Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekombinant α-β - och γ-Synucleins stimulera Protein 2A katalytisk subenhet fosfatasaktiviteten Cell gratis analyser

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Denna skrift presenterar ett protokoll som visar hur man mäter aktiviteten av rekombinant protein fosfatas 2A katalytisk subenhet (PP2Ac) som svar på rekombinant α-synuclein, β-synuclein eller γ-synuclein proteiner med en enkel kolorimetriska analys. Vi visar slutsatser angående α-synuclein specificitet mot PP2Ac i mus hjärnan.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) och γ-Synuclein (gSyn) är ett bevarat familjemedlemmar i förkläde-liknande proteiner som uttrycks mycket i ryggradsdjur neuronala vävnader. Av de tre synucleins, har endast aSyn varit starkt inblandad i neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom, demens med Lewy organ och multipel systematrofi. Studerar normala aSyn funktion, indikerar data att aSyn stimulerar aktiviteten hos den katalytiska subuniten av en rikligt uttryckta dephosphorylating enzym, PP2Ac in vitro och in vivo. Tidigare data visar att aSyn aggregation i mänskliga hjärnan minskar PP2Ac aktivitet i regioner med Lewy body patologi, där lösliga aSyn blivit olösliga. Eftersom alla tre synucleins har avsevärd homologi i de amino syra ordnar, utformades dock experiment att testa om alla kan modulera PP2Ac aktivitet. Med hjälp av rekombinant synucleins och rekombinant PP2Ac protein, bedömdes aktivitet av malakitgrönt kolorimetriska analys. Uppgifterna visade att alla tre rekombinant synucleins stimulerade PP2Ac aktivitet i cellfria analyser, öka möjligheten att de bevarade homologi mellan synucleins kan förse alla tre homologs med förmåga att binda till och aktivera PP2Ac. Co-immunoprecipitation data, tyder dock på att PP2Ac modulering sannolikt sker genom endogena interaktioner mellan aSyn och PP2Ac in-vivo.

Introduction

Studier som fastställer fördelningen av synucleins i hjärnan och ryggmärgen visar att alla tre synucleins är berikad med neurala vävnader, även om varierande mönster av lokalisering har rapporterat1. Exempelvis aSyn är vanligast förekommande på presynaptiska platser i cerebral cortex och basala ganglierna2,3, bSyn har en mer enhetlig fördelning i hjärnan och ryggmärgen4,5och gSyn är rikligare i ryggmärgen och perifera ganglier6. Även om vissa embryonala uttryck för alla synucleins kan förekomma, blivit de tre homologs mer riklig under den neonatala periodiska4,5,6,7,8. Anmärkningsvärt, data från synuclein trippel knockoutmöss, visar att förlusten av alla tre synucleins orsakar ålder debut neuronal dysfunktion9, stödja viktiga synuclein funktioner i centrala nervsystemet (CNS)10, 11. det är ännu inte känt om synuclein trippel knockoutmöss visar förändringar i PP2Ac distribution eller aktivitet. Data från enda synuclein knockoutmöss visar att förlusten av aSyn ensam kan avsevärt minska PP2Ac aktivitet i hjärnan12. Utöver CNS lokalisera alla synucleins till andra vävnader i hela kroppen13,14,15.

På grund av dess väletablerade genetiska kopplingar till neurodegeneration16,17studeras aSyn bland bästa av de tre synucleins. Perez laboratoriet har länge arbetat för att definiera normala funktionella aktiviteter av aSyn, särskilt i CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 och mer nyligen i perifera vävnader24,25. Bland dessa var upptäckten att aSyn spelar en viktig reglerande roll i stimulerande PP2Ac aktivitet19. PP2A verksamhet bidrar allmänt till normal hjärnfunktion, bland annat för regleringen av dopamin produktionen26. Den PP2A holoenzyme består av tre oberoende subenheter, den katalytiska C subenheten, PP2Ac, en byggnadsställning A subenheten och en av flera olika reglerande/inriktning B subenheter som hjälper lokalisera PP2A till specifika subcellulär microdomains, vilket ger PP2A funktionella mångfald27. Bevis visar att aSyn interaktioner med PP2Ac bidra avsevärt till dess fosfatas aktivitet in vitro- och in-vivo12,19,21,23, 25. När aSyn ackumuleras i protein aggregat, som när Lewy organ form släpper nervceller av Parkinsons sjukdom och demens med Lewy organ (DLB), vävnader med aggregerade aSyn har minskat PP2Ac aktivitet23,25, när halter av lösliga aSyn minska. Tanke på att alla tre synucleins har betydande homologi28 (aSyn aktier 66% identitet med bSyn och 56% med gSyn) och denna aSyn bidrar till aktivering av PP2Ac, det var en hypotes om att alla medlemmar av familjen synuclein protein kan kunna öka PP2Ac aktivitet, åtminstone in vitro. För att bedöma detta, mättes PP2Ac aktivitet svar på rekombinant aSyn, bSyn och gSyn med en enkel kolorimetriska analys, modellerad efter metoden i Fathi o.a. 29. denna metod och romanen resultaten beskrivs häri.

Protocol

1. beredning av buffertar och reagenser

  1. Beredning av p-nitrofenylfosfat fosfatbuffert (pNPP)
    1. Förbereda 50 mL pNPP buffert enligt följande.
    2. Väg upp 0.30285 g Tris base (se Tabell av material) och lös upp den i 25 mL ultrarent avjoniserat vatten.
      1. Tillsätt 41,6 µL av 120 mM CaCl2. Justera till pH 7.0 med 1 M HCl och föra den slutliga lösning volymen 50 mL med ultrarent avjoniserat vatten.
      2. Säkerställa att den slutliga koncentrationen 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0.
      3. Lagra pNPP buffert på 4 oC.
  2. Malakitgrönt lösningar kan förbereda följande.
    1. Förbereda lösning A genom att lägga till 32,8 mL koncentrerad HCl till 67,2 mL ultrarent avjoniserat vatten för att skapa en 4 M HCl-lösning.
      Obs: Malakit lösningen bereds i ett dragskåp med engångshandskar, ansikte-mask och skyddsglasögon.
    2. Förbereda lösning B väger 4,2 g ammoniummolybdat och lägger den till 95,8 mL lösning A.
    3. Bered C genom vägning ut 0,045 g Malakit grön oxalat salt och lägga till ultrarent avjoniserat vatten för att få den slutliga totala volymen 100 mL.
    4. Bered D genom att blanda lösningar B och C i 1:3 (v/v), rör om under 1 h i rumstemperatur.
    5. Filtrera Lösningen D genom en 0,22 µm porstorlek storlek nitrocellulosa membran filterenhet med en 50 mL spruta.
    6. Lagra beredda malakit lösning på 4 oC skyddas från ljus.
  3. Beredning av aktivator
    1. För att förbereda en 1% avjoniserat tween 20 lösning, pipett 10 µL av tween 20 till 990 µL av ultrarent vatten (v/v) sedan vortex tills interpoleringen 20 löser sig helt.
  4. Beredning av malakitgrönt Tween 20 (MGT) fungerande lösning.
    1. Blanda aktivator (steg 1.3) med malakitgrönt lösningen (lösning D, steg 1.2.5) i förhållandet 1: 100 (t.ex. 1 µL aktivare till 99 µL malakitgrönt lösning).
  5. Beredning av treonin phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) substrat.
    1. För att förbereda en 2 mM lager, plats en 1 mg phosphopeptide injektionsflaska på is, tillsätt 550 µL av ultrarent avjoniserat vatten och vortex försiktigt för att lösa upp.
      1. Göra ~ 10 portioner och lagra pT på-20oC.
  6. Synuclein förberedelse
    1. Förbereda synucleins i dragskåp med engångshandskar, ansikte-mask och skyddsglasögon.
    2. Återsuspendera 1 mg rekombinant synuclein i 1 mL ultrarent avjoniserat vatten för en slutlig koncentration av 1 mg/mL.
    3. Vortexblanda försiktigt att upplösa och placera på is.
    4. Förbereda 50 µL portioner och förvaras vid-80 oC.
  7. Utarbetandet av fosfat standarder
    1. Förbereda 0,1 mM fosfat stamlösning enligt följande.
      1. Väg upp 0.1361 g KH2PO4 och placera i en bägare med 80 mL ultrarent avjoniserat vatten. Lägga till en uppståndelse bar och blanda att upplösa. Överföra all lösning till en graderad cylinder och föra den slutliga totala volymen med ultrarent avjoniserat vatten till 100 mL.
      2. Filtrera hela lösningen genom ett 0,22 µm porstorlek storlek nitrocellulosa membran filterenhet med en 50 mL spruta; den slutliga koncentrationen är 10 mM.
      3. Späd den lösning (10 mM) 1: 100; den slutliga koncentrationen blir 0,1 mM fosfat (PO4) som ska användas för analysen standarder.
      4. Lagra fosfat stamlösning på 4 oC.
    2. Se tabell 1 för att begränsa utspädningar brukade göra PO4 standarder med en totala slutvolymen av 1250 µL varje. Lägga till lämplig mängd fosfat och ultrarent avjoniserat vatten 1,5 mL rör enligt tabell 1.
      1. Store beredd PO4 standarder på-20 oC.
Fosfat standarder
0,1 mM PO4 lösning (mL) 0 75 150 300 600 1,200
Ultrarent avjoniserat vatten (mL) 1 250 1 175 1.100 950 650 50
Slutlig koncentration på PO4 [pmol] 0 150 300 600 1,200 2 400

Tabell 1: Fosfat standarder.

2. PP2A Assay svar på rekombinant Synucleins

Obs: Den totala slutliga volymen för varje reaktion blir 60 µL, så försöksledaren måste justera den ursprungliga volymen av pNPP buffert på lämpligt sätt för att rymma volymen av synucleins som används för varje prov. I de flesta fall blir volymen av pNPP buffert mellan 40 och 44 µL.

  1. Förbereda varje PP2Ac reaktion som följer.
    1. I en 1,5 mL tub, tillsätt 39 µL pNPP buffert och plats på is.
    2. Tillsätt 1 µL (105 ng/µL eller 0.0007 U/µL) humant rekombinant PP2Ac (rPP2Ac).
    3. Tillsätt 4 µL 0, 1,5, 7,5, 15 eller 30 µM synucleins till rPP2Ac i pNPP buffert för slutliga koncentrationer av 0, 0,1, 0,5, 1,0 och 2,0 µM och inkubera vid 4 ° C i 30 min på en roterande enhet; den slutliga volymen blir 60 µL.
    4. Efter 30 min, flytta prover till is och tillsätt 16 µL av 2 mM pT substrat.
    5. Inkubera varje PP2A assay blandningen i 10 min vid 30 ° C i ett vattenbad med intermittent skakar.
    6. Till en platt bottenplattan med 96 brunnar, tillsätt 25 µL av varje PO4 standard (0, 150, 300, 600, 1200 och 2400 pmol) i dubbla brunnar från låg till hög.
    7. Lägg sedan till 25 µL av varje experimental prov (PP2A assay ± synuclein), förberett i steg 2.1.1 till 2.1.6, till dubbla brunnar på den samma plattan med 96 brunnar.
    8. Lägg sedan till 75 µL av MGT fungerande lösning till varje brunn innehållande standarder och prover.
    9. Lämna plattan i rumstemperatur i 10 min.
    10. Observera en färgförändring i prover med mätbara skillnader i fosfatnivåerna.

3. fotometrisk analys

  1. Analysera den plattan med 96 brunnar som innehåller standarder och prover med en spektrofotometrisk Plattläsare med våglängden anges till 630 nm29.
  2. Rita kurvan absorbansen produceras (prover läsa vid 630 nm) och notera att det fortfarande är linjär upp till 2.400 pmol koncentration av PO4.

Representative Results

Proteinfunktion och aktivitet kan ändras genom inlägget translationella modifieringar, såsom fosforylering. Många proteiner kan fosforyleras av ett Kinas eller defosforyleras av ett fosfatas. När det gäller protein fosfatas 2A (PP2A), denna multisubunit fosfatas underlättar Defosforylering av serine och treonin rester på ett stort antal phosphoproteins. Onormal PP2A aktivitet kan leda till dysreglering av proteinfunktion som uppstår i många sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom där aSyn kan bli hyperphosphorylated, och Alzheimers sjukdom där proteinet tau kan bli hyperphosphorylated. Detta motiverat för att optimera ett internt förfarande för att snabbt utvärdera PP2Ac aktivitet och avgöra om onormal PP2Ac aktivitet kan leda till cellulär dysfunktion.

Använder denna cellfria kolorimetriska analys, PP2Ac aktivitet mättes genom att kvantifiera mängden gratis PO4 klyvs från pT substratet (figur 1A) och jämfört med kända picomolar mängder PO4 i standardkurvan (figur 1B ). PP2Ac aktivitet mättes också svar på 0,0 0,1, 0,5, 1,0 och 2,0 µM synucleins (figur 1A), jämfört med baslinjen PP2Ac aktivitet i avsaknad av extra synuclein (vid stora pilen i figur 1A).

Figure 1
Figur 1 : PP2A aktivering av rekombinant synucleins, mäts i förhållande till kända nivåer av fosfat i standarder. (A) aSyn, bSyn och gSyn utvärderades i ett intervall från 0 - 2 µM protein koncentrationer, att jämföra med 0 - 2400 pmol PO4 standarder. (B) en standardkurvan för malakitgrönt PP2Ac analysen skapades för att ge kända mängder fosfat mot vilka värden som erhålls under experimentella förhållanden kan beräknas. I alla fall, när PP2Ac aktivitet ökar, mängden gratis PO4 klyvs från pT underlaget ökar och ger en mörkare grön färg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Resultaten visar att tillägg av synucleins till PP2Ac i den första INKUBERINGSSTEGET kan öka mängden gratis PO4 mätt, därmed visar ökad PP2Ac aktivitet. Den statistiska analysen efter många upprepningar visar att alla tre rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) avsevärt öka PP2Ac aktivitet (figur 2). Dessa resultat tyder på att förändringar av mängden lösligt cellulär synucleins kan ändra PP2Ac verksamhet. och därmed kan påverka cellernas homeostas. Det är inte känt, men om alla tre synucleins bidra till aktiveringen av PP2Ac i vivo, men data i figur 3 föreslår att aSyn sannolikt bidrar till PP2Ac aktivitet i vivo.

Figure 2
Figur 2 : PP2Ac aktivitet stimuleras av alla tre synucleins. Grafisk representation av PP2Ac aktivering svar på varierande koncentrationer av rekombinant aSyn, bSyn eller gSyn visas. Alla tre rekombinant synucleins stimuleras PP2Ac aktivitet. aSyn i de flesta experiment tycktes vara något mer potent, om ANOVAs utförs med hjälp av statistisk programvara vore anmärkningsvärt liknande övergripande. Uppgifterna utgör den medelvärde ± SEM 4-9 oberoende experiment. ns, inte betydande; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att bedöma vilka synuclein(s) kan interagera med PP2Ac i hjärnan, utfördes co-immunoprecipitation (Co-IP) analyser med vildtyp mus hjärnan och PP2Ac-specifika-antikroppen, 1 d 6. Proteiner skildes sedan av SDS-PAGE och blotting var utforskad för PP2Ac, aSyn, bSyn och gSyn med hjälp av etablerade metoder19. Rekombinant synuclein kontroller visar aSyn, bSyn och gSyn antikropp specificitet (figur 3A). Co-IP data avslöja att den stora synuclein som förknippas med PP2Ac i hjärnan var aSyn, som mycket mindre bSyn kom för co-IP (figur 3B) och ingen gSyn kom för Co-IP (inga data anges). Detta tyder på en distinkt roll för endogena aSyn i regleringen av PP2Ac i hjärnan. Det väcker också möjligheten att PP2Ac modulering med bSyn-baserade-behandlingar kunde ha potential att återställa PP2A aktivitet i de med synucleinopathy, som bSyn är kända för att vara nonamyloidogenic ännu som visas här kan stimulera PP2Ac30, 31.

Figure 3
Figur 3: Interaktion av PP2Ac med endogena synucleins i mus hjärna. (A) rekombinant aSyn, bSyn och gSyn var utforskad med synuclein specifika antikroppar som beskrivs nedan. (B) använda musen hjärnan Homogenatet Co-IP utfördes med antikropp 1 d 6, då prover analyserades på immunoblots. Data visas för PP2Ac, aSyn och bSyn, men inte för gSyn som gjorde inte Co-IP med PP2Ac. Start prover visar relativa nivåer av PP2Ac (lane 1), aSyn (lane 4), och bSyn (lane 7) i den ursprungliga homogenates. Slutet prover visar återstående nivåerna av PP2Ac (lane 2), aSyn (lane 5), och bSyn (lane 8) i homogenates efter 1 d 6 PP2Ac Co-IP. Betydande halter av PP2Ac var immunoprecipitated med 1 d 6 antikropp (lane 3), som också förde ned rikliga mängder av aSyn (lane 6, på pilen) men mycket lite bSyn (lane 9, starkt överexponerad för att visa signalen för svag bSyn, på pilen). * Asterisker och hakparenteser mark det icke-specifikt signaler på blots. Se Tabell för material för detaljer på antikroppar används. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Denna malakitgrönt analys med pT användes för att mäta PP2Ac verksamhet eftersom det är enklare att utföra än den klassiska metoden som använder 32P-märkt substrat. En annan fördel med denna analys över radioaktiva analyser är att radioisotoper utgöra vissa risker och kan bli kostsamt, särskilt 32P-märkta molekyler som har kort halveringstid, vilket begränsar antalet analyser man kan utföra innan reagenser löper ut. Med hjälp av malakitgrönt i stället för att radioaktiviteten också eliminerar behovet av att förfoga över 32avfall P. Malakitgrönt analyserna är också ganska känslig när man mäter aktiviteten av serin/treonin fosfataser jämfört med en annan kolorimetriska analys som använder de substrat p-nitrophenylphosphate (pNPP), som är icke-selektiv eftersom det kan vara defosforyleras av ett stort antal enzymer32.

Kommersiella malakitgrönt kit att mäta PP2A aktivitet har funnits länge och användes tidigare i laboratoriet. När du gör många malakitgrönt analyser, blev dock sådana kit oöverkomligt dyra. Dessutom kommersiella kit för PP2A verksamhet är stabila endast för ett år, medan att ha reagenser tillgängliga i pulveriserad form och med korrekt förvaring ger lättillgänglig assay komponenter som är strukturellt stabila under lång tid.

Innan testning bSyn och gSyn, användes aSyn som positiv kontroll att stimulera PP2Ac verksamhet fastställa beloppet för PP2Ac krävs för analyserna, och också att bekräfta att resulterande data finns kvar på skalan med standardkurvan (150-2400 pmol PO4 ). Det är anmärkningsvärt att om aSyn stimulerar PP2Ac alltför starkt, även om reaktionen är vanligtvis linjär, data kommer att gå av skala och kemikalier i MGT lösningen fällningen, vilket gör det omöjligt att mäta exakta mängder släpptes fri-PO4 med en tallrik läsare.

Med tanke på att aSyn bidrar till PP2Ac aktivitet in vivo och in vitro-12,19,21,23,25, och att alla synucleins har avsevärd homologi, det hade varit hypotesen att alla synuclein familjemedlemmar kan stimulera PP2Ac i cell gratis analyser. Med kolorimetriska analys beskrivs här, konstaterades det att faktiskt alla tre rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) stimulerade PP2Ac verksamhet, öka möjligheten att alla tre synucleins kan utföra liknande funktioner i nervsystemet. Men hjärnan från Parkinson eller demens med Lewy Body fall har mindre PP2Ac aktivitet i vävnader som innehåller starkt aggregerade aSyn23. Mus vävnader härbärgerat Lewy body-liknande patologi uppvisar också nedsatt PP2Ac aktivitet25. Detta, och nya data i figur 3 samt tidigare data från aSyn knockout möss12, tyder starkt på att varken bSyn eller gSyn vanligtvis kan kompensera förlusten av lösliga aSyn i hjärnan, eller alternativt att dessa synuclein homologs får inte associera med PP2Ac så starkt som aSyn som visas (figur 3). Allen hjärnan Atlas visar colocalization av alla tre synuclein mRNA i många områden i hjärnan, och även trippel synuclein knockoutmöss har varit genererade9,33, PP2Ac aktivitet inte har utvärderats i denna modell. Intressant aSyn som är fosforyleras på Ser129 av Polo-liknande Kinas 2, är mindre duglig till aktivera PP2Ac12, men bevis visas här för bSyn föreslår att bSyn fosforylering är osannolikt att påverka PP2Ac aktivitet, som mycket lite bSyn kom ner med PP2Ac i mus hjärnan (figur 3). Sammantaget tyder data att endogena PP2Ac aktivitet modulatorer, som aSyn, sannolikt bidra till välbefinnande och sjukdom.

Protokollet som beskrivs här är en enkel men ändå kraftfull teknik för att bestämma PP2Ac förmåga att dephosphorylate ett phosphopeptide substrat som svar på olika behandlingar. Exempelvis kan detta samma metod användas att testa andra PP2Ac aktivatorer, såsom ceramider samt potentiella roman therapeutics34, eller för att bedöma effekten av PP2Ac-hämmare i vitro. Det är också viktigt att påpeka att liknande analyser kan mäta aktiviteten av PP2Ac som har isolerats av 1 d 6 immunoprecipitation från cell extrakt eller kroppens vävnader, som tidigare beskrivits av författarna12,19, 25. framtida applikationer för malakitgrönt analysen finns utöver mäta PP2Ac aktivitet, som ATP aktivitet kan också bestämmas med hjälp av en sådan analys.

Observera att en standardkurva måste genereras varje gång för varje oberoende PP2Ac assay. Det är obligatoriskt att säkerställa att alla reagenser som används är fosfat gratis, såsom gratis fosfater artificiellt öka bakgrund signal och ge felaktiga resultat. På dagen för analysen är det nödvändigt att förbereda tillräckligt frisk MGT lösning för alla prover som analyseras. Dessutom är MGT bara bra den dag som den görs och tenderar att fällningen efter några timmar. PP2Ac köpt från en leverantör måste vara aliquotted och lagras frysta snart efter det tas emot för att förhindra frysning tö cykler som minskar dess aktivitet. Som andra fosfataser kan dephosphorylate pT substratet (t.ex. PP1 och PP535), när man analyserar cell eller vävnad extrakt där PP2Ac inte har isolerats av immunoprecipitation, prover måste skickas via kolumner ta bort gratis fosfater och specifik hämmare av fosfataser måste användas för att bekräfta fosfatas specificitet, som tidigare beskrivits18.

Disclosures

Dr. Perez var en medlem av fakulteten i Institutionen för neurologi vid University of Pittsburgh School of Medicine från 1999 – 2011.

Acknowledgments

Författarna uppskattar ansträngningar av tidigare laboratorium medlemmar Kendra Mackett, Sandra Slusher och Jie Chen som arbetat för att optimera metoden. Författarna vill även tacka den National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech universitet Health Sciences Center El Paso vetenskaplig aktivitet forskning projektet (SARP), Lizanell och Colbert Coldwell Foundation, flera System atrofi koalition, Hoy Family Research och Anna Mae Doyle gåva medel för finansiellt stöd av denna forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

Neurovetenskap fråga 126 kolorimetriska analys Defosforylering malakit fosfat fosfatasaktiviteten PP2A katalytisk subenhet rekombinanta proteiner synucleins treonin phosphopeptide

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Rekombinant α-β - och γ-Synucleins stimulera Protein 2A katalytisk subenhet fosfatasaktiviteten Cell gratis analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter