Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekombinant α-β ve γ Synucleins Protein fosfataz 2A katalitik alt birim faaliyet hücre ücretsiz deneyleri teşvik

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu yayın rekombinant α-synuclein, β-synuclein veya basit bir kolorimetrik yöntemi kullanarak γ-synuclein protein karşılık olarak rekombinant protein fosfataz 2A katalitik alt birimi (PP2Ac) etkinliğini ölçmek nasıl gösteren bir protokolü sunar. Fare beyninde PP2Ac doğru α-synuclein özgüllük ile ilgili bulgular göstermektedir.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) ve γ-Synuclein (gSyn) son derece omurgalı nöronal dokularda ifade edilir refakatçi gibi proteinler korunmuş bir ailenin üyesidir. Üç synucleins sadece aSyn şiddetle nörodejeneratif hastalıklarda Parkinson hastalığı, demans Lewy organları ve birden çok sistem Atrofi gibi karıştığı olmuştur. Normal aSyn işlevi okumak, o aSyn bir katalitik alt birimi bir bol ifade dephosphorylating enzimi, PP2Ac içinde in vitro ve in vivoaktivitesi uyarır verileri belirtmek. Önceki veriler aSyn toplama insan beyninin içinde PP2Ac aktivite ile Lewy body patoloji, nerede çözünür aSyn çözünmez hale gelmiştir bölgelerde azaltır göstermektedir. Ancak, tüm üç synucleins amino asit serilerinde önemli homoloji olduğundan, deneyler tüm PP2Ac aktivite modüle Eğer test etmek için tasarlanmıştır. Rekombinant synucleins ve rekombinant PP2Ac protein kullanarak, etkinlik malakit yeşil Renkölçer tahlil tarafından değerlendirildi. Veri tüm üç rekombinant synucleins synucleins arasında korunmuş homoloji bağlamak ve PP2Ac harekete geçirmek için yeteneği ile tüm üç homologs bağışlamak olasılığını yükseltmek, boş hücre deneyleri faaliyete PP2Ac uyarılmış saptandı. Co-immunoprecipitation verileri, ancak, PP2Ac modülasyon muhtemel aSyn ve PP2Ac in vivoarasındaki endojen etkileşimler yoluyla oluşur göstermektedir.

Introduction

Yerelleştirme değişen kalıpları olmasına rağmen synucleins dağıtım beyin ve omurilik gösteri tüm üç synucleins sinirsel dokularda zenginleştirilmiş tanımlama çalışmaları1bildirdi. Örneğin, aSyn,2,3serebral korteks ve Bazal gangliyon presynaptic sitelerdeki en bol olduğu, bSyn beyin ve omurilik4,5' te daha düzgün bir dağılımı gösterir ve gSyn omurilik daha bol ve periferik gangliyon6. Her ne kadar tüm synucleins bazı embriyonik ifade ortaya çıkabilir, üç homologs neonatal dönem4,5,6sırasında,7,8daha bol olmak. Dikkat çekici, synuclein Tek Kişilik nakavt fareler, verileri göstermek tüm üç synucleins kaybı merkezi sinir sistemi (MSS)10', önemli synuclein fonksiyonları destekleyerek yaş başlangıçlı nöronal fonksiyon bozukluğu9, neden olur 11. Eğer synuclein üçlü nakavt fareler değişiklikleri kaldırma veya PP2Ac dağıtım henüz bilinmemektedir. Tek synuclein nakavt fareler verilerinden ortaya çıkarmak aSyn yalnız kaybı önemli ölçüde beyin12PP2Ac etkinliğini azaltmak yapabiliyor. CNS yanı sıra diğer dokulara vücut13,14,15boyunca tüm synucleins belirle.

Ateş16,17, köklü genetik bağlantıları nedeniyle, aSyn en iyileri arasında üç synucleins incelenmiştir. Perez laboratuvar uzun aSyn, normal işlevsel faaliyetler özellikle CNS11,12,18,19',20,21tanımlamak için çalıştı, 22,23 ve son zamanlarda periferik dokulara24,25. Bunlar arasında o aSyn keşif uyarıcı PP2Ac etkinlik19' önemli bir düzenleyici rol oynar. PP2A faaliyet normal beyin fonksiyonu, dopamin üretim26düzenlenmesi için de dahil olmak üzere yaygın olarak katkıda bulunur. PP2A holoenzyme oluşan üç bağımsız alt birimleri, katalitik C alt birimi, PP2Ac, iskele A alt birim ve PP2A böylece PP2A sağlayan belirli hücre altı microdomains için yerelleştirilmesine yardımcı çeşitli farklı düzenleyici/hedefleme B alt biri İşlevsel Çeşitlilik27. Kanıt PP2Ac ile aSyn etkileşimleri onun fosfataz aktivitesi vitro ve in vivo12,19,21,23önemli ölçüde katkıda bulunmak gösterir, 25. Lewy organları nöronlar içinde şeklinde Parkinson hastalığı ve demans Lewy organları (DLB) ile zaman olduğu gibi aSyn protein toplamları, biriken zaman toplanan aSyn kurcalayarak PP2Ac etkinliği23,25azaldı, ne zaman çözünür aSyn düzeylerini azaltmak. Verilen bu önemli homoloji28 tüm üç synucleins var (aSyn hisse % 66 kimlik bSyn ve gSyn ile % 56) ve bu aSyn PP2Ac harekete geçirmek katkıda bulunur, synuclein protein ailesinin tüm üyeleri, mümkün olabileceğini onaylanmadığına karar En azından PP2Ac aktivite artışı vitro. Bunu değerlendirmek için PP2Ac etkinlik rekombinant aSyn, bSyn ve gSyn basit bir kolorimetrik yöntemi, Fathi vd. yöntemin ardından örnek alınarak kullanarak yanıt ölçüldü 29. bu yöntem ve yeni bulgular burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protocol

1. hazırlanması arabellekleri ve Kimyasalları

  1. P-nitrophenyl fosfat (pNPP) arabellek hazırlanması
    1. PNPP arabellek 50 mL aşağıdaki gibi hazırlayın.
    2. 0.30285 g Tris Bankası tartmak ( Tablo reçetesigörmek) ve 25 mL ultrasaf deiyonize su geçiyoruz.
      1. 120 mM CaCl241.6 µL ekleyin. PH 7,0 1 M HCl ile uyum ve ultrasaf deiyonize su ile 50 mL nihai çözüm cilt getirmek.
      2. Son konsantrasyonu 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0 olduğundan emin olun.
      3. PNPP arabellek 4 oC., mağaza
  2. Malakit yeşil çözümler için aşağıdakileri hazır olun.
    1. Çözüm A 4 M HCl bir çözüm oluşturmak için ultrasaf deiyonize su 67.2 mL konsantre HCL 32,8 mL ekleyerek hazırlayın.
      Not: Malakit çözüm tek kullanımlık eldiven, yüz maskesi ve koruyucu gözlük kullanan bir duman mahallede hazırlanır.
    2. Amonyum molibdat 4.2 g ağırlığında ve çözüm A. 95.8 mL için ekleyerek Çözüm B hazırlamak
    3. Çözüm C 0,045 g malakit yeşil oksalat tuz ağırlığında ve son Toplam hacim için 100 mL getirmek için ultrasaf deiyonize su ekleyerek hazırlayın.
    4. Çözüm D Solutions'da B ve C 1:3 (v/v) oranı, oda sıcaklığında 1 h için heyecan karıştırarak hazırlayın.
    5. Çözüm D 50 mL şırınga kullanarak bir 0,22 µm gözenek boyutu nitroselüloz membran filtre birimi üzerinden filtre.
    6. 4 oışıktan korunan C hazırlanan malakit çözüm saklayın.
  3. Harekete geçirmek hazırlanması
    1. % 1 hazırlamak için girdap ara 20 kadar tamamen çözülür sonra ara 20 çözüm, pipet 10 µL aranın 20 ultrasaf, 990 µL içine su (v/v) deiyonize.
  4. Malakit yeşil ara 20 (MGT) çalışma çözüm hazırlanması.
    1. 1: 100 (örneğin 1 µL harekete geçirmek için 99 µL malakit yeşil çözüm) oranında malakit yeşil çözüm (çözüm D, adım 1.2.5) ile belgili tanımlık harekete geçirmek (Adım 1.3) karıştırın.
  5. Treonin phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) hazırlanması substrat.
    1. 2 mM hisse senedi, yer 1 mg phosphopeptide şişe buzda hazırlamak ultrasaf deiyonize su ve girdap hafifçe geçiyoruz 550 µL ekleyin.
      1. ~ 10 aliquots yapmak ve pT-20oc, mağaza
  6. Synuclein hazırlık
    1. Synucleins tek kullanımlık eldiven, yüz maskesi ve koruyucu gözlük kullanan bir duman başlıklı hazırlayın.
    2. 1 mL ultrasaf deiyonize su son konsantrasyonu 1 mg/mL için rekombinant synuclein 1 mg resuspend.
    3. Girdap hafifçe geçiyoruz ve Buza koyun.
    4. 50 µL aliquots hazırlamak ve-80 oC. depolamak
  7. Fosfat standartların hazırlanması
    1. 0,1 mM fosfat hisse senedi çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın.
      1. 0.1361 g KH2PO4 tartmak ve 80 mL ultrasaf deiyonize su ile bir ölçek yerleştirin. Bir heyecan bar ve çözülmeye karışımı ekleyin. Tüm çözüm için mezun silindir aktarmak ve ultrasaf deiyonize su ile 100 mL son Toplam hacim getirmek.
      2. 50 mL şırınga kullanarak bir 0,22 µm gözenek boyutu nitroselüloz membran filtre birimi aracılığıyla tüm çözüm filtre; son konsantrasyonu 10 mM boyundadır.
      3. Seyreltik çözüm (10 mM) 1: 100; son konsantrasyonu tahlil standartları için kullanılmak üzere 0,1 mM fosfat (PO4) olacaktır.
      4. 4 oC., fosfat hisse senedi çözüm depolamak
    2. Bkz. Tablo 1 PO4 standartları 1250 µL her bir son toplam hacmi ile yapmak için kullanılan dilutions sınırlandırmak için. Fosfat ve ultrasaf deiyonize su uygun miktarını 1.5 mL tüpler başı olarak tablo 1 ekleyin.
      1. PO4 -20 oc standartlarda hazırlanan mağaza
Fosfat standartları
0,1 mM PO4 çözüm (mL) 0 75 150 300 600 1200
Ultrasaf deiyonize su (mL) 1250 1,175 1100 950 650 50
Son konsantrasyonu PO4 [pmol] 0 150 300 600 1200 2400

Tablo 1: Fosfat standartları.

2. PP2A tahlil rekombinant Synucleins yanıt olarak

Not: deneyci pNPP arabellek ilk hacmi uygun şekilde her örnek için kullanılan synucleins hacmini karşılamak için ayarlamanız gerekir bu yüzden toplam son hacim her reaksiyon için 60 µL olacaktır. Çoğu durumda, pNPP arabellek hacmi 40 ve 44 µL arasında olacak.

  1. Her PP2Ac reaksiyon aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Bir 1,5 mL tüp, buza 39 µL pNPP arabellek ve yer ekleyin.
    2. İnsan rekombinant PP2Ac 1 µL (105 ng/µL veya 0.0007 U/µL) Ekle (rPP2Ac).
    3. 0, 1.5, 7.5, 15 veya 30 µM synucleins rPP2Ac için 0, 0.1, 0,5 son konsantrasyonları pNPP arabellekte için 4 µL, 1.0 ve 2.0 µM ekleyin ve 30 dk dönen bir birim için 4 ° C'de kuluçkaya; son hacim 60 µL olacak.
    4. 30 dakika sonra buz ve 2 mM pT substrat 16 µL eklemek için örnekleri taşıyın.
    5. Her PP2A tahlil karışımı ile aralıklı sallayarak bir su banyosunda 30 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya.
    6. 25 µL her PO4 standart bir düz dipli 96-şey plakasına eklemek (0, 150, 300, 600, 1200 ve 2.400 pmol) yüksek düşük üzerinden yinelenen Wells.
    7. Sonraki adımları 2.1.1 2.1.6, wells aynı 96-şey plaka üzerinde çoğaltmak için hazırlanan her örneğinin deneysel (PP2A tahlil ± synuclein), 25 µL ekleyin.
    8. Sonra 75 µL MGT çalışma çözüm her iyi standartlar ve örnekleri içeren ekleyin.
    9. Plaka, oda sıcaklığında 10 dakika bırakın.
    10. Bir renk örneklerinde fosfat düzeyleri ölçülebilir farklılıkları olan Değiştir gözlemlemek.

3. fotometrik analizi

  1. Standartlar ve 630 nm29için ayarla dalga boyu ile spektrofotometrik plaka okuyucu kullanarak örnekleri içeren 96-şey plaka analiz.
  2. Üretilen Absorbans eğrisi çizmek (örnekleri okumak 630 nm) ve PO42,400 pmol konsantrasyonu kadar doğrusal kaldığına dikkat edin.

Representative Results

Protein işlevi ve aktivite sonrası translasyonel modifikasyonlar, fosforilasyon gibi tarafından değiştirilebilir. Çoğu protein kinaz tarafından fosforile veya bir fosfataz tarafından dephosphorylated. Protein fosfataz 2A durumunda (PP2A), bu multisubunit fosfataz phosphoproteins geniş bir dizi serin ve treonin kalıntılarının dephosphorylation kolaylaştırır. Anormal PP2A aktivite tau protein hyperphosphorylated nerede olabilir Parkinson Hastaligi aSyn hyperphosphorylated, nerede olabilir de dahil olmak üzere birçok hastalıkları ve Alzheimer hastalığı oluşan protein işlev bozukluk için yol açabilir. Bu hızla PP2Ac etkinliğini değerlendirmek ve anormal PP2Ac etkinliği için hücresel fonksiyon bozukluğu neden olabilir belirlemek için kurum içi bir yordam optimize etmek için gerekçe sağladı.

Boş hücre Renkölçer bu tahlil aktivite ücretsiz PO4 miktarı miktarının tarafından ölçüldü PP2Ac kullanarak pT substrat (şekil 1A) i ciddi ve picomolar miktarda bilinen PO4 standart eğri (şekil 1B göre ). PP2Ac aktivite ile karşılaştırıldığında temel PP2Ac etkinliği (at eden büyük bir ok şekil1a) eklenen synuclein yokluğunda da 0.0, 0.1, 0,5, 1,0 ve 2,0 µM synucleins (şekil 1A), yanıt ölçülmüştür.

Figure 1
Resim 1 : PP2A etkinleştirme rekombinant synucleins tarafından bilinen fosfat standartlar düzeyde göre ölçüleceğini. (A) Aralık 0 - 0 olarak karşılaştırmak için 2 µM protein konsantrasyonları, - aSyn, bSyn ve gSyn değerlendirildi 2400 pmol PO4 standartları. (B) A standart eğri malakit yeşil PP2Ac tahlil için bilinen fosfat karşı deneysel koşullarda elde edilen değerler hesaplanır miktarda sağlamak için oluşturuldu. Her durumda, ne zaman PP2Ac aktiviteyi artırır, pT substrat i ciddi ücretsiz PO4 miktarı artar ve koyu yeşil renk üretir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonuçlar içinde belgili tanımlık ilk kuluçka adım PP2Ac için synucleins ilavesi dolayısıyla artan PP2Ac faaliyet gösteren ölçülen, ücretsiz PO4 miktarını artırmak gösterir. Tüm üç rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) önemli ölçüde PP2Ac aktivite (Şekil 2) artışı birçok tekrarlama gösterdikten sonra istatistiksel analiz. Bu sonuçlar çözünür hücresel synucleins miktarında değişiklikler PP2Ac aktivite değiştirebilirsiniz öneririz; ve böylece hücresel homeostazı etkileyebilir. Tüm üç synucleins PP2Ac vivo, harekete geçirmek katkıda eğer, ancak, bilinmemektedir rağmen o aSyn olası katkıda PP2Ac aktivite içinde vivoiçin şekil 3 ' deki verilerinizi öneririz.

Figure 2
Resim 2 : PP2Ac etkinliği tüm üç synucleins tarafından uyarılmış. PP2Ac aktivasyonu yanıt olarak değişen konsantrasyonları rekombinant aSyn, bSyn veya gSyn grafik gösterimini gösterilmiştir. Tüm üç rekombinant synucleins PP2Ac etkinliği teşvik. aSyn çoğu deneylerde istatistiksel yazılım kullanılarak gerçekleştirilen ANOVAs genel olarak oldukça benzer olsa biraz daha güçlü olduğu ortaya çıktı. Verileri 4-9 bağımsız deneyler ortalama ± SEM temsil eder. ns, önemli değil; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hangi synuclein(s) beyinde PP2Ac ile etkileşim kurabilir değerlendirmek için co-immunoprecipitation (Co-IP) deneyleri vahşi türü fare beyin ve PP2Ac-özel-antikor, 1 d 6 kullanılarak yapıldı. Proteinler sonra SDS-PAGE tarafından ayrı kaldık ve lekeleri PP2Ac, aSyn, bSyn ve gSyn kurulan yöntemleri19kullanarak probed. Rekombinant synuclein denetimler, aSyn, bSyn ve gSyn antikor özgüllük (şekil 3A) gösterir. Co-IP veriler PP2Ac beyin ile ilgili büyük synuclein gibi daha az co-IP (3B rakam) bSyn indi ve Co-IP (veri gösterilmez) hiçbir gSyn indi aSyn, olduğunu ortaya koymaktadır. Bu tür beyin PP2Ac ile endojen aSyn için ayırt edici bir rol göstermektedir. Ayrıca bSyn nonamyloidogenic olarak bilinen PP2Ac modülasyon bSyn dayalı tedaviler ile PP2A bu synucleinopathy ile faaliyete geri yüklemek için potansiyel olabilir olasılığını yükseltir gösterildiği gibi henüz burada PP2Ac30, teşvik edebilirsiniz 31.

Figure 3
Şekil 3: PP2Ac etkileşim ile fare beynindeki endojen synucleins. (A)rekombinant aSyn, bSyn ve gSyn probed synuclein özel antikorlar ile aşağıda açıklandığı gibi. (B) kullanma örnekleri immunoblots üzerinde analiz edildi sonra beyin homogenate Co-IP 1 d 6, antikor ile gerçekleştirilen fare. PP2Ac, aSyn ve bSyn, ama değil değil Co-IP PP2Ac ile yaptığı gSyn için veri gösterilir. Başlangıç örnek gösterir PP2Ac göreli düzeyleri (lane 1), aSyn (lane 4) ve bSyn (lane 7) ilk homogenates. Son örnek gösterir PP2Ac kalan düzeyleri (lane 2), aSyn (lane 5) ve bSyn (lane 8) 1 d 6 sonra homogenates içinde PP2Ac Co-IP. PP2Ac önemli düzeyde olduğunu 1 d 6'yı kullanan immunoprecipitated antikor (lane 3), Ayrıca çok az bSyn (güçlü zayıf bSyn sinyal, oku göstermek için pozlanmış lane 9,) ama aSyn (lane 6, ok adlı) bol miktarda aşağı getirdi. * Yıldız ve mark belirsiz sinyaller lekesi üzerinde anten. Ayrıntılı bilgi için Tablo malzemeler kullanılan antikor görmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu malakit yeşil tahlil pT ile 32P etiketli yüzeylerde kullanan klasik yöntem gerçekleştirmek daha kolay olduğu için PP2Ac etkinliği ölçmek için kullanıldı. Başka bir avantaj radyoaktif deneyleri Bu testin olduğunu radioisotopes biraz riskli ve pahalı olabilir, özellikle 32P etiketli molekülleri bu kısa yarı-hayat, var hangi reaktifler süresi sona ermeden önce bir gerçekleştirebilirsiniz deneyleri sayısını sınırlar. Radyoaktivite da 32tanesi imha etme gereksinimini ortadan kaldırır malakit yeşil yerine P atık. Malakit yeşil deneyleri de olabildiğince seçici sigara olan substrat p-nitrophenylphosphate (pNPP), kullanan başka bir Renkölçer tahlil karşılaştırıldığında serin/treonin fosfatazlar etkinliğini ölçerken oldukça duyarlıdır enzimler32geniş bir dizi tarafından dephosphorylated.

PP2A etkinliği ölçmek için ticari malakit yeşil kitleri bir süre için mevcut olmuştur ve daha önce laboratuvar olarak kullanılmıştır. Ancak, birçok malakit yeşil deneyleri yaparken böyle kitleri çok pahalı oldu. Buna ek olarak, PP2A faaliyet için ticari kitleri reaktifler elde edilebilir içinde sahip toz formu sadece bir yıl için kararlı iken ve uygun depolama ile uzun bir süre için yapısal istikrarlı hazır tahlil bileşenleri sağlar.

BSyn ve gSyn test etmeden önce aSyn olumlu bir denetim olarak PP2Ac etkinliği teşvik etmek ve deneyleri için gerekli PP2Ac miktarını belirlemek için ve de sonuçta elde edilen veriler standart eğri (150-2400 pmol PO4 ile ölçekte kalır onaylamak için kullanılmıştır ). Bu aSyn PP2Ac uyarır çok güçlü tepki genellikle doğrusal olmasına rağmen veri ölçeği geçer yoksa ve kimyasallar MGT çözüm çökelti, doğru miktarda yayımlanan Ücretsiz PO4 bir plaka ile ölçmek imkansız hale olduğunu dikkat çekicidir okuyucu.

Verilen bu aSyn katkıda PP2Ac aktivite içinde vivo ve in vitro12,19,21,23,25ve bu önemli homoloji tüm synucleins var, o olmuştu Tüm synuclein aile üyeleri PP2Ac hücre ücretsiz deneyleri uyarmak mümkün olabileceğini onaylanmadığına karar. Burada açıklanan Renkölçer tahlil kullanarak, gerçekten de, tüm üç rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac etkinlik, tüm üç synucleins sinir sisteminde benzer işlevleri gerçekleştirebilir olasılığını yükseltmek teşvik bulundu. Ancak, Parkinson beyin veya demans Lewy durumlarda son derece içeren dokulara daha az PP2Ac etkinliğine sahip beden ile toplanan aSyn23. Fare dokulara vücut benzeri patoloji Ayrıca sergi Lewy yataklık PP2Ac etkinlik25azalttı. Bu, ve şekil 3 ' deki yeni verilerinizi yanı sıra önceki veri aSyn nakavt fareler12, şiddetle tavsiye ederim ne bSyn ne de gSyn genellikle çözünür aSyn kaybı telafi edebilirsiniz beyin veya bu alternatif olarak bu synuclein homologs olmayabilir PP2Ac ile aSyn olarak gösterilmiştir (şekil 3) olarak güçlü ilişkilendirin. Allen beyin Atlas tüm üç synuclein mRNA'ların colocalization birçok beyin alanda gösterir ve yine de üçlü synuclein nakavt fareler oluşturulan9,33, etkinlik bu modelde değerlendirildi değil PP2Ac olmuştur. İlginçtir, üzerinde Ser129 Polo gibi kinaz 2, fosforile aSyn PP2Ac12etkinleştirmek daha az yetenekli, ama burada bSyn için gösterilen kanıt önermek gibi ile çok az bSyn indi bSyn fosforilasyon PP2Ac etkinlik, etkisi pek mümkün değildir PP2Ac fare beyin (şekil 3). Birlikte ele alındığında, veri aSyn, büyük olasılıkla gibi endojen PP2Ac aktivite modülatörler sağlık ve hastalık katkıda öneririz.

Burada özetlenen Protokolü phosphopeptide substrat yanıt çeşitli tedaviler olarak dephosphorylate için PP2Ac kapasitesini belirlemek için basit ama güçlü bir tekniktir. Örneğin, bu aynı metodoloji Seramidler yanı sıra potansiyel roman therapeutics34, gibi diğer PP2Ac harekete geçirmek test etmek veya PP2Ac inhibitörleri vitroetkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Benzer deneyleri 1 d 6 tarafından izole PP2Ac etkinliğini ölçebilirsiniz işaret etmek önemlidir hücre özleri veya vücut dokuları, daha önce açıklanan yazarlar12,19tarafından, immunoprecipitation 25. gelecekteki uygulamalar malakit yeşil tahlil için mevcut PP2Ac etkinlik, ölçüm ötesinde gibi ATP etkinliği bir tahlil kullanarak da belirlenebilir.

Unutmayın, her zaman her bağımsız PP2Ac tahlil için standart bir eğri oluşturulmalıdır. Tüm reaktifler kullanılan fosfat ücretsiz, ücretsiz fosfatlar yapay olarak arka plan sinyal artırmak ve hatalı sonuçlar gibi olduğundan emin olmak için zorunludur. Tahlil günün denenecektir tüm örnekleri için yeterli taze MGT çözüm hazırlamak için esastır. Ayrıca, MGT sadece yapılmış ve birkaç saat sonra çökelti eğilimi gün iyidir. Bir satıcıdan satın PP2Ac aliquotted olmalı ve depolanan yakında onun etkinliğini azaltmak donma çözülme döngüsü önlemek için aldıktan sonra donmuş. Diğer fosfatazlar pT substrat (örneğin PP1 ve PP535), dephosphorylate gibi hangi PP2Ac değil izole immunoprecipitation tarafından hücre veya doku özleri analiz ederken örnekleri ücretsiz fosfatlar kaldırmak için sütunları geçirilmesi gereken ve fosfatazlar belirli inhibitörleri fosfataz özgüllük, yukarıda açıklanan18olarak onaylamak için kullanılması gerekir.

Disclosures

Dr Perez 1999-2011 yılında Nöroloji tıp Pittsburgh Üniversitesi okulda öğretim üyesiydi.

Acknowledgments

Yazarlar tarafından önceden laboratuvar üyeleri Kendra Mackett, Sandra Slusher ve yöntemi en iyi duruma getirmek için çalışan Jie Chen çaba için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Ulusal Sağlık enstitüleri, Michael J. Fox Vakfı, Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi El Paso bilimsel etkinlik araştırma projesi (SARP), Lizanell ve Colbert Coldwell Vakfı, birden çok sistem Atrofi koalisyon teşekkür ederiz, Hoy aile araştırma ve Anna Mae Doyle hediye fonları finansal destek bu araştırma için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

Neuroscience sayı: 126 Renkölçer tahlil dephosphorylation malakit fosfat fosfataz aktivitesi PP2A katalitik alt birimi rekombinant proteinler synucleins treonin phosphopeptide

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Rekombinant α-β ve γ Synucleins Protein fosfataz 2A katalitik alt birim faaliyet hücre ücretsiz deneyleri teşvik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter