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Neuroscience

संयोजक α-β-and γ-Synucleins उत्तेजित प्रोटीन फॉस्फेट 2a उत्प्रेरक उपइकाई गतिविधि सेल मुक्त परख में

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

यह प्रकाशन कैसे संयोजक प्रोटीन फॉस्फेट 2a उत्प्रेरक उपइकाई (PP2Ac) के जवाब में संयोजक α-synuclein, β-synuclein, या γ-synuclein प्रोटीन की गतिविधि को मापने के लिए एक सरल वर्णमिति परख का उपयोग दिखा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । हम माउस मस्तिष्क में PP2Ac की ओर α-synuclein विशिष्टता के बारे में निष्कर्षों को दिखाते हैं ।

Abstract

α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn), और γ-Synuclein (gSyn) निगरानी के एक संरक्षित परिवार के सदस्य हैं-प्रोटीन की तरह है कि अत्यधिक हड्डीवाला न्यूरॉन ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं. तीन synucleins में से केवल aSyn को पार्किंसंस रोग, Lewy शरीर के साथ मनोभ्रंश, और कई प्रणाली शोष जैसे neurodegenerative विकारों में दृढ़ता से फंसाया गया है । सामान्य aSyn समारोह का अध्ययन में, डेटा संकेत मिलता है कि aSyn एक प्रचुर मात्रा में व्यक्त dephosphorylating एंजाइम की उत्प्रेरक उपइकाई की गतिविधि को उत्तेजित करता है, इन विट्रो में और vivo मेंPP2Ac. study data बताते हैं कि मानव मस्तिष्क में aSyn एकत्रीकरण Lewy शरीर विकृति वाले क्षेत्रों में PP2Ac गतिविधि को कम कर देता है, जहां घुलनशील aSyn अघुलनशील हो गया है । हालांकि, क्योंकि सभी तीन synucleins अमीनो एसिड दृश्यों में काफी समरूपता है, प्रयोगों के लिए परीक्षण डिजाइन किए गए थे अगर सब PP2Ac गतिविधि मिलाना कर सकते हैं । संयोजक synucleins और संयोजक PP2Ac प्रोटीन का प्रयोग, गतिविधि मैलाकाइट ग्रीन वर्णमिति परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था । डेटा से पता चला है कि सभी तीन संयोजक सेल मुक्त परख में PP2Ac गतिविधि उत्तेजित synucleins, संभावना है कि संरक्षित समरूपता के बीच synucleins के लिए बांध और राज्यसत्ता को सक्रिय करने की क्षमता के साथ सभी तीन homologs हो सकता है स्थापना । immunoprecipitation डेटा, तथापि, सुझाव है कि PP2Ac मॉडुलन की संभावना vivo मेंaSyn और PP2Ac के बीच अंतर्जात बातचीत के माध्यम से होता है ।

Introduction

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में synucleins के वितरण को परिभाषित अध्ययनों से पता चलता है कि सभी तीन synucleins तंत्रिका ऊतकों में समृद्ध कर रहे हैं, हालांकि स्थानीयकरण के पैटर्न अलग रिपोर्ट किया गया है1। उदाहरण के लिए, aSyn सेरेब्रल प्रांतस्था और बेसल गैंग्लिया में presynaptic साइटों पर सबसे प्रचुर मात्रा में है2,3, bSyn मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में एक और अधिक समान वितरण है4,5, और gSyn रीढ़ की हड्डी में अधिक प्रचुर मात्रा में है और परिधीय गैंग्लिया6. हालांकि सभी synucleins के कुछ भ्रूण अभिव्यक्ति हो सकती है, तीन homologs नवजात अवधि के दौरान4,5,6,7,8। उल्लेखनीय है, synuclein ट्रिपल नॉकआउट चूहों से डेटा, संकेत मिलता है कि सभी तीन synucleins की हानि आयु शुरुआत न्यूरॉनिक रोग9, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में महत्वपूर्ण synuclein कार्यों का समर्थन10, 11. यह अभी तक अगर synuclein ट्रिपल नॉकआउट चूहों PP2Ac वितरण या गतिविधि में परिवर्तन दिखाने ज्ञात नहीं है । एकल synuclein नॉकआउट चूहों से डेटा का पता चलता है कि अकेले aSyn की हानि काफी मस्तिष्क में PP2Ac गतिविधि को कम करने में सक्षम है12. सीएनएस के अलावा, सभी synucleins शरीर में13,14,15भर में अंय ऊतकों को स्थानीयकृत ।

neurodegeneration16,17, aSyn के लिए अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक लिंक की वजह से तीन synucleins का सबसे अच्छा अध्ययन के बीच है । पेरेस प्रयोगशाला लंबे समय से aSyn के सामांय कार्यात्मक गतिविधियों को परिभाषित करने के लिए काम किया है, विशेष रूप से सीएनएस11,12,18,19,20,21, 22,23 और अधिक हाल ही में परिधीय ऊतकों में24,25. इनमें से, खोज है कि aSyn PP2Ac गतिविधि उत्तेजक में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाता था19। PP2A गतिविधि सामान्य मस्तिष्क समारोह के लिए व्यापक रूप से योगदान देता है, डोपामाइन उत्पादन के विनियमन के लिए सहित26. PP2A holoenzyme तीन स्वतंत्र उपइकाई के होते हैं, उत्प्रेरक सी उपइकाई, PP2Ac, एक मचान एक उपइकाई, और कई अलग नियामक/लक्ष्यीकरण बी उपइकाई है कि मदद करने के लिए विशिष्ट सेलुलर microdomains को स्थानीयकृत PP2A, इस प्रकार PP2A प्रदान कार्यात्मक विविधता27। सबूत से पता चलता है कि PP2Ac के साथ aSyn बातचीत इन विट्रो में अपनी फॉस्फेट गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण योगदान और vivo12,19,21,23, 25. जब aSyn प्रोटीन समुच्चय में जमा होता है, के रूप में यह करता है जब Lewy निकायों पार्किंसंस रोग और Lewy निकायों (DLB) के साथ मनोभ्रंश, समग्र aSyn के साथ ऊतकों के अंदर न्यूरॉन्स PP2Ac गतिविधि कम है23,25, जब घुलनशील aSyn का स्तर कम । यह देखते हुए कि सभी तीन synucleins महत्वपूर्ण है समरूपता28 (aSyn के साथ bSyn और ५६% gSyn के साथ शेयर ६६% पहचान) और है कि aSyn PP2Ac के सक्रियण के लिए योगदान देता है, यह कल्पना की थी कि synuclein प्रोटीन परिवार के सभी सदस्यों को सक्षम हो सकता है PP2Ac गतिविधि बढ़ाएं, कम-से- इन विट्रो में। इस का आकलन करने के लिए, PP2Ac गतिविधि संयोजक aSyn, bSyn के जवाब में मापा गया था, और gSyn एक सरल वर्णमिति परख का उपयोग कर, Fathi एट अल की विधि के बाद मॉडलिंग की । 29. इस विधि और उपन्यास के निष्कर्षों को विस्तृत रूप से इस के साथ समाहित कर रहे हैं ।

Protocol

1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी

  1. पी-nitrophenyl फॉस्फेट (pNPP) बफर की तैयारी
    1. निम्नानुसार pNPP बफ़र के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. ०.३०२८५ ग्राम Tris बेस बाहर वजन ( सामग्री की तालिकादेखें) और ultrapure जल के 25 मिलीलीटर में इसे भंग ।
      1. १२० mM CaCl2के ४१.६ µ l को जोड़ें । 1 मीटर एचसीएल के साथ पीएच ७.० को समायोजित करें और ultrapure जल के साथ अंतिम समाधान की मात्रा ५० मिलीलीटर में लाएं ।
      2. सुनिश्चित करें कि अंतिम एकाग्रता ५० mm Tris-HCl, १०० mm CaCl2, pH ७.० है ।
      3. 4 oC पर pNPP बफ़र संग्रहीत है ।
  2. मैलाकाइट ग्रीन समाधान के लिए, निम्न तैयार करें ।
    1. एक 4 एम एचसीएल सॉल्यूशन बनाने के लिए ultrapure जल के ६७.२ मिलीलीटर में ३२.८ मिलीलीटर को जोड़कर समाधान A तैयार करें ।
      नोट: मैलाकाइट समाधान डिस्पोजेबल दस्ताने, चेहरा मुखौटा, और सुरक्षा चश्मे का उपयोग कर एक धुएं हुड में तैयार किया जाता है ।
    2. बाहर अमोनियम molybdate के ४.२ g वजन और यह समाधान A के ९५.८ मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा समाधान B तैयार करें ।
    3. ०.०४५ ग्राम मैलाकाइट हरी oxalate नमक को बाहर तौल कर समाधान C तैयार करें और ultrapure के जल को जोड़ने के लिए अंतिम कुल मात्रा को १०० मिलीलीटर में लाएं ।
    4. समाधान B और C 1:3 (v/v) अनुपात में मिश्रण करके समाधान D तैयार करें, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हिलाओ ।
    5. फ़िल्टर समाधान D के माध्यम से एक ०.२२ µm ताकना आकार nitrocellulose झिल्ली फ़िल्टर इकाई का उपयोग कर एक ५० मिलीलीटर सिरिंज ।
    6. प्रकाश से संरक्षित 4 ओसी पर स्टोर तैयार मैलाकाइट समाधान ।
  3. उत्प्रेरक की तैयारी
    1. एक 1% के बीच 20 समाधान तैयार करने के लिए, पिपेट 10 µ एल के बीच 20 के ९९० µ एल में ultrapure जल (वी के) तो भंवर जब तक 20 के बीच पूरी तरह से घुल ।
  4. मैलाकाइट ग्रीन के बीच 20 (MGT) काम समाधान की तैयारी ।
    1. मिश्रण उत्प्रेरक (चरण १.३) मैलाकाइट ग्रीन समाधान (समाधान डी, चरण 1.2.5) के साथ 1:100 के अनुपात में (जैसे 1 µ l उत्प्रेरक ९९ µ एल मैलाकाइट ग्रीन समाधान के लिए) ।
  5. threonine phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) सब्सट्रेट की तैयारी ।
    1. एक 2 मिमी शेयर तैयार करने के लिए, बर्फ पर एक 1 मिलीग्राम phosphopeptide शीशी जगह, ultrapure जल के ५५० µ एल जोड़ने के लिए, और भंवर धीरे भंग करने के लिए ।
      1. बनाने ~ 10 aliquots और स्टोर पीटी पर-20ओसी ।
  6. Synuclein तयारी
    1. डिस्पोजेबल दस्ताने, चेहरा मुखौटा, और सुरक्षा चश्मे का उपयोग कर एक धुएं हुड में synucleins तैयार करें ।
    2. 1 मिलीग्राम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2 मिलीलीटर ultrapure जल में संयोजक synuclein की एक मिलीग्राम reसस्पेंड/
    3. भंवर धीरे से भंग करने और बर्फ पर जगह है ।
    4. तैयार ५० µ l aliquots और स्टोर पर-८० ओसी ।
  7. फॉस्फेट मानकों की तैयारी
    1. इस प्रकार के रूप में ०.१ mM फॉस्फेट स्टॉक समाधान तैयार करें ।
      1. बाहर वजन ०.१३६१ जी KH2पीओ4 और एक चोंच में ultrapure के ८० मिलीलीटर पानी के साथ जगह है । एक हलचल बार और मिश्रण को भंग जोड़ें । एक स्नातक सिलेंडर के लिए समाधान के सभी स्थानांतरण और ultrapure जल के साथ १०० मिलीलीटर के लिए अंतिम कुल मात्रा लाने के लिए ।
      2. एक ५० मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर एक ०.२२ µm ताकना आकार nitrocellulose झिल्ली फिल्टर इकाई के माध्यम से पूरे समाधान फ़िल्टर; अंतिम एकाग्रता 10 मिमी है ।
      3. समाधान पतला (10 मिमी) 1:100; अंतिम एकाग्रता ०.१ mM फॉस्फेट (पीओ4) होगा परख मानकों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
      4. 4 ओसी पर फॉस्फेट स्टॉक समाधान की दुकान
    2. १२५० µ एल प्रत्येक की एक अंतिम कुल मात्रा के साथ पीओ4 मानकों बनाने के लिए इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने के लिए 1 टेबल देखें । 1 तालिका के अनुसार १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए फॉस्फेट और ultrapure जल की उचित मात्रा में जोड़ें ।
      1. दुकान तैयार पीओ4 मानकों पर-20 ओसी ।
फॉस्फेट मानकों
०.१ mM पीओ4 समाधान (एमएल) 0 ७५ १५० ३०० ६०० १,२००
Ultrapure जल (एमएल) १,२५० १,१७५ १,१०० ९५० ६५० ५०
पीओ के अंतिम एकाग्रता4 [pmol] 0 १५० ३०० ६०० १,२०० २,४००

1 तालिका: फॉस्फेट मानक ।

2. संयोजक Synucleins के जवाब में PP2A परख

नोट: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए कुल अंतिम मात्रा ६० µ l हो जाएगा, तो प्रयोगकर्ता pNPP बफर के प्रारंभिक खंड उचित रूप से प्रत्येक नमूने के लिए इस्तेमाल किया synucleins की मात्रा को समायोजित करने के लिए समायोजित करना होगा । अधिकांश मामलों में, pNPP बफ़र की मात्रा ४० और ४४ µ l के बीच होगी ।

  1. प्रत्येक PP2Ac प्रतिक्रिया निम्नानुसार तैयार करें ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, pNPP बफर और बर्फ पर जगह के ३९ µ एल जोड़ें ।
    2. मानव संयोजक PP2Ac (rPP2Ac) के 1 µ l (१०५ एनजी/µ l या ०.०००७ U/µ l) जोड़ें ।
    3. 0, १.५, ७.५, 15 या 30 µ एम synucleins के 4 µ एल जोड़ें 0, ०.१, ०.५, १.० और २.० pNPP एम के अंतिम सांद्रता के लिए µ बफर में rPP2Ac करने के लिए और एक घूर्णन इकाई पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन; अंतिम मात्रा ६० µ l होगी ।
    4. 30 मिनट के बाद, बर्फ के लिए नमूने ले जाने और 2 मिमी पीटी सब्सट्रेट के 16 µ एल जोड़ें.
    5. आंतरायिक झटकों के साथ एक पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस में 10 मिनट के लिए प्रत्येक PP2A परख मिश्रण गर्मी ।
    6. एक फ्लैट नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए, प्रत्येक पीओ4 मानक के 25 µ एल जोड़ें (0, १५०, ३००, ६००, १,२००, और २,४०० pmol) डुप्लिकेट कुओं में उच्च करने के लिए कम से ।
    7. अगले प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना (PP2A परख ± synuclein) के 25 µ एल जोड़ने के लिए, 2.1.6 के लिए 2.1.1 कदम में तैयार, एक ही ९६-अच्छी तरह से प्लेट पर कुओं डुप्लिकेट ।
    8. अगला, एक अच्छी तरह से युक्त मानकों और नमूनों के लिए MGT काम समाधान के ७५ µ एल जोड़ें ।
    9. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दें ।
    10. फॉस्फेट स्तर में औसत दर्जे का अंतर होने के नमूनों में एक रंग परिवर्तन का निरीक्षण.

3. भामिति विश्लेषण

  1. ९६-अच्छी तरह से ६३० एनएम के लिए सेट तरंग दैर्ध्य के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्लेट रीडर का उपयोग कर मानकों और नमूनों युक्त प्लेट विश्लेषण ।
  2. प्लॉट अवशोषक वक्र का उत्पादन किया (नमूने ६३० एनएम पर पढ़ें) और ध्यान दें कि यह अप करने के लिए रेखीय रहता है २,४०० pmol एकाग्रता के पीओ4।

Representative Results

प्रोटीन समारोह और गतिविधि फास्फारिलीकरण जैसे पोस्ट शोधों संशोधनों के द्वारा बदला जा सकता है । कई प्रोटीन एक कळेनासे द्वारा phosphorylated जा सकता है, या एक फॉस्फेट द्वारा dephosphorylated । प्रोटीन फॉस्फेट 2a (PP2A) के मामले में, इस multisubunit फॉस्फेट dephosphorylation की एक विस्तृत संख्या पर serine और threonine अवशेषों की phosphoproteins की सुविधा । असामान्य PP2A गतिविधि से dysregulation प्रोटीन फंक्शन का रूप ले सकता है जो कि पार्किंसंस रोग सहित कई रोगों में होता है जहां aSyn hyperphosphorylated बन सकता है, और अल्जाइमर रोग में जहां ताऊ प्रोटीन hyperphosphorylated बन सकता है । यह एक में घर प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए तेजी से PP2Ac गतिविधि का मूल्यांकन और अगर असामांय PP2Ac गतिविधि सेलुलर रोग के लिए नेतृत्व कर सकते है निर्धारित करने के लिए औचित्य प्रदान की ।

इस सेल मुक्त वर्णमिति परख का उपयोग करना, PP2Ac गतिविधि नि: शुल्क पीओ4 की राशि पीटी सब्सट्रेट (चित्रा 1a) से सट द्वारा मापा गया था और मानक वक्र में पीओ4 के ज्ञात picomolar मात्रा की तुलना में (चित्र 1b ). PP2Ac गतिविधि भी ०.०, ०.१, ०.५, १.०, और २.० µ एम synucleins (चित्रा 1a) के जवाब में मापा गया था, के रूप में जोड़ा synuclein के अभाव में आधारभूत PP2Ac गतिविधि की तुलना में ( चित्र 1aमें बड़े तीर पर).

Figure 1
चित्र 1 : संयोजक synucleins द्वारा PP2A सक्रियण, मानकों में फॉस्फेट के ज्ञात स्तर के सापेक्ष मापा जाता है. में (एक) aSyn, bSyn, और gSyn 0-2 µ एम प्रोटीन सांद्रता से एक सीमा में मूल्यांकन किया गया, 0-2400 pmol पीओ 4 मानकों की तुलना में । (ख) मैलाकाइट हरी PP2Ac परख के लिए एक मानक वक्र फॉस्फेट के खिलाफ जो प्रयोगात्मक परिस्थितियों में प्राप्त मूल्यों की गणना की जा सकती है ज्ञात मात्रा प्रदान करने के लिए उत्पंन किया गया था । सभी मामलों में, जब PP2Ac गतिविधि बढ़ जाती है, नि: शुल्क पीओ की राशि4 पीटी सब्सट्रेट बढ़ से सट और एक गहरा हरा रंग का उत्पादन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

परिणाम बताते है कि प्रारंभिक मशीन कदम में PP2Ac को synucleins के अलावा नि: शुल्क पीओ4 मापा की राशि बढ़ सकता है, जिससे वृद्धि हुई PP2Ac गतिविधि का प्रदर्शन । कई पुनरावृत्तियों के बाद सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि सभी तीन संयोजक synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) काफी PP2Ac गतिविधि में वृद्धि (चित्रा 2) । इन परिणामों का सुझाव है कि घुलनशील सेलुलर synucleins की मात्रा में परिवर्तन PP2Ac गतिविधि बदल सकते हैं; और इस तरह सेलुलर homeostasis प्रभाव हो सकता है । यह ज्ञात नहीं है, हालांकि, अगर सभी तीन synucleins vivo मेंPP2Ac के सक्रियण के लिए योगदान है, हालांकि चित्रा 3 में डेटा का सुझाव है कि aSyn संभावना vivo मेंPP2Ac गतिविधि के लिए योगदान देता है ।

Figure 2
चित्र 2 : PP2Ac गतिविधि सभी तीन synucleins द्वारा उत्तेजित है । संयोजक aSyn, bSyn या gSyn की सांद्रता बदलती के जवाब में PP2Ac सक्रियण के चित्रमय प्रतिनिधित्व दिखाया गया है । सभी तीन संयोजक synucleins उत्तेजित PP2Ac गतिविधि । aSyn ज्यादातर प्रयोगों में थोड़ा और अधिक शक्तिशाली हो दिखाई दिया, हालांकि ANOVAs सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन उल्लेखनीय समान समग्र थे । डेटा 4-9 स्वतंत्र प्रयोगों के अर्थ ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । ns, महत्वपूर्ण नहीं; * p < 0.05; * * p < 0.01; p < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जो synuclein (ओं) मस्तिष्क में PP2Ac के साथ बातचीत कर सकते है का आकलन करने के लिए, सह immunoprecipitation (सह आईपी) परख जंगली प्रकार माउस मस्तिष्क और PP2Ac-विशिष्ट-एंटीबॉडी, 1D6 का उपयोग किया गया । प्रोटीन तो एसडीएस द्वारा अलग किया गया पृष्ठ और दाग PP2Ac, aSyn, bSyn के लिए जांच की गई, और gSyn स्थापित तरीकों का उपयोग कर19। संयोजक synuclein नियंत्रण aSyn, bSyn और gSyn एंटीबॉडी विशिष्टता (चित्र 3ए) प्रदर्शित करता है । सह आईपी डेटा से पता चलता है कि प्रमुख synuclein मस्तिष्क में PP2Ac के साथ जुड़े aSyn था, के रूप में बहुत कम bSyn सह में नीचे आया आईपी (चित्र बी), और कोई gSyn सह में नीचे आया आईपी (नहीं दिखाया गया डेटा) । यह मस्तिष्क में PP2Ac के नियमन में अंतर्जात aSyn के लिए एक विशिष्ट भूमिका का सुझाव देता है । यह भी संभावना है कि bSyn-आधारित उपचारों के साथ PP2Ac मॉडुलन synucleinopathy के साथ उन में PP2A गतिविधि बहाल करने की क्षमता हो सकता है, के रूप में bSyn अभी तक nonamyloidogenic के रूप में यहां दिखाया PP2Ac30उत्तेजित कर सकते है पता चला है, 31.

Figure 3
चित्र 3: माउस मस्तिष्क में अंतर्जात synucleins के साथ PP2Ac की बातचीत. (क) संयोजक aSyn, bSyn और gSyn के नीचे वर्णित synuclein विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच की गई. (ख) माउस ब्रेन homogenate का उपयोग सह आईपी एंटीबॉडी 1D6 के साथ प्रदर्शन किया था, तो नमूने immunoblots पर विश्लेषण किया गया । डेटा PP2Ac, aSyn, और bSyn के लिए दिखाया गया है, लेकिन gSyn के लिए नहीं है जो PP2Ac के साथ सह आईपी नहीं था । प्रारंभ नमूने प्रारंभिक homogenates में PP2Ac (लेन 1), aSyn (लेन 4), और bSyn (लेन 7) के सापेक्ष स्तर दिखाते हैं । अंतिम नमूने PP2Ac (लेन 2), aSyn (लेन 5), और bSyn (लेन 8) के homogenates में 1D6 PP2Ac Co-IP के बाद का शेष स्तर दिखाते हैं । PP2Ac के महत्वपूर्ण स्तर 1D6 एंटीबॉडी (लेन 3), जो भी नीचे aSyn के पर्याप्त मात्रा में लाया (लेन 6, तीर पर) का उपयोग कर immunoprecipitated थे, लेकिन बहुत कम bSyn (लेन 9, जोरदार बेहोश bSyn संकेत दिखाने के लिए उजागर, तीर पर) । * तारक और कोष्ठक दाग-धब्बों पर गैर-विशिष्ट संकेतों को चिह्नित करते हैं । इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

पीटी के साथ इस मैलाकाइट हरी परख PP2Ac गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता था क्योंकि यह शास्त्रीय विधि है कि ३२P-लेबलित सब्सट्रेट का उपयोग करता है से प्रदर्शन करने के लिए आसान है । रेडियोधर्मी परख पर इस परख का एक और लाभ यह है कि radioisotopes कुछ जोखिम मुद्रा और महंगा हो सकता है, विशेष रूप से ३२P-अणु है कि कम आधा रहता है, जो एक परख से पहले प्रदर्शन कर सकते है की संख्या सीमा है जीवन, reagents समाप्त हो । मैलाकाइट ग्रीन के बजाय रेडियोधर्मिता का उपयोग करना भी ३२पी अपशिष्ट के निपटान की आवश्यकता को समाप्त । मैलाकाइट हरी परख भी काफी संवेदनशील है जब serine/threonine phosphatases की गतिविधि को मापने जब एक और वर्णमिति परख कि सब्सट्रेट पी-nitrophenylphosphate (pNPP) है, जो गैर चयनात्मक है के रूप में यह हो सकता है का उपयोग करता है की तुलना में एंजाइमों की एक व्यापक संख्या के द्वारा dephosphorylated३२

वाणिज्यिक मैलाकाइट ग्रीन किट PP2A गतिविधि को मापने के लिए कुछ समय के लिए उपलब्ध किया गया है, और पहले प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया । हालांकि, जब कई मैलाकाइट हरी परख कर रहे हैं, इस तरह के किट नकारात्मक महंगा हो गया । इसके अलावा, PP2A गतिविधि के लिए वाणिज्यिक किट केवल एक वर्ष के लिए स्थिर रहे हैं, जबकि पाउडर फार्म में और उचित भंडारण के साथ उपलब्ध एजेंट, आसानी से उपलब्ध परख घटक है कि समय की लंबी अवधि के लिए संरचनात्मक रूप से स्थिर है प्रदान करते हैं ।

परीक्षण bSyn और gSyn से पहले, aSyn एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता था PP2Ac गतिविधि को उत्तेजित और PP2Ac की मात्रा निर्धारित करने के लिए परख के लिए आवश्यक है, और यह भी पुष्टि करने के लिए कि परिणामी डेटा मानक वक्र के साथ पैमाने पर रहना (१५०-पीओ के २४०० pmol4 ). यह उल्लेखनीय है कि यदि aSyn PP2Ac भी दृढ़ता से उत्तेजित करता है, हालांकि प्रतिक्रिया आम तौर पर रैखिक है, डेटा पैमाने बंद हो जाएगा और रसायनों में MGT समाधान हाला, यह असंभव को मापने के लिए सही मात्रा में जारी नि: शुल्क-PO4 एक प्लेट के साथ पाठक.

यह देखते हुए कि aSyn vivo में PP2Ac गतिविधि के लिए योगदान देता है और इन विट्रो12,19,21,23,25, और है कि सभी synucleins काफी समरूपता है, यह गया था कल्पना की है कि सभी synuclein परिवार के सदस्यों को सेल मुक्त परख में PP2Ac को उत्तेजित करने में सक्षम हो सकता है । वर्णमिति परख का उपयोग यहां वर्णित है, यह पाया गया कि वास्तव में, सभी तीन संयोजक synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac गतिविधि उत्तेजित, संभावना है कि सभी तीन synucleins तंत्रिका तंत्र में समान कार्य कर सकते है स्थापना । हालांकि, Lewy शरीर के मामलों के साथ पार्किंसंस या मनोभ्रंश से मस्तिष्क, उच्च एकत्रित aSyn से युक्त ऊतकों में कम PP2Ac गतिविधि है23. माउस के ऊतकों Lewy शरीर की तरह विकृति को भी कम PP2Ac गतिविधि25प्रदर्शन । यह, और चित्रा 3 में नए डेटा के रूप में अच्छी तरह से aSyn नॉकआउट चूहों से पूर्व डेटा के रूप में12, दृढ़ता से सुझाव है कि न तो bSyn और न ही gSyn आम तौर पर मस्तिष्क में घुलनशील aSyn के नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं, या वैकल्पिक रूप से है कि उन synuclein homologs नहीं हो सकता PP2Ac के साथ aSyn के रूप में पुरजोर रूप में दर्शाए गए अनुसार (चित्र 3) । एलन ब्रेन एटलस कई मस्तिष्क क्षेत्रों में सभी तीन synuclein mRNAs के colocalization से पता चलता है, और हालांकि ट्रिपल synuclein नॉकआउट चूहों9,३३उत्पंन किया गया है, PP2Ac गतिविधि है कि मॉडल में मूल्यांकन नहीं किया गया है । दिलचस्प है, aSyn कि कळेनासे 2 की तरह पोलो द्वारा Ser129 पर phosphorylated है, कम करने के लिए PP2Ac12सक्रिय करने में सक्षम है, लेकिन bSyn के लिए यहां दिखाया सबूत सुझाव है कि bSyn फास्फारिलीकरण प्रभाव की संभावना नहीं है PP2Ac गतिविधि, के रूप में बहुत कम bSyn के साथ नीचे आया माउस ब्रेन में PP2Ac (चित्र 3) । एक साथ लिया, डेटा सुझाव है कि अंतर्जात PP2Ac गतिविधि मॉडुलन, aSyn की तरह, की संभावना कल्याण और रोग के लिए योगदान.

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक सरल अभी तक शक्तिशाली तकनीक को PP2Ac की क्षमता का निर्धारण करने के लिए विभिंन उपचार के जवाब में एक phosphopeptide सब्सट्रेट dephosphorylate है । उदाहरण के लिए, यह एक ही पद्धति ऐसी ceramides के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपंयास चिकित्सीय३४, या इन विट्रो मेंPP2Ac अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के रूप में अंय PP2Ac उत्प्रेरक, परीक्षण किया जा सकता है । यह भी कहना है कि इसी तरह की परख PP2Ac कि कोशिका निष्कर्षों या शरीर के ऊतकों से 1D6 immunoprecipitation द्वारा अलग किया गया है की गतिविधि उपाय कर सकते है महत्वपूर्ण है, के रूप में पहले लेखकों द्वारा वर्णित12,19, 25. मैलाकाइट ग्रीन परख के लिए भविष्य अनुप्रयोगों PP2Ac गतिविधि को मापने से परे मौजूद हैं, के रूप में एटीपी गतिविधि भी ऐसे एक परख का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है ।

ध्यान दें, एक मानक वक्र प्रत्येक स्वतंत्र PP2Ac परख के लिए हर बार उत्पंन किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य है कि सभी एजेंट इस्तेमाल किया फॉस्फेट मुक्त हैं, के रूप में मुक्त फॉस्फेट कृत्रिम रूप से पृष्ठभूमि संकेत बढ़ाने के लिए और गलत परिणाम का उत्पादन. परख के दिन यह सभी नमूनों के लिए पर्याप्त ताजा MGT समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक है के लिए परख सकता है । इसके अलावा, MGT दिन है कि यह बनाया है और कुछ ही घंटों के बाद हाला करने के लिए जाता है केवल अच्छा है । PP2Ac एक विक्रेता से खरीदा aliquotted होना चाहिए और जल्द ही जम के बाद यह स्थिर गल चक्र है कि अपनी गतिविधि को कम करने को रोकने के लिए प्राप्त हुआ है जमे हुए संग्रहीत । अन्य phosphatases के रूप में पीटी सब्सट्रेट dephosphorylate कर सकते हैं (जैसे PP1 और PP5३५), जब सेल या ऊतक निष्कर्षों का विश्लेषण कर रहा है जिसमें PP2Ac immunoprecipitation द्वारा अलग नहीं किया गया है, नमूनों को मुक्त फॉस्फेट को दूर करने के लिए स्तंभों पर पारित किया जाना चाहिए और phosphatases के विशिष्ट अवरोधकों फॉस्फेट विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के रूप में पहले18वर्णित ।

Disclosures

डॉ पेरेस १९९९-२०११ से पिट्सबर्ग स्कूल ऑफ मेडिसिन के विश्वविद्यालय में न्यूरोलॉजी विभाग में संकाय के एक सदस्य था ।

Acknowledgments

लेखक पहले प्रयोगशाला सदस्य केंद्र Mackett, सैंड्रा कीचड़, और जिे चेन जो विधि का अनुकूलन के लिए काम द्वारा प्रयासों की सराहना करते हैं । लेखक भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन, टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र El Paso विद्वानों गतिविधि अनुसंधान परियोजना (सर्प), Lizanell और Colbert Coldwell फाउंडेशन, एकाधिक प्रणाली शोष गठबंधन धंयवाद, परिवार अनुसंधान लादने, और इस अनुसंधान के वित्तीय सहायता के लिए अंना मॅई डॉयल उपहार कोष ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२६ वर्णमिति परख dephosphorylation मैलाकाइट फॉस्फेट फॉस्फेट गतिविधि PP2A उत्प्रेरक उपइकाई संयोजक प्रोटीन synucleins threonine phosphopeptide

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

संयोजक α-β-and γ-Synucleins उत्तेजित प्रोटीन फॉस्फेट 2a उत्प्रेरक उपइकाई गतिविधि सेल मुक्त परख में
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Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

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