    5. परिणामस्वरूप एकल-सेल निलंबन ( जैसे , कल्टर काउंटर या हेमोसाइटोमीटर) की कोशिकाओं की गणना करें।
    6. अपकेंद्रित्र (5 मिनट 1500 XG) और पीबीएस के साथ दो बार सेल निलंबन धो लें।
    7. बीएमएम में 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं को फिर से खोलें और उन्हें बर्फ पर रखें
  2. इंजेक्शन के लिए सेल लाइनों की तैयारी
    1. मानक संवर्धन परिस्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) के तहत सभी कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनें बढ़ाएं और सर्जरी के दिन उन्हें तैयार करें।
    2. कोशिकाओं को मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के अनुसार फसल डालें, कोशिकाओं की गणना करें ( जैसे , कल्टर काउंटर या हेमोसाइटेटोमीटर में) और रेक की गणना करेंइंजेक्शन के लिए पशुओं की संख्या के आधार पर सभी इंजेक्शन के लिए उक्त राशि।
    3. पिपेटिंग घाटे और इंजेक्शन सिरिंज की मृत मात्रा के खाते में वास्तविक रूप से आवश्यक मात्रा के 3-5x तैयार करें।
    4. अपकेंद्रित्र (5 मिनट 1500 ग्राम) और पीबीएस के साथ दो बार सेल निलंबन धो लें।
    5. बीएमएम में 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं को फिर से खोलें और उन्हें बर्फ पर रखें
  3. ऑर्गेनॉयड तैयारी
    नोट: सभी 3 डी संगठनों की गुणवत्ता मानक संवर्धन परिस्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) के तहत उगाई जाती है। ऑरगोऑड संस्कृति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित किए गए हैं। 18 , 1 9 , 20 पारंपरिक सेल लाइनों के समान, हम प्रति इंजेक्शन प्रति 100,000 कोशिकाओं के साथ 20 μL बीएमएम की मात्रा का सुझाव देते हैं। सर्जरी के दिन organoids तैयार हैं:
    1. निम्न माध्यम तैयार करें (निम्नलिखित संदर्भ मेंडीएमईएम / एफ 12 +++) के रूप में: उन्नत डल्बेकेडो के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) / एफ 12 + 1% इफेस (1 एम) + 1% ग्लूटामाइन (200 मिमी) + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन।
    2. 1 एमएल डीएमईएम / एफ 12 +++ के साथ 15 एमएल ट्यूब पूर्व-भरें
    3. संस्कृति प्लेट की सतह से संगठितों को ध्यानपूर्वक महाप्राणित करना और 3 से 5 कुओं की सामग्री को एक 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करना।
    4. संगठनाओं को छोटे टुकड़ों में सावधानी से तोड़ कर उन्हें विस्तारित कांच विंदुक के साथ ऊपर और नीचे पिइपेट करके
    5. ट्यूब में 5 एमएल डीएमईएम / एफ 12 +++ जोड़ें, उसके बाद 1,000 मिनट में 5 मिनट के लिए सेंटीफ्यूगेशन
    6. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला को निकालें, 600 μL एंजाइमेटिक पृथक्करण बफर में गोली resuspend और एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुओं को निलंबन स्थानांतरित।
    7. 1-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर संगठितों को भंग करने के लिए सावधानी से निलंबन ऊपर और नीचे pipet।
      नोट: माइक्रोस्कोप के माध्यम से पाचन को सत्यापित करें; यह पूरा हो गया है जब सभी सेल क्लस्टर अलग कर दिया गया हैएकल कोशिकाओं को घ।
    8. सफल पाचन पर, पाचन रोकने के लिए 1.4 एमएल डीएमईएम / एफ 12 +++ जोड़ें। फिर पचाने वाले इनोगोइड्स के सभी कुओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    9. कोशिकाओं की गणना करें और सभी इंजेक्शन के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    10. पिपेटिंग के नुकसान और इंजेक्शन सिरिंज की मृत मात्रा के खाते के लिए वास्तव में आवश्यक मात्रा के 3 - 5x तैयार करें
    11. अपकेंद्रित्र (5 मिनट 1500 XG) और पीबीएस के साथ दो बार सेल निलंबन धो लें।
    12. बीएमएम में कोशिकाओं को 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए पुन: पेश किया गया और उन्हें बर्फ पर रखें

2. Orthotopic माउस मॉडल

  1. सर्जरी के लिए प्राप्तकर्ता जानवरों की तैयारी
    नोट: प्राप्तकर्ताओं के रूप में 6-8 सप्ताहीय एनओडी.कैग-प्राकेडीसी स्किड इल 2 आरजी टीएम 1Wjl / एसजेजे (एनओडी स्किड गामा, एनएसजी) चूहों का उपयोग करें। 21 एनएसजी सबसे अधिक immunocompromised चूहों में से हैं, परिपक्व बी, टी और एन.के. कोशिकाओं की कमी के साथ कई अन्य प्रतिरक्षा डीfects। 21 वे मज़बूती से ट्यूमर विकसित करते हैं, भले ही कम सेल नंबर इंजेक्ट हो और दूर मेटास्टेसस के लिए अत्यधिक प्रवण हो। एनएसजी चूहों उत्कृष्ट प्रजनक हैं और इसे पारंपरिक विशिष्ट रोगजन्य मुक्त (एसपीएफ़) इकाइयों में रखा जा सकता है।
    1. पहली चीरा से पहले, 0.05 मिलीग्राम / किग्रा के ब्यूपेरोनोफ़िन को घिसलाकर।
    2. सामान्य संज्ञाहरण के लिए 3-3.5%% पर सेवोफोलारुना का उपयोग करें। पैर की अंगुली चुटकी प्रतिवर्त की हानि पर्याप्त संज्ञाहरण इंगित करता है
    3. कॉर्निया के desiccation से बचने के लिए आंखों के अम्ल के साथ अन्तर्विभाजित चूहों की आंखों को कवर करें।
    4. एक छोटी सी मेज पर लापरवाह स्थिति में चूहों को रोकें
    5. पेट को इलेक्ट्रिक शेवर के साथ दाढ़ी (लापरवाही क्रीम वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है) और कम से कम 3 बार क्लोरहेक्साइडिन / आयोडीन और 70% अल्कोहल से वैकल्पिक रूप से कीटाणुरहित हो सकता है।
    6. बाँझ पर्दे के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर करें।
      नोट: पिरोपरेटिव एंटीबायोटिक का उपयोग वैकल्पिक है और संस्थागत दिशानिर्देशों के अधीन है।
  2. मिडलाइन लैपरोटॉमी और सीक्यूम का एक्सपोजर
    1. निचले पेट पर त्वचा की एक छोटी सी midline चीरा (3 - 5 मिमी) बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें (स्केलपेल वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है)। संदंश के साथ पेट की दीवार की मांसपेशियों को उठाएं और कैंची के साथ सावधानी से उठाएं, इस प्रकार पेट की गुहा खुलता है।
    2. एरेमेटिक संदंश के साथ सेक्यूम को पहचानें और ध्यान से गौर करें। पेट पर सीक्यूम के अंधा समाप्त होने वाले थैली को क्रैनियल इंगित करें।
    3. एक बार बाहर निकलने पर, हर समय गर्म खारा झाड़ू का उपयोग करके सीकॉम नम रखें।
  3. ऑर्थोपेनिक इंजेक्शन, पेट और पश्चात वसूली की समाप्ति
    1. इंट्रासैल इंजेक्शन के लिए, एक 30 जी प्रवेशनी के साथ एक मानक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। माइक्रोिनेंजेक्शन पंप पर इस सिरिंज को माउंट करें, जो एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर मुड़ता है।
    2. सावधानीपूर्वक एरेमेटिक संदंश के साथ सेक्यू की टिप को समझें और धीरे-धीरे इसे नीचे की तरफ फेंक कर इसे सुखा लेंडी संदंश के एक दूसरे सेट के साथ गर्म नमक के साथ सिक्त।
    3. सीक्यूम के ऊपर सीधे प्रवेशनी की स्थिति।
    4. एक द्विनेत्री शल्य सूक्ष्मदर्शी के साथ दृश्य नियंत्रण के तहत निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    5. सिकम के बाहरी भाग के दोनों छोरों पर सेकेम को दो एट्रुमेटिक संदंश के साथ सावधानी से समझें, थोड़ा इसे फैलाएं और फिर धीरे धीरे उस नरभावर पर खींच कर जो समानांतर और सीधे ऊपर स्थित है। पूरे आंत्र दीवार (इसलिए लुमेन में कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने) के साथ-साथ प्रवेश के शुरुआती बिंदु से परे सेरोसा को छिद्रित करने के लिए नहीं, यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि इससे रिसाव और पेरिटोनियल प्रसार होता है।
      1. आंत्र को प्रवेशनी की ओर ले जाएं, आंत्र की ओर प्रवेशनी नहीं। दो संदंश के बीच आंत्र को पकड़कर फैलाएं सर्जरी के हाथों को भूख को कम करने के लिए सतह पर आराम करना चाहिए।
    6. सेरोसा के बीच कोशिकाओं को इंजेक्षन (वें से ऊपर बहुत पतली, पारभासी परत के रूप में देखा गयाई इनट्र्रामर रक्त वाहिकाओं) और मांसलिकाएं। प्रवेशनी को रक्त वाहिकाओं से ऊपर और पतली पारदर्शी झिल्ली के नीचे रखा जाना चाहिए।
    7. कंन्यूला आंत्र दीवार के अंदर है, जबकि कंपने को कम करने के लिए इंजेक्शन शुरू करने के लिए एक पैर स्विच का उपयोग करें।
    8. प्रवेशनी की स्थिति में एक बार, इंजेक्शन शुरू करें। 20 एस की अवधि का उपयोग करें, जिसके परिणामस्वरूप पंप के नियंत्रण इकाई पर 1 μL / s की स्थापना होती है।
      नोट: क्षतिग्रस्त रक्त वाहिन में या उसके पास के इंजेक्शन से इंटेरेवस्कुलर प्रसार और दूर के मेटास्टेसिस की ओर बढ़ जाता है और इस तरह से बचा जाना चाहिए।
    9. इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, इसे पीछे से खींचकर कैनुला को ध्यान से हटा दें
    10. सिकम के नीचे एक सूखा झाड़ू रखें, और फिर लीक कोशिकाओं को बोलने के लिए आसुत जल के साथ सेक्यूम को कुल्ला करना और इस प्रकार कृत्रिम पेरिटोनियल प्रसार को रोकना।
  4. पेट और पश्चात वसूली की समाप्ति
    1. आर के बादInsing, धीरे cecum उदर गुहा को वापस।
    2. पेट की दीवार को 6-0 से तेजी से अवशोषित करने वाला चलने वाला सामान बंद करें
    3. सर्जिकल घाव क्लिप के साथ त्वचा को बंद करें।
    4. एक गर्म नक्शा पर माउस को 38 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें जब तक कि इसे संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक नहीं किया गया हो।
    5. निम्नलिखित 48 घंटे के लिए चूहों की पश्चात की स्थिति का ध्यान रखें। संकट के मामले में, प्रत्येक 12 घंटे में 0.05 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूपेनोरॉफ़िन के साथ इलाज करें।
    6. ट्यूमर के विकास के कारण संकट के लक्षणों के लिए कम से कम एक बार चूहों की निगरानी करें।

3. पूरे रक्त के नमूनों से ट्यूमर कोशिकाओं को परिचालित करने का अलगाव

नोट: अनैतिकता वाले चूहों पर ट्रांसकाएंटिड कार्डियाक पेंचचर द्वारा रक्त प्राप्त करें, इसके बाद सुन्नुमापन होता है। आदर्श रूप से, 1,000 μL रक्त एक एंटीकोअगुलंट (एथिलीनैमियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) या हेपरिन) के 100 μL के साथ प्रीरिल्ड सिरिंज में खींचा जाता है। एंटी-मानव-एपीसीएएम (उपकला कोशिका आसंजन का प्रयोग करेंअणु) सीटीसी की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी। यह बहुत अच्छी तरह से काम करता है अगर मानव उपकला सेल लाइन माउस मॉडल में उपयोग किया जाता है अन्य उपकरणों के लिए, विभिन्न एंटीबॉडी आवश्यक हो सकते हैं

  1. सीटीसी संवर्धन:
    1. 5 एमएल घनत्व ढाल के माध्यम से 15 एमएल ट्यूब पूर्व-भरें और 15 एमएल ट्यूब में रक्त को ध्यान से ट्रांसफर करें।
    2. अपकेंद्रित्र (ब्रेक के बिना 300 ग्राम में 30 मिनट) और ध्यान से ऊपरी सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    3. बाकी 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र (15 मिनट, ब्रेक के साथ 300 xg) में डालें।
    4. मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (बाकी को त्यागें) वाले इंटरफेस को पुनर्प्राप्त करें और पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
    5. 200 μL पीबीएस / 1% EDTA में रीसेट करें और 4 μL एपकाम एंटीबॉडी जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 20 मिनट सेते हैं।
  2. स्क्रीनिंग और चयन
    1. निम्नलिखित बफर तैयार करें (नीचे बफर के रूप में संदर्भित किया गया है): पीबीएस + 10% भ्रूण का बछड़ा सीरम (एफसीएस) + 1% पेनिसिलिन / एसट्रेप्टोमाइसिन (1%) + 0.8% EDTA।
    2. एक 6 सेमी बाँझ पेट्री डिश (डिश में फैलाने से तरल पदार्थ को रोकता है) में एक ~ 1 सेमी सर्कल को आकर्षित करने के लिए पीएपी पेन का उपयोग करें, और इस सर्कल में 700 बर्गर के बफर को पिपेट करें।
    3. सर्कल के भीतर 700 μL पिकिंग बफर के लिए 50 μL सेल निलंबन जोड़ें। माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की घनत्व की जांच करें नमूना अलग व्यंजन में विभाजित करें यदि यह बहुत घना है।
    4. कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए प्रतीक्षा करें (~ 5 मिनट)।
    5. सना हुआ (= एपीएसीएएम पॉजिटिव) कोशिकाओं के लिए सेल निलंबन की गिरावट स्क्रीन।
    6. एक बार कोशिका पाए जाने के बाद, माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ सेल उठाओ और इसे 50 μL बफ़र में लगाया जाता है जो कि नीचे की ओर के विश्लेषण ( उदाहरण के लिए , आरएनए निष्कर्षण बफर या संवर्धन माध्यम) पर निर्भर करता है।
    7. इच्छित डाउनस्ट्रीम के विश्लेषण के आधार पर, एपकाम-नकारात्मक कोशिकाओं और / या मध्यम को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अलग करें।
    8. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ( उदाहरण के लिए , सेल संस्कृति, पीसीआर) के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

इस मॉडल में कोलोर्टेक्टल ट्यूमर के सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्पादन गंभीर रूप से स्पिलज या रिसाव के बिना कोशिकाओं के सटीक इंजेक्शन पर निर्भर करता है। यदि यह हासिल किया जाता है, तो यह मॉडल बेहद विश्वसनीय है और कृत्रिम पेरीटोनियल प्रसार में बहुत कम परिणाम मिलता है। ट्यूमर के साथ ही उनके प्रसार के पैटर्न का विकास कैनेटीक्स इस्तेमाल किए गए ऑर्गनाइइड्स और कोशिकाओं के जीव विज्ञान पर निर्भर करता है। [15] एचसीटी 116 कोशिकाओं को इस मॉडल, SW620 सेल फॉर्म ऑर्थोपीक ट्यूमर में मज़बूती से यकृत में मेटास्टेसिस किया जाता है, लेकिन मेटास्टासिस नहीं होता है। 15

इस मॉडल में एचसीटी 1111 कोशिकाओं का उपयोग मज़बूती से ट्यूमर सेल इंजेक्शन के 35 दिनों के भीतर रोगी चूहों में होता है। प्राथमिक ट्यूमर आकार में लगभग 10 मिमी ( चित्रा 1 ए और चित्रा 2 ए ), जिगर मेटास्टेस ( चित्रा 1 बी Ong> और चित्रा 2 बी ), फेफड़े मेटास्टेसिस ( चित्रा 1 सी और चित्रा 2 सी ) और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं ( चित्रा 3 ) लगभग हमेशा मौजूद हैं। ट्यूमर सेल इंजेक्शन CTCs उच्च आवृत्ति और मात्रा में मौजूद हैं और आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण ( चित्रा 3 ) के लिए पृथक किया जा सकता है 35 दिनों के बाद, एचसीटी 116 ट्यूमर के चूहों में।

आकृति 1
चित्रा 1: विच्छेदन के बाद मैक्रोस्कोपिक पिक्चर 35 दिनों एनसीजी चूहे में एचसीटी 116 मानव सीआरसी कोशिकाओं के ऑर्थोपेनिक इंजेक्शन के बाद। ( ए ) सीक्यूम में प्राथमिक ट्यूमर (धराशायी पंक्ति) ( बी ) एकाधिक मेटास्टेस के साथ जिगर। ( सी ) फेफड़े मेटास्टेसिस (तीर)1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 1 में दिखाए गए अंगों के हिस्टोलॉजिकल चित्र ( ए ) प्राथमिक ट्यूमर (एच एंड ई) ( बी ) लीवर मेटास्टेसिस (एच एंड ई) ( सी ) फेफड़े के मेटास्टैसिस (एंटी-एपीसीएएम इम्यूनोहिस्टोकेमस्ट्री)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: ट्यूमर कोशिकाओं को परिचालित करना (एनसीजी चूहे में एचसीटी 116 कोशिकाओं, ट्यूमर सेल इंजेक्शन के 35 दिन बाद)। उज्ज्वल क्षेत्र ( ए बी )) की छवियों में सीटीसी की परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) अंश। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

चमड़े के नीचे के माउस मॉडल में अपने प्रीक्लिन्नीक साबित गतिविधि के बावजूद, महान उपन्यास संयुग्म नैदानिक ​​परीक्षणों में विफल होते हैं और क्लिनिक तक कभी नहीं पहुंचते। 11 ट्यूमर के जीव विज्ञान और विकास पैटर्न को सटीक ढंग से अनुकरण करने के लिए चमड़े के नीचे के माउस मॉडल की यह स्पष्ट कमी ने सीधे अंग में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के आधार पर ऑर्थोपीक माउस मॉडल के विकास के लिए प्रेरित किया है।

ऑर्थोपाइक माउस मॉडल, चमड़े के नीचे के मॉडल से अधिक सटीक और ठोस ट्यूमर के जीव विज्ञान को प्रसारित करने में सक्षम हैं। [15] हालांकि, प्रमुख नुकसान तकनीकी रूप से मांग वाले अंगों जैसे खोखले अंगों के साथ-साथ ट्यूमर के विकास की तकनीकी तौर पर मांग की निगरानी के लिए खराब प्रजननशीलता हैं। हमारे मॉडल में, इसलिए हमने ट्यूमर आकार पर दोहराया इमेजिंग प्रक्रियाओं के बजाय पूर्व-निर्धारित समय बिंदु पर ध्यान केंद्रित किया है, जो तकनीकी की संख्या को सीमित करता हैलिक्विड विस्तृत और जानवरों की तनावपूर्ण परीक्षाओं के लिए यहां वर्णित मॉडल का उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है जैसे कि ट्यूमर सेल लाइनों के लक्षण वर्णन, 15 ट्यूमर जीव विज्ञान की जांच और प्रसार तथा चिकित्सीय परीक्षण। 17 स्पष्ट अंत बिंदु प्राथमिक ट्यूमर का आकार और दूर के मेटास्टेस की संख्या हैं, लेकिन सीटीसी संख्या 17 या इमेजिंग रूपरेखाओं जैसे अधिक विस्तृत अंत बिंदुओं को भी नियोजित किया जा सकता है।

हमारे प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण चरण है सबरोससल ट्यूमर सेल इंजेक्शन इसे अभ्यास की आवश्यकता होती है और सीधे दृश्य नियंत्रण के तहत हर समय प्रदर्शन किया जाना चाहिए। अगर जमा कहीं और है, लेकिन सांसो के नीचे लेकिन श्लेष्म के ऊपर, या तो सभी या अप्रत्याशित विकास और प्रसार में कोई ट्यूमर वृद्धि नहीं होगी, न ही परिणामों को अतुलनीय बना देगा ट्यूमर के विकास की कमी के लिए अन्य संभावित कारणों में गैर-व्यवहार्य कोशिकाएं ( जैसे </ Em>, कोशिकाओं के फसल और इंजेक्शन के बीच लंबे समय तक अवधि के कारण) या नहीं पूरी तरह से syngeneic चूहों। यह संभव है यदि C57Bl / 6 चूहों का उपयोग किया जाता है; चूंकि सी 57 बीएल / 6 ( जैसे , सी 57 बीएल / 6 जे और सी 57 बीएल / 6 एन) के कई पदार्थ हैं, जो अलग-अलग आनुवंशिक और फेनोटाइपिक मतभेद दिखाते हैं 22 जो ट्यूमर में भी प्रतिबिंबित होते हैं 23

यहां पर अत्यधिक नियंत्रित इंजेक्शन तकनीक का उल्लेख किया गया है कि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर के विकास और प्रसार और पहले वर्णित ऑर्थोपीक मॉडल से इस मॉडल को अलग करता है। 24 इसके अलावा, ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद नाकामी रूप से कृत्रिम पेरीटोनियल प्रसार की दर कम हो जाने पर आसुत जल के साथ सेक्यूम को धोया जाता है; इसलिए यदि हमारे मॉडल में पेरिटाइनियल कार्सिनोमेटोसिस होता है, तो इट्रोजेनिक ट्यूमर सेल रिसाव के बजाय सेल लाइन के जीव विज्ञान का नतीजा हो सकता है।

इस मी की सीमाएंOdel प्राप्तकर्ता चूहों जो प्रतिरक्षी होना चाहिए अगर मानव कोशिका लाइनों का उपयोग किया जाना है। यह प्रतिरक्षाविज्ञान के अध्ययन में मॉडल के आवेदन को गंभीर रूप से सीमित करता है। हालांकि, इस सीमा को सिनेनिक मूरिन सेल लाइनों या ऑर्गोइड्स (अप्रकाशित डेटा) के उपयोग से दूर किया जा सकता है। एक और सीमा सेल लाइनों स्वयं का उपयोग स्वयं है ट्यूमर सेल लाइनें अक्सर अत्यधिक ऐनाप्लास्टिक होती हैं, जो मूल ट्यूमर के जीवविज्ञान की उनकी प्रतिनिधित्व के बारे में प्रश्न छोड़ती हैं। यह सीमा आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडलों (जीईएमएम) में मौजूद नहीं है, जो टिशू-विशिष्ट ऑन्कोजेनिक म्यूटेशनों की शुरूआत से एक नया ट्यूमर विकसित करती है। 12 इस तरह के GEMM आमतौर पर सशर्त जर्म-लाइन म्यूटेशन ( उदाहरण के लिए एक एपसी जीन) और उत्परिवर्तनों के मध्य-मध्यस्थता सक्रियण पर आधारित होते हैं, या तो एडीनो-क्रे 25 , 27 , 28 या एक ऊतक के विशिष्ट प्रमोटर ड्राइविंग चालन के साथ स्थानीय संक्रमण द्वारा।अभिव्यक्ति। 29 , 30 , 31 हालांकि, इस तरह के मॉडल को अक्सर व्यापक क्रॉसिंग की आवश्यकता होती है और एक उच्च चर जीव विज्ञान है अगर प्रस्तुत कक्ष में प्राथमिक सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो निम्न प्रस्तुतीकरण की सीमा को हमारे मॉडल के अन्य लाभों जैसे हानिकारक और रिश्तेदार लागत-प्रभावशीलता के नुकसान के बिना दूर किया जा सकता है।

यहां प्रस्तावित तकनीक का एक और सीमा एक सतह मार्कर के रूप में EpCAM पर निर्भरता है। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि एपीसीएएम ईएमटी के दौरान खो सकता है और यह कि सीटीसी का एक अंश है जो एपीसीएएम नकारात्मक है। 10 , 15 इसलिए, प्रयोग के उद्देश्य और इंजेक्शन के लिए उपयोग की गई सेल लाइनों, पहचान के अन्य तरीकों ( उदाहरण के लिए , इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं के जीएफपी-लेबलिंग) का उपयोग किया जा सकता है।

अंत में, यहां प्रस्तुत मॉडल cबृहदान्त्र में ट्यूमर के मूल सूक्ष्म ऊर्जा के संदर्भ में ट्यूमर के विकास और प्रसार का अध्ययन करने के लिए एक लचीला उपकरण लगाया जाता है। अगर मैटैस्टैटिक सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो यह रक्त धारा में सीटीसी सहित सीआरसी के लिए सभी प्रासंगिक स्थलों में ट्यूमर सेल के प्रसार को ईमानदारी से पेश करता है। इसलिए ट्यूमर के विकास और प्रसार के दौरान फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन करने और सीआरसी में सीटीसी के बार-बार अलगाव और लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए यह एक उपयोगी उपकरण है। 15

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (हम 3548 / 4-1) और रोलाण्ड-अर्नस्ट-स्टिटंग फर गेशुन्थिट्विसेन (1/14) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

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References

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