Summary
Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.
Abstract
Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, subkutan fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru bir şekilde simüle etmemektedir. Ortotopik fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller teknik olarak özellikle büyük bağırsak gibi içi boş organlarda talep ederler. Güvenilir bir şekilde büyüyen ve metastaz yapan tek tip tümörler üretmek için, standartlaştırılmış tümör hücresi hazırlama teknikleri ve enjeksiyon önemlidir.
Oldukça üniform bir tümör geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen bir ortotopik fare modelinde kolorektal kanser (CRC) geliştirdik. Primer tümörler, 2 boyutlu (2D) hücre dizileri veya 3 boyutlu (3D) organoidlerden gelen tümör hücreleri çekum içine enjekte edilir ve enjekte edilen tümör hücrelerinin metastatik potansiyeline bağlı olarak oldukça metastatik tümörler oluşturur. Ek olarak,CTC'ler düzenli olarak bulunabilir. Burada, 2D hücre çizgilerinin ve 3D organoidlerin yanı sıra primer tümör dokusundan, cerrahi ve enjeksiyon tekniklerinin yanı sıra tümörlü farelerden CTC'lerin izolasyonu ve mevcut sorun giderme ipuçlarından tümör hücresi hazırlama tekniğini açıklıyoruz.
Introduction
Kolorektal kanser (CRC), batı ülkelerinde kanser ölümünün en yaygın nedenlerinden biridir. Primer tümör genellikle rezeke edilebilir olsa 1, uzak metastaz oluşumu önemli ölçüde ölüme götürecek sıklıkla prognozu kötüleştirir ve. 2 , 3 Metastazın biyolojik korelasyonu, tümörden ayrılan dolaşımdaki tümör hücreleridir (CTC'ler), dolaşımda hayatta kalır, hedef organdaki epitele bağlanır, organı istila eder ve nihayetinde yeni lezyonlara doğru büyür. Dolaşımda bulunan tümör hücreleri prognostik alaka, 5, 6, 7, 8, olduğu bilinmektedir, ancak 4, 9 biyoloji kısmen CRC bunların çok nadir bir sonucu olarak anlaşılmaktadır. 10
Fare modelleri güçlü bir tOol kanser biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek. Klasik, subkütan tümör modelleri, alıcı camlara tümör hücrelerinin subkütan enjeksiyonuyla üretilir; bu, bağışıklık kazandıran (eş merkezli tümör hücreleri kullanılıyorsa) veya immün yetmezlik gösterebilir. Subkütan tümör modelleri ucuzdur ve verileri hızlı bir şekilde üretir; Uç nokta tümör büyümesi kolaylıkla ve invaziv olarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu tür modellerde antitümör aktivite sergileyen yeni bileşiklerin% 88'i klinik araştırmalarda başarısız olur. 11 Bu kısmen insanlarla fare arasındaki farklılıklar nedeniyle; Bununla birlikte, bu başarısızlığın büyük bir kısmı subkutan fare modellerinin düşük prediktif değerinden kaynaklanmaktadır.
Tümör hücrelerinin orijin organına enjekte edildiği ve böylece orijinal mikro ortamda büyüdüğü ortotopik fare modelleri, kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılır. 11 , 12 , 13 , 14 Ortotopik modeller sadece lokal tümör büyüme koşullarını simüle etmekle kalmaz; Ortotopik fare modelleri, tümör büyümesinin anatomik olarak doğru bir yerinin bir sonucu olarak, metastazın gerçekçi simülasyonunu sağlar ve bu nedenle CRC'deki farklı tedavilere 8 , 15 , 16 veya CTC biyolojisini incelemek için kullanılır. 13 , 17
Ortotopik fare modellerinin en büyük dezavantajı, teknik karmaşıklığıdır. Hücrelerin enjekte edileceği organa bağlı olarak, deneyci, tekrarlanabilir tümörleri indükleyene kadar öğrenme eğrisinin oldukça uzundur. Bu, özellikle tümör hücrelerinin bağırsak duvarına enjekte edilmesi gerektiği için kolorektal kanser modelleri için geçerlidir, bu genellikle perforasyon, tümör hücresi sızıntısı veya endoluminal tümör hücre kaybına neden olur. Bu birBu makale, birincil doku numunelerinden, 2D hücre çizgilerinden ve 3D organoid kültüründen hücre hazırlama yöntemini ve bunların farelerin çekumuna enjekte edilmesini amaçlamaktadır. Burada tarif edilen teknik, enjeksiyon için kullanılan hücre hattının tümör biyolojisine bağlı olarak, alıcı farelerde uzak metastazların ve CTC'lerin tekrarlanabilir formasyonuna yol açarak, oldukça tekdüze tümörlere yol açar. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada sunulan hayvan deneyleri bağımsız olarak gözden geçirildi ve bir kurumsal ve resmi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından izin verildi ve FELASA ( Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu ) kurallarına göre gerçekleştirildi. Anestezi ve analjezi ya da gerekirse erken ötanazi dahil olmak üzere acıyı en aza indirmek için olası tüm önlemler alındı.
1. Hücrelerin ve Organoidlerin Hazırlanması
NOT: Her bir enjeksiyon için 100.000 hücre ile 20 μL'lik bir hacim kullanın. Sızıntıyı önlemek ve standart enjeksiyon yapılmasını sağlamak için bazal membran matrisini (BMM) kullanın. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için düzenli aralıklarla hücre hattı kimlik doğrulama analizlerini yapın ( örneğin STR profillemesi yoluyla ).
- Taze dokulardan primer hücre süspansiyonlarının hazırlanması
NOT: Steril koşullar altında daima çalışın. Yeni derhal transferHücrelerin yüksek canlılığını sağlamak için ameliyathaneden buz üzerinde laboratuara rezeke edilen doku gereklidir.
Hastanın refahı ve optimal tedavisi her zaman öncelik olmalıdır. Bu nedenle, araştırma için doku numuneleri, sonraki patolojik inceleme ve rezeke edilen tümörün evrelemesine müdahale etmeyecek bir şekilde elde edilmelidir. Çoğu durumda, patolojik tanıya müdahale edilmemesi için, eğitimli bir patolog tarafından elde edilen araştırma numunelerinin olması mantıklıdır.- Rezeke edilen örneğin (ideal olarak ~ 1 cm 3 ) steril çıkarılmasından hemen sonra, doku örneğini, önceden 20-30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 50 mL tüp içine yerleştirin. Tüpü buz üzerinde saklayın ve derhal laboratuara nakledin.
- Doku bir Petri kabına koyun ve kalan kanları çıkarmak için iki kez PBS ile yıkayın.
- Dokuyu küçük parçalar halinde (~ 2-4 mm) bir sca ile kesinLpel ( örneğin # 20 veya # 36 bıçakla).
- Tümör dokusunu tek hücreli bir süspansiyona daha da ayırmak için ayrıştırıcıyı üreticinin talimatlarına göre kullanın. Alternatif olarak, enzimatik tümör sindiriminin diğer protokollerini kullanın.
- Elde edilen tek hücreli süspansiyonun hücrelerini sayın ( örn. , Bir coulter sayacı veya bir hemocytometer).
- Santrifüj (1,500 xg'de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın.
- 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda BMM'deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın.
- Enjeksiyon için hücre hatlarının hazırlanması
- Standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) tüm kolorektal kanser hücre çizgilerini büyütün ve ameliyat gününde hazırlayın.
- Hücreleri standart hücre kültürü protokollerine göre hasat edin, hücreleri sayın ( örn . Bir coulter sayacı veya hemocytometer'de) ve gerekliliğini hesaplayınEnjekte edilecek hayvan sayısına bağlı olarak tüm enjeksiyonların miktarı.
- Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3-5x'i hazırlayın.
- Santrifüj (1,500 g'da 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın.
- 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda BMM'deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın.
- Organoit preparasyonu
NOT: Tüm 3D organoid kültürler, standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) yetiştirilir. Organoid kültürü için ayrıntılı protokoller daha önce yayınlanmıştır. 18 , 19 , 20 Konvansiyonel hücre hatlarına benzer şekilde, enjeksiyon başına 100.000 hücre ile 20 uL BMM hacmi önermekteyiz. Organoidler ameliyat gününde aşağıdaki şekilde hazırlanır:- Aşağıdaki ortamı hazırlayın (aşağıda belirtilenlerGelişmiş DMEM / F12 +% 1 HEPES (1M) +% 1 Glutamin (200 mM) +% 1 Penisilin / Streptomisin.
- 15 mL tüpleri 1 mL DMEM / F12 +++ ile önceden doldurun.
- Kültür plakasının yüzeyinden organoidleri dikkatlice aspire edin ve 3 ila 5 kuyu içeriğini bir 15 mL tüp içine aktarın.
- Organoidleri, genişletilmiş bir cam pipetle aşağı yukarı pipetleyerek dikkatli bir şekilde daha küçük parçalara ayırın.
- Tüp 5 mL DMEM / F12 + + + ekleyin, bunu takiben 5 dakika 1000 xg'de santrifüj uygulanır.
- Santrifüjden sonra süpernatantı alın, pelleti 600 μL enzimatik ayrışma tamponu içinde tekrar süspansiyon haline getirin ve süspansiyonu bir 6 oyuklu plakalardan birine iyi bir şekilde aktarın.
- 1-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra organoidleri çözmek için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: Mikroskop ile sindirimi doğrulayın; Tüm hücre kümeleri ayrıştığında tamamlanırD tek hücrelere. - Sindirim işlemini başarıyla tamamladıktan sonra sindirimi durdurmak için 1.4 mL DMEM / F12 +++ ekleyin. Daha sonra sindirilmiş organoidlerin tüm kuyularını 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri sayın ve tüm enjeksiyonlar için gerekli miktarı hesaplayın.
- Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3 - 5 katı kadarını hazırlayın
- Santrifüj (1,500 xg'de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın.
- BMM'deki hücreleri 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyona kadar yeniden askıya alıp buzda tutun.
2. Ortotopik Fare Modeli
- Ameliyat için alıcı hayvanların hazırlanması
NOT: Alıcılar olarak 6-8 haftalık NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gama, NSG) farelerini kullanın. 21 NSG, olgun B, T ve NK hücrelerinden yoksun en bağışıklığı baskılanmış fareler arasındadır, bunun yanında çoklu bağışıklık sistemi de fazladırtama yaptığı. 21 Onlar güvenilir düşük hücre sayıları enjekte bile tümörleri büyümeye ve uzak metastaz son derece yatkındır. NSG fareleri mükemmel yetiştiricilerdir ve geleneksel spesifik patojen içermeyen (SPF) birimler içerisinde tutulabilirler.- İlk insizyon öncesinde subkutan olarak 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
- Genel anestezi için sevofluran'ı% 3-3.5 hacimde kullanın. Parmak çakma refleksi kaybı, yeterli anestezi anlamına gelir.
- Korneanın kurutulmasını önlemek için anestezi uygulanmış farelerin gözlerini oftalmik merhemle örtün.
- Fareleri küçük bir masanın üzerinde yatay bir konumda tutun.
- Karını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin (alternatif olarak kaşıntı kremi kullanılabilir) ve en az 3 kez klorheksidin / iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin.
- Cerrahi alanı steril perdeler ile örtün.
NOT: Perioperatif antibiyotik kullanımı isteğe bağlıdır ve kurumsal yönergelere tabidir.
- Orta hat laparotomisi ve çekumun maruziyeti
- Alt karın cildinde küçük bir orta hat kesisi (3-5 mm) yapmak için makas kullanın (alternatif olarak kepek kullanılabilir). Forseplerle karın duvar kaslarını kaldırın ve makasla dikkatli bir şekilde kesip karın boşluğunu açın.
- Atrofik forseps ile çekumun belirlenmesi ve dikkatli bir şekilde dışa vurulması. Kornere işaret eden karnın üzerindeki çekumun körü kesecek keseğini kafa yuvasına yerleştirin.
- Dışa aydınlatıldıktan sonra, çekmeceyi sıcak salin svapları kullanarak nemli tutun.
- Ortotopik enjeksiyon, karın kapanması ve postoperatif iyileşme
- İntracekal enjeksiyon için, 30 G kanül içeren standart bir 1 mL şırınga kullanın. Bu şırıngayı, bir mikromanipülatöre monte edilen bir mikroenjeksiyon pompasına monte edin.
- Çekumatik forseps ile çekumun ucunu dikkatlice tutun ve aşağı doğru vurarak hafifçe pürüzsüz hale getirinD ikinci kez forseps ile sıcak salinle nemlendirildi.
- Kanül doğrudan çekumun üzerine yerleştirin.
- Görsel kontrol altında binoküler bir cerrahi mikroskop ile aşağıdaki adımları uygulayın.
- Çekumun dışarı çekilmiş kısmının her iki ucuna iki atravmatik forseps kullanarak çekumun dikkatli bir şekilde kavranmasını hafifçe gerin ve ardından paralel ve doğrudan yukarıda bulunan kanül üzerine yavaşça çekin. Sızıntıya ve peritoneal yayılıma yol açacağı için tüm bağırsak duvarını perfore etmek (böylece lümen içine hücreleri enjekte etmek) değil, serozayı başlangıçtaki penetrasyonun ötesine perfore etmek için de önemlidir.
- Bağırsağı kanüle doğru, bağırsağa doğru götürünüz. Bağırsağı iki forseps arasında tutun ve gerin. Sarsıntıyı azaltmak için cerrahın elleri bir yüzey üzerine oturmalıdır.
- Hücreleri seroza enjekte edin (çok ince, şeffaf astar olarak görülüyor.E intramural kan damarları) ve muskularis. Bu nedenle kanül, kan damarlarının üstünde ve yarı saydam zarın altında görsel olarak yerleştirilmelidir.
- Kanül bağırsak duvarı içerisindeyken titreme azaltmak için enjeksiyona başlamak için bir ayak anahtarı kullanın.
- Kanül yerleştirildikten sonra enjeksiyona başlayın. Pompanın kontrol ünitesinde 1 μL / s ayarla sonuçlanan 20 saniye süreyle kullanın.
NOT: Hasarlı bir kan damarına veya yakınına yapılan enjeksiyon doğrudan intravasküler yayılım ve uzak metastaz yol açar ve bu nedenle kaçınılmalıdır. - Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, kanülü geriye doğru çekerek dikkatlice çıkarın.
- Sızdırılmış hücreleri kirletmek ve böylece suni peritoneal yayılımı önlemek için çekumun altına kuru bir çubuk yerleştirin ve ardından çekumun damıtılmış suyla iyice durulayın.
- Karın kapanması ve postoperatif iyileşme
- R sonraİçeri çekerken, çekumu hafifçe karın boşluğuna geri verin.
- Karın duvarını 6-0 hızlı emilebilen koşu sütürleri ile kapatın.
- Cerrahi yara klipsleri ile cildi kapatın.
- Fareyi, anesteziden tamamen kuruyana kadar 38 ° C'ye ayarlanmış ısıtma haritasına yerleştirin.
- Farelerin postoperatif koşullarını 48 saat boyunca yakından izleyin. Sıkıntı yaşarsanız, 12 saatte bir 0.05 mg / kg buprenorfin ile tedavi edin.
- Fareler, tümör gelişimine bağlı olarak sıkıntı işaretleri için günde en az bir kez izleyin.
3. Tüm Kan Örneklerinden Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu
NOT: Anestezi uygulanmış farelerde transkutanöz kardiyak ponksiyon ile kan alın ve bunu ötanazi izlemelisin. İdeal olarak, 100 μL antikoagülan (Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) veya heparin) ile önceden doldurulmuş bir şırınga içine 1.000 μL kan çekilir. Bir anti-insan-EpCAM (epitel hücre adezyonuMolekül) antikorunu belirtir. Fare modelinde insan epitelyal hücre hatları kullanılıyorsa, bu çok iyi çalışır. Diğer aletler için farklı antikorlar gerekebilir.
- CTC zenginleştirmesi:
- 15 mL'lik tüpleri 5 mL yoğunluk dereceli ortam ile önceden doldurun ve dikkatli bir şekilde 15 mL tüp içine kan aktarın.
- Santrifüjleyin (frensiz 300 xg'de 30 dakika) ve dikkatli bir şekilde üst üst fazı çıkarın.
- Geri kalanını yeni bir 15 mL tüp içine boşaltın ve santrifüjleyin (15 dakika, frenli 300 xg).
- Mononükleer hücreleri içeren ara fazı kurtarın (gerisini atın) ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
- Pelet 200 uL PBS /% 1 EDTA içinde süspansiyon haline getirin ve 4 μL EpCAM antikoru ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
- Eleme ve toplama
- Aşağıdaki tamponu hazırlayın (aşağıda toplama tamponu olarak anılır): PBS +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 penisilin / STreptomisin (% 1) +% 0.8 EDTA.
- 6 cm'lik steril bir Petri kabında (akışkanın çanakta dağılmasını önleyen) ~ 1 cm'lik bir daire çizmek için bir PAP kalemi kullanın ve bu daire içine tampon toplamanın pipet 700 μL'ini kullanın.
- Daire içerisinde 700 mcL toplama tamponuna 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroskop ile hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin. Çok yoğunsa, numuneyi farklı yemeklere bölün.
- Hücrelerin çökelmesini bekleyin (~ 5 dak).
- Lekeli (= EpCAM-pozitif) hücreler için hücre süspansiyonunun damlasını tarayın.
- Bir hücre bulundu sonra, mikromanipülatör ile hücreyi seçin ve amaçlanan aşağı akım analizine ( örn. , RNA ekstraksiyon tamponu veya kültür ortamı) bağlı olarak 50 μL tampona koyun.
- İstenen aşağı akım analizlerine bağlı olarak, EpCAM negatif hücreleri ve / veya ortamı negatif kontroller olarak izole edin.
- Aşağı akım analizleri ile devam edin ( örn. , Hücre kültürü, PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu modelde başarılı ve tekrarlanabilir nesil kolorektal tümörlerin oluşması, hücrelerin dökülmeden veya sızıntı olmadan doğru şekilde enjekte edilmesine bağlıdır. Bu elde edilirse, bu model son derece güvenilirdir ve nadiren yapay periton yayılımı ile sonuçlanır. Tümörlerin büyüme kinetiği ve yayılma şekilleri, kullanılan organoidlerin ve hücrelerin biyolojisine bağlıdır. HCT116 hücreleri güvenilir, bu modelde, karaciğere metastaz 15 birlikte, SW620 hücre formu ortotopik tümörleri, metastaz yok. 15
Bu modelde HCT116 hücrelerinin kullanılması güvenilir bir şekilde tümör hücresi enjeksiyonundan 35 gün sonra moribund farelere neden olur. Primer tümörler yaklaşık 10 mm boyutunda ( Şekil 1A ve Şekil 2A ), karaciğer metastazlarını ( Şekil 1B Ong> ve Şekil 2B ), akciğer metastazları ( Şekil 1C ve Şekil 2C ) ve dolaşımdaki tümör hücreleri ( Şekil 3 ) neredeyse değişmez olarak mevcuttur. HCT116 tümörleri taşıyan farelerde, tümör hücresi enjeksiyonundan 35 gün sonra CTC'ler yüksek frekans ve miktarda bulunur ve aşağı akış analizleri için kolayca izole edilebilir ( Şekil 3 ).
Şekil 1: HCT116 İnsan CRC Hücrelerinin NSG Farelerine Ortotopik Enjeksiyonu Sonrası 35 Gün Sonra Diseksiyon Sonrası Makroskopik Resimler. ( A ) Çekumda primer tümör (kesikli çizgi). ( B ) Çoklu metastazlı karaciğer. ( C ) Akciğer metastazları (oklar).1large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Şekil 1'de Gösterilen Organların Histolojik Resimleri. ( A ) Primer Tümör (H & E). ( B ) Karaciğer metastazı (H & E). ( C ) Akciğer metastazı (anti-EpCAM immünhistokimya). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Tümör Hücrelerinin Dolaşımı (NSG Faresinde HCT116 Hücreleri, Tümör Hücresi Enjeksiyonundan 35 gün sonra). Parlak alan ( A B )) görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deri altındaki fare modellerinde klinik olarak kanıtlanmış etkinliklerine rağmen yeni bileşiklerin büyük çoğunluğu klinik araştırmalarda başarısız olur ve kliniğe asla ulaşmazlar. 11, deri altı fare modellerinde bu bariz yetmezliği doğru tümörlerin biyoloji ve büyüme kalıpları doğrudan orijinal organ, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan göre ortotopik fare modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır simüle edilmiştir.
Ortotopik fare modelleri, solid tümörlerin biyolojisini ve yayılmasını, subkütan modellere göre çok daha doğru simüle edebilir. 15 Bununla birlikte, başlıca dezavantajları böyle içi boş organların yanı sıra tümör büyümesinin teknik olarak zor izlenmesi özellikle teknik zorlu organlarında kötü çoğaltılabilirliğidir. Bizim modelimizde, bu nedenle, tekrarlanan görüntüleme prosedürlerinden ziyade önceden tanımlanmış bir zaman noktasında tümör boyutuna odaklandık ve bu da teknik sayısını sınırladıHayvanların stresli muayeneleri için ayrıntılı bir şekilde hazırlayın. Burada açıklanan model, tümör hücre çizgileri karakterizasyonu, tümör biyolojisi ve yayılması gibi terapötik denemeler 15 araştırma gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. 17 belirgin son noktalar, örneğin, aynı zamanda kullanılabilecektir CTC numaraları 17 veya görüntüleme yöntemleri gibi birincil tümörün boyutu ve uzak metastazların sayısı, ancak daha ayrıntılı bir uç noktası vardır.
Protokolümüzün en kritik basamağı subseröz tümör hücre enjeksiyonudur. Uygulama gerektirir ve doğrudan görsel kontrol altında her zaman yapılmalıdır. Eğer depozito başka bir yerde fakat serozanın altında fakat mukozanın üstünde ise, ya hiç bir tümör büyümesi ya da öngörülemeyen büyüme ve yaygınlaşma olmaz, sonuçların eşsiz hale getirilmesi. Tümör gelişiminin olmaması için olası diğer nedenler arasında, canlı olmayan hücreler ( örn./ Em>, hasat ve hücrelerin enjeksiyonu arasındaki uzun süre nedeniyle) veya tamamen eş zamanlı fareler değil. Bu, C57Bl / 6 fareleri kullanıldığında mümkündür; Çünkü farklı genetik ve fenotipik farklılıklar gösteren 22, bu da tümör alma oranlarında yansıtılan C57Bl / 6'nın ( örneğin , C57Bl / 6J ve C57Bl / 6N) alt ekstralarıdır. 23
Burada açıklanan yüksek düzeyde kontrollü enjeksiyon tekniği, yüksek ölçüde tekrarlanabilir tümör büyümesine ve yayılmasına yol açar ve bu modeli daha önce tarif edilen ortotopik modellerden ayırır. Buna ek olarak 24, tümör hücresi enjeksiyonundan sonra damıtılmış su ile çekum durulama önemli ölçüde yapay periton yayma hızını azaltan; Bu nedenle, modelimizde peritoneal karsinomatozis ortaya çıkarsa, büyük olasılıkla iyatrojenik bir tümör hücresi sızıntısı yerine hücre dizisinin biyolojisinin bir sonucudur.
Bu m sınırlamalarıOdel, insan hücre çizgileri kullanılacaksa bağışıklık yetersizliği gereken alıcı farelerdir. Bu, immünolojik araştırmalarda modelin uygulamasını ciddi ölçüde sınırlar. Bununla birlikte, bu sınırlama, sinjenik fare hücresi soyları veya organoidlerin kullanımı ile ortadan kaldırılabilir (yayınlanmamış veriler). Bir diğer kısıtlama hücre çizgilerinin kendilerinin kullanılmasıdır. Tümör hücre çizgileri genellikle orijinal tümörün biyolojisinin temsiliyetleri hakkında soru soran, son derece anaplastiktir. Bu sınırlama, dokuya özgü onkojenik mutasyonların eklenmesiyle yeni bir tümör geliştiren genetik olarak tasarlanmış fare modellerinde (GEMM) mevcut değildir. 12 Bu GEMMs genellikle koşullu germ hattı mutasyonlar göre (örneğin floxed APC geni) ile lokal enfeksiyon ya mutasyon aktivasyonunu Cre aracılık adeno cre 28, 27, 25 ya da bir doku spesifik promotör tahrik CREifadesi. 29 , 30 , 31 Bununla birlikte, bu tür modeller genellikle geniş geçiş gerektirir ve oldukça değişken bir biyolojiye sahiptir. Burada sunulan modelde birincil hücre hatları kullanılıyorsa, çoğaltılabilirlik ve göreli maliyet etkinliği gibi modelimizin diğer avantajlarını kaybetmeden düşük temsil oranının sınırlandırılması aşılabilir.
Burada önerilen tekniğin bir başka kısıtlaması, bir yüzey markörü olarak EpCAM'a bağımlıdır. EpCAM'in EMT sırasında kaybolabileceği ve EpCAM negatif CTC'lerin bir kısmının bulunduğu bilinmektedir. 10 , 15 Dolayısıyla, deneyin amacına ve enjeksiyon için kullanılan hücre hatlarına bağlı olarak, diğer tanımlama yöntemleri ( örneğin enjeksiyon öncesi hücrelerin GFP etiketlemesi) kullanılabilir.
Sonuç olarak, burada sunulan model cTümörün kolondaki orijinal mikro çevre bağlamında tümör gelişimini ve yaygınlaştırılmasını incelemek için esnek bir araçtır. Metastatik hücre dizileri kullanılıyorsa, kan dolaşımında CTC'ler de dahil olmak üzere CRC için ilgili tüm bölgelerde tümör hücresi yayılımını sadakatle taklit eder. Bu nedenle, tümör büyümesi ve yayılımı sırasında fenotipik değişiklikleri incelemek için yararlı bir araçtır ve CRC'de CTC'lerin tekrarlı izolasyonu ve karakterizasyonuna izin verir. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (We 3548 / 4-1) ve Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75 cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150 cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine | Temgesic | - | |
| Bepanthen - opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST - Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | FST - Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST - Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST - Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | AESCULAP - Braun | - | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell - Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
