Summary
We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.
Abstract
Ondanks de voordelen van makkelijke toepasselijkheid en kosteneffectiviteit, hebben subcutane muismodellen ernstige beperkingen en worden de tumorbiologie en tumorcel-verspreiding niet nauwkeurig gesimuleerd. Orthotopische muismodellen zijn geïntroduceerd om deze beperkingen te overwinnen; Dergelijke modellen zijn echter technisch veeleisend, vooral in holle organen zoals de dikke darm. Om uniforme tumoren te produceren die op betrouwbare wijze groeien en metastaseren, zijn gestandaardiseerde technieken van tumorcelbereiding en injectie kritisch.
We hebben een orthotopisch muismodel van colorectale kanker (CRC) ontwikkeld die zeer uniforme tumoren ontwikkelt en kan gebruikt worden voor tumorbiologie studies en therapeutische proeven. Tumorcellen uit primaire tumoren, 2-dimensionale (2D) cellijnen of 3-dimensionale (3D) organoïden worden geïnjecteerd in de cecum en, afhankelijk van het metastatische potentieel van de geïnjecteerde tumorcellen, vormen zeer metastatische tumoren. Daarnaast,CTC's kunnen regelmatig worden gevonden. Hier beschrijven we de techniek van tumorcelbereiding uit zowel 2D-cellijnen als 3D-organoïden, evenals primair tumorweefsel, de chirurgische en injectietechnieken, alsmede de isolatie van CTC's uit de tumorhoudende muizen en de huidige tips voor het oplossen van problemen.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is een van de meest voorkomende oorzaken van kanker dood in westerse landen. 1 Terwijl de primaire tumor vaak kan worden geresecteerd, verergert het voorkomen van verre metastasen de prognose dramatisch en leidt vaak tot de dood. 2 , 3 Het biologische correlaat van de metastase is circulerende tumorcellen (CTC's), die losmaken van de tumor, in de circulatie overleven, aan het epithelium in het doelorgaan vallen, het orgaan binnendringen en uiteindelijk uitgroeien tot nieuwe letsels. 4 Hoewel CTC's van prognostische relevantie bekend zijn, zijn 5 , 6 , 7 , 8 , 9 hun biologie slechts gedeeltelijk begrepen als gevolg van hun uiterste zeldzaamheid in CRC. 10
Muismodellen zijn een krachtige tOol om diverse aspecten van kankerbiologie te bestuderen. Klassieke subcutane tumormodellen worden geproduceerd door subcutane injectie van tumorcellen in ontvangermuizen, die immunocompetente kunnen zijn (indien syngeneuze muizen tumorcellen worden gebruikt) of immunodeficient. Subcutane tumormodellen zijn goedkoop en produceren data snel; Hun eindpunt tumor groei kan gemakkelijk en niet-invasieve gemeten worden. 88% van de nieuwe verbindingen die antitumoractiviteit in dergelijke modellen hebben aangetoond, falen echter in klinische studies. 11 Dit is mede te danken aan interspecies verschillen tussen mensen en muizen; Een groot deel van deze mislukking is echter te wijten aan de lage voorspellende waarde van subcutane muismodellen.
Orthotopische muismodellen, waarin de tumorcellen worden geïnjecteerd in het orgaan van herkomst en dus groeien in hun oorspronkelijke micro-omgeving, worden daarom steeds meer gebruikt bij kankeronderzoek. 11 , 12 , 13 , 14 Orthotopische modellen simuleren niet alleen lokale tumorgroei condities; Door de anatomisch correcte plaats van tumorgroei kunnen orthotopische muismodellen ook realistische simulatie van metastase mogelijk maken en worden daarom gebruikt om CTC biologie 8 , 15 , 16 of hun reactie op verschillende behandelingen in CRC te bestuderen. 13 , 17
Een belangrijk nadeel van orthotopische muismodellen is hun technische complexiteit. Afhankelijk van het orgaan waarin de cellen worden geïnjecteerd, is de leercurve tot de experimentator in staat om reproduceerbare tumoren te induceren, vrij lang. Dit geldt vooral voor colonectale kankermodellen, aangezien de tumorcellen in de darmmuur moeten worden geïnjecteerd, wat vaak resulteert in perforatie, tumorcellekkage of endoluminale tumorcelverlies. Dit isArtikel is bedoeld om de methode van celbereiding te beschrijven van primaire weefselmonsters, 2D-cellijnen en 3D-organoidcultuur en hun injectie in de cecum van muizen. De hier beschreven techniek leidt tot zeer gelijkmatige tumoren en, afhankelijk van de tumorbiologie van de cellijn die gebruikt wordt voor injectie, reproduceerbare vorming van verre metastasen en CTC's in de ontvanger muizen. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier gepresenteerde dierproeven werden onafhankelijk beoordeeld en toegestaan door een institutioneel en een overheidsdier voor dierenwelzijn en gebruik en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Federatie van Laboratorium Diervoederverenigingen (FELASA). Alle mogelijke maatregelen werden genomen om het lijden te verminderen, met inbegrip van verdoving en analgesie of, indien nodig, vroegtijdige euthanasie.
1. Bereiding van cellen en organoïden
OPMERKING: Gebruik een volume van 20 μL met 100.000 cellen voor elke injectie. Gebruik basementmembraanmatrix (BMM) om lekkage te voorkomen en een gestandaardiseerde injectie te waarborgen. Om de reproduceerbare resultaten te waarborgen, moet u met regelmatige intervallen celleline authentication analyses uitvoeren ( bijvoorbeeld via STR profilering).
- Bereiding van primaire cel suspensies van vers weefsel
OPMERKING: Werk altijd onder steriele omstandigheden. Onmiddelijke overdracht van de versGeresecteerd weefsel van de operatiekamer naar het laboratorium op ijs is nodig om de levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen.
Het welzijn van de patiënt en de optimale behandeling moeten altijd de eerste prioriteit zijn. Daarom moeten weefselmonsters voor onderzoek worden verkregen op een manier die geen interferentie met de daaropvolgende pathologische opbouw en opstelling van de gereserveerde tumor. In de meeste gevallen is het daarom redelijk om de monsters te hebben voor onderzoek verkregen door een getrainde patholoog om ervoor te zorgen dat de pathologische diagnose niet wordt verstoord.- Onmiddellijk na steriele verwijdering van het geresecteerde monster (ideaal ~ 1 cm 3 ), plaats het weefselmonster in een 50 ml buis, vooraf gevuld met 20-30 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaar de buis op ijs en breng onmiddellijk naar het laboratorium.
- Leg het weefsel in een Petri-schotel en doe het tweemaal met veel PBS om het resterende bloed te verwijderen.
- Snijd het weefsel in kleine stukken (~ 2-4 mm) met een scaLpel ( bijv . Met een # 20 of # 36 blad).
- Gebruik de dissociator volgens de instructies van de fabrikant om het tumorweefsel verder te dissociëren naar een enkelcelsuspensie. Alternatieven, gebruik andere protocollen van enzymatische tumorvertering.
- Tel de cellen van de resulterende enkelcelsuspensie ( bijv . In een coulterteller of een hemocytometer).
- Centrifuge (5 minuten bij 1.500 xg) en was de cel suspensie tweemaal met PBS.
- Resusteer de cellen in BMM bij een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml en houd ze op ijs.
- Bereiding van cellijnen voor injectie
- Groei alle cellijnen van de colorectale kanker onder de normale cultuuromstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 ) en bereiding op de dag van de operatie.
- Oog de cellen volgens de standaardcellen voor culturele cellen, tel de cellen ( bijv . In een coulterteller of een hemocytometer) en bereken de reqOngewenste hoeveelheid voor alle injecties afhankelijk van het aantal geïnjecteerde dieren.
- Bereid 3-5x van het daadwerkelijk benodigde volume om rekening te houden met pipetteringsverliezen en het dode volume van de injectiespuit.
- Centrifuge (5 minuten bij 1.500 g) en was de cel suspensie tweemaal met PBS.
- Resusteer de cellen in BMM bij een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml en houd ze op ijs.
- Organoïde bereiding
OPMERKING: Alle 3D organoïdeculturen worden gekweekt onder standaard cultuuromstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 ). Gedetailleerde protocollen voor organo-cultuur zijn eerder gepubliceerd. 18 , 19 , 20 In vergelijking met conventionele cellijnen adviseren we een volume van 20 μL BMM met 100.000 cellen per injectie. De organoïden worden op de dag van de operatie opgesteld als volgt:- Bereid het volgende medium voor (in de volgende verwijzingAls DMEM / F12 +++): Geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamine (200 mM) + 1% Penicilline / Streptomycine.
- Pre-fill 15 ml buizen met 1 ml DMEM / F12 +++.
- Sorg de organoïden zorgvuldig uit het oppervlak van de kweekplaat en verplaats de inhoud van 3 tot 5 putjes in een 15 ml buis.
- Pak de organoïden zorgvuldig in kleinere stukken door ze op en neer te pipetteren met een verlengde glazen pipet.
- Voeg 5 ml DMEM / F12 +++ aan de buis toe, gevolgd door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder na het centrifugeren de supernatant, resuspendeer de pellet in 600 μl enzymatische dissociatiebuffer en draag de suspensie over naar een putje van een 6-putjesplaat.
- Incubeer gedurende 1-5 minuten bij 37 ° C en pipet de suspensie op en neer met zorg om de organoïden op te lossen.
OPMERKING: Controleer de spijsvertering via microscoop; Het is compleet als alle celclusters zijn gedistribueerdD naar enkele cellen. - Na succesvolle spijsvertering, voeg 1,4 ml DMEM / F12 +++ toe om de spijsvertering te stoppen. Vervolgens alle putjes van verteerde organoïden overbrengen naar een 50 ml buis.
- Tel de cellen en bereken de benodigde hoeveelheid voor alle injecties.
- Bereid 3 - 5x van het daadwerkelijk benodigde volume om rekening te houden met pipetteringsverliezen en het dode volume van de injectiespuit
- Centrifuge (5 minuten bij 1.500 xg) en was de cel suspensie tweemaal met PBS.
- Resuspendeerde de cellen in BMM tot een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml en houd ze op ijs.
2. Orthotopische muismodel
- Voorbereiding van ontvanger dieren voor operatie
OPMERKING: Gebruik 6-8 week oude NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) muizen als ontvangers. 21 NSG behoren tot de meest immunocompromised muizen, die volwassen B, T en NK cellen ontbreken, samen met meerdere andere immunefects. 21 Ze groeien betrouwbaar tumoren, zelfs als lage cijfers worden geïnjecteerd en zeer gevoelig zijn voor verre metastasen. NSG muizen zijn uitstekende fokkers en kunnen worden bewaard in conventionele specifieke pathogeenvrije (SPF) eenheden.- Voor de eerste incisie injecteer 0,05 mg / kg buprenorfine subcutaan.
- Gebruik sevofluraan bij 3-3,5 vol% voor algemene verdoving. Een verlies van de teenvliesreflex geeft voldoende narkose aan.
- Bedek de ogen van de verdoofde muizen met oftalmische zalf om uitdroging van de hoornvlies te vermijden.
- Houd de muizen in een rugliggende positie op een kleine tafel.
- Scheer de buik met een elektrische scheerapparaat (afzettende crème kan alternatief worden gebruikt) en desinfecteren met ten minste 3 keer clorhexidine / jodium en 70% alcohol.
- Bedek het chirurgische veld met steriele gordijnen.
OPMERKING: Het gebruik van perioperatieve antibiotica is facultatief en onderworpen aan institutionele richtlijnen.
- Midline laparotomie en blootstelling van de cecum
- Gebruik een schaar (scalpels kunnen alternatief worden gebruikt) om een kleine middenlijninsnijding (3 - 5 mm) van de huid op de onderbuik te maken. Pak de buikspiermuskulatuur op met pincet en zorg het voorzichtig met een schaar, zodat de buikholte wordt geopend.
- Identificeer en zorgvuldig exterieur de cecum met atraumatische tang. Plaats het blinde uiteinde van de cecum op de buik die craniaal wijst.
- Eens exterieur, houd de cecum vochtig met behulp van warme zoutoplossingen te allen tijde.
- Orthotopische injectie, sluiting van de buik en postoperatieve herstel
- Voor intracale injectie, gebruik een standaard 1 ml spuit met een 30 G canule. Monteer deze spuit op een microinjectiepomp, die op zijn beurt wordt gemonteerd op een micromanipulator.
- Grijp het punt van de cecum zorgvuldig met atraumatische pincet en verzacht het zachtjes door het naar beneden te buigenD met een tweede reeks tangjes bevochtigd met warme zoutoplossing.
- Plaats de canule direct boven de cecum.
- Voer de volgende stappen uit onder visuele controle met een binoculaire chirurgische microscoop.
- Pak de cecum voorzichtig met twee atraumatische tangen aan beide uiteinden van het buitenste gedeelte van de cecum, steek het licht uit en trek het langzaam over de canule, die parallel en recht boven is geplaatst. Het is van cruciaal belang de gehele darmmuur niet te perforeren (waardoor de cellen in het lumen worden ingezet), evenals de serosa niet te perforeren boven het beginpunt van de penetratie, omdat dit lekkage en peritoneale verspreiding zou veroorzaken.
- Verplaats de darm naar de canule, niet de canule naar de darm. Houd de darm vast tussen twee tangen. De handen van de chirurg moeten op een oppervlak rusten om tremor te verminderen.
- Spuit de cellen tussen de serosa (gezien als zeer dun, doorschijnend voering boven deE intramurale bloedvaten) en de muscularis. De canule moet dus visueel boven de bloedvaten en onder het dunne doorschijnende membraan worden geplaatst.
- Gebruik een voetschakelaar om de injectie te starten om tremor te verminderen terwijl de canula in de darmwand ligt.
- Zodra de canule in positie is, start de injectie. Gebruik een duur van 20 s, wat resulteert in 1 μL / s instelling op de besturing van de pomp.
OPMERKING: De injectie in of nabij een beschadigd bloedvat leidt tot directe intravasculaire verspreiding en verre metastase en moet daarom vermeden worden. - Na de injectie af te maken, verwijder de canule zorgvuldig door deze naar achteren te trekken.
- Plaats een droge zwabber onder de cecum en doe de cecum grondig met gedestilleerd water om lekcellen te lichten en voorkom kunstmatige peritoneale verspreiding.
- Sluiting van de buik en postoperatieve herstel
- Na rTerugzetten, de cecum voorzichtig terugzetten naar de buikholte.
- Sluit de buikwand met 6-0 snel absorbeerbare lopende hechtingen.
- Sluit de huid met chirurgische wondklemmen.
- Plaats de muis op een verwarmingscartridge die ingesteld is op 38 ° C tot het volledig is hersteld van de verdoving.
- Let op de postoperatieve conditie van de muizen voor de volgende 48 uur. In geval van nood behandel u elke 12 uur met 0,05 mg / kg buprenorfine.
- Monitor de muizen ten minste eenmaal per dag voor tekenen van nood als gevolg van tumorgroei.
3. Isolatie van circulerende tumorcellen uit hele bloedmonsters
OPMERKING: Verkrijg bloed door transcutane hartsporing op verdovende muizen, gevolgd door euthanasie. Ideaal gezien worden 1000 μL bloed getrokken in een spuit die wordt gevuld met 100 μl van een anticoagulant (Ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) of heparine). Gebruik een anti-humaan-EpCAM (epitheliale celadhesieMolecuul) antilichaam om de CTC's te identificeren. Dit werkt zeer goed als menselijke epitheliale cellijnen worden gebruikt in het muismodel. Voor andere apparaten kunnen verschillende antilichamen nodig zijn.
- CTC verrijking:
- Voorvervul 15 ml buizen met 5 ml dichtheidsgradiëntmedium en plaats het bloed zorgvuldig in de 15 ml buis.
- Centrifuge (30 minuten bij 300 xg zonder rem) en verwijder de bovenste supernatant zorgvuldig.
- Giet de rest in een nieuwe 15 ml buis en centrifugeer (15 min, 300 xg met rem).
- Herstel de interfase die de mononucleaire cellen bevat (verwijder de rest) en doe de cellen tweemaal met PBS.
- Resulteer de pellet in 200 μl PBS / 1% EDTA en voeg 4 μL EpCAM antilichaam toe. Incubeer 20 minuten op ijs in het donker.
- Screening en plukken
- Bereid de volgende buffer voor (in het volgende aangeduid als plukbuffer): PBS + 10% foetaal kalfserum (FCS) + 1% Penicilline / STreptomycine (1%) + 0,8% EDTA.
- Gebruik een PAP-pen om een cirkel van ongeveer 1 cm in een 6 cm steriele Petri-schaal te trekken (voorkomt dat de vloeistof in de schotel verspreidt), en pipet 700 μL plukbuffer in deze cirkel.
- Voeg 50 μL cel suspensie toe aan de 700 μL plukbuffer binnen de cirkel. Controleer de dichtheid van cellen met de microscoop. Verdeel het monster in verschillende gerechten als het te dicht is.
- Wacht tot de cellen zich neerzetten (~ 5 min).
- Scherm de druppel cel suspensie voor gekleurde (= EpCAM-positieve) cellen.
- Zodra een cel is gevonden, kies de cel met de micromanipulator en zet het in 50 μL buffer, afhankelijk van de beoogde stroomafwaartse analyse ( bijv . RNA-extractiebuffer of cultuurmedium).
- Afhankelijk van de beoogde stroomafwaartse analyses isoleren EpCAM-negatieve cellen en / of medium als negatieve controles.
- Ga door met downstream analyses ( bijvoorbeeld celcultuur, PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De succesvolle en reproduceerbare generatie van colorectale tumoren in dit model hangt kritisch af van de nauwkeurige injectie van de cellen zonder spleten of lekkage. Als dit bereikt wordt, is dit model extreem betrouwbaar en resulteert het zeer zelden in kunstmatige peritoneale verspreiding. De groeikinetiek van de tumoren, evenals hun verspreidingspatronen, is afhankelijk van de biologie van de gebruikte organoïden en cellen. 15 Terwijl HCT116-cellen op betrouwbare wijze met de lever in dit model metastaseren, vormen de SW620-cel orthotopische tumoren, maar worden ze niet gemetastaseerd. 15
Het gebruik van HCT116 cellen in dit model resulteert betrouwbaar in moribund muizen binnen 35 dagen na de injectie van de tumorcel. Primaire tumoren zijn ongeveer 10 mm groot ( Figuur 1A en Figuur 2A ), levermetastasen ( Figuur 1B Ong> en Figuur 2B ), longmetastasen ( Figuur 1C en Figuur 2C ) en circulerende tumorcellen ( Figuur 3 ) zijn bijna altijd aanwezig. Bij muizen die HCT116 tumoren dragen, zijn 35 dagen na tumorcelinjectie CTC's aanwezig in hoge frequentie en kwantiteit en kunnen ze gemakkelijk worden geïsoleerd voor stroomafwaartse analyses ( Figuur 3 ).
Figuur 1: Macroscopische beelden na Dissectie 35 dagen na de orthotopische injectie van HCT116-menselijke CRC-cellen in NSG-muizen. ( A ) Primaire tumor (stippellijn) in de cecum. ( B ) Lever met meerdere metastasen. ( C ) longmetastasen (pijlen).1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologische afbeeldingen van de organen getoond in figuur 1 . ( A ) Primaire tumor (H & E). ( B ) Levermetastase (H & E). ( C ) Longmetastase (anti-EpCAM immunohistochemie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cirkulerende tumorcellen (HCT116-cellen in NSG-muizen, 35 dagen na tumorcelleninjectie). Helder veld ( A B )) beelden van CTC's in de perifere bloedmononucleaire cel (PBMC) fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks hun preclinisch bewezen activiteit in subcutane muismodellen, falen de grote meerderheid van de nieuwe verbindingen in klinische proeven en bereiken ze nooit de kliniek. 11 Deze duidelijke tekort aan subcutane muismodellen om de biologie en groeipatronen van tumoren nauwkeurig te simuleren heeft geleid tot de ontwikkeling van orthotopische muismodellen op basis van de injectie van tumorcellen direct in het oorspronkelijke orgaan.
Orthotopische muismodellen kunnen de biologie en verspreiding van vaste tumoren veel nauwkeuriger simuleren dan subcutane modellen. 15 echter grote nadelen zijn slechte reproduceerbaarheid name technisch veeleisend organen zoals holle organen en de technisch veeleisende toezicht op de tumorgroei. In ons model hebben we daarom gericht op tumorgrootte op een vooraf gedefinieerd tijdstip in plaats van herhaalde beeldvormingsprocedures, waardoor het aantal technischeUitgebreid en voor de stressvolle onderzoeken van de dieren. De hier beschreven model kan worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals karakterisering van tumorcellijnen, 15 onderzoek tumorbiologie en verspreiding en therapeutische studies. 17 Duidelijke eindpunten zijn de grootte van de primaire tumor en het aantal verre metastasen, maar meer uitgebreide eindpunten zoals CTC-nummers 17 of afbeeldingsmodaliteiten kunnen ook worden gebruikt.
De meest kritische stap van ons protocol is de subserosale tumorcelinjectie. Het vereist oefening en moet te allen tijde onder directe visuele controle worden uitgevoerd. Als de deposito ergens anders dan onder de serosa is, maar boven de slijmvliezen, dan zullen er geen tumorgroei zijn of onvoorspelbare groei en verspreiding, waardoor de resultaten onvergelijkbaar zijn. Andere mogelijke redenen voor het gebrek aan tumorontwikkeling zijn niet-levensvatbare cellen ( bijv. </ Em>, door de lange tijd tussen de oogst en de injectie van de cellen) of niet volledig syngeneuze muizen. Dit is mogelijk als C57Bl / 6 muizen worden gebruikt; Aangezien er meerdere substrainen van C57Bl / 6 zijn ( bijv . C57Bl / 6J en C57Bl / 6N) die duidelijke genetische en fenotypische verschillen tonen 22 die ook worden weerspiegeld in tumor-tarieven. 23
De hier beschreven beschreven hoogst gecontroleerde injectietechniek leidt tot zeer reproduceerbare tumorgroei en verspreiding en onderscheidt dit model uit eerder beschreven orthotopische modellen. 24 Bovendien spoelen van de blindedarm met gedestilleerd water na injectie van tumorcellen drastisch vermindert het kunstmatige peritoneale verspreiding; Daarom, als peritoneale carcinomatose optreedt in ons model, is het waarschijnlijk een gevolg van de biologie van de cellijn in plaats van een iatrogene tumorcellekkage.
Beperkingen van deze mOdel zijn de ontvanger muizen die immunodeficiënt moeten zijn als menselijke cellijnen gebruikt moeten worden. Dit beperkt de toepassing van het model ernstig in immunologische studies. Deze beperking kan echter overwonnen worden door het gebruik van syngeneuze muizencellijnen of organoïden (ongepubliceerde gegevens). Een andere beperking is het gebruik van cellijnen zelf. Tumorcellijnen zijn vaak zeer anaplastisch, waardoor vragen worden over hun representativiteit van de biologie van de oorspronkelijke tumor. Deze beperking is niet aanwezig in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's), die een nieuwe tumor ontwikkelen door de introductie van weefselspecifieke oncogene mutaties. 12 Dergelijke GEMM's zijn gewoonlijk gebaseerd op conditional germline-mutaties ( bijvoorbeeld een floxed Apc-gen) en Cre-gemedieerde activatie van de mutaties, hetzij door lokale infectie met adeno-cre 25 , 27 , 28 of een weefselspecifieke promotoruitdrukking. 29 , 30 , 31 Maar dergelijke modellen vereisen vaak uitgebreide kruisingen en hebben een zeer variabele biologie. Als primaire cellijnen worden gebruikt in het hier weergegeven model, kan de beperking van lage representativiteit overwonnen worden zonder verlies van de andere voordelen van ons model, zoals reproduceerbaarheid en relatieve kosteneffectiviteit.
Een andere beperking van de hier voorgestelde techniek is de afhankelijkheid van EpCAM als oppervlakte merker. Het is bekend dat EpCAM tijdens EMT verloren kan gaan en dat er een fractie van CTC's bestaat die EpCAM negatief zijn. 10 , 15 Daarom kunnen, afhankelijk van het doel van het experiment en de cellijnen die gebruikt worden voor injectie, andere middelen voor identificatie ( bijvoorbeeld GFP-etikettering van de cellen voorafgaand aan injectie) worden gebruikt.
Ten slotte, het hier gepresenteerde model cVormt een flexibel instrument om tumorontwikkeling en verspreiding te bestuderen in het kader van de oorspronkelijke micro-omgeving van de tumor in de dikke darm. Als metastatische cellijnen worden gebruikt, simuleert het de verspreiding van tumorcellen op alle relevante sites voor CRC met inbegrip van CTC's in de bloedstroom terecht. Het is daarom een nuttig instrument om de fenotypische veranderingen te bestuderen tijdens de groei en verspreiding van tumoren en zorgt voor herhaalde isolatie en karakterisering van CTC's in CRC. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (WE 3548 / 4-1) en Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75 cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150 cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine | Temgesic | - | |
| Bepanthen - opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST - Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | FST - Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST - Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST - Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | AESCULAP - Braun | - | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell - Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
