Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

רקומביננטי α-β - ו γ-Synucleins להמריץ את פעילות החלבון פוספטאז 2A קטליטי יחידת משנה של מבחני חינם תא

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

פרסום זה מציג פרוטוקול מציג כיצד למדוד את פעילותו של חלבון רקומביננטי פוספטאז 2A קטליטי יחידה משנית (PP2Ac) בתגובה רקומביננטי α-synuclein, β-synuclein או שימוש assay ערכי צבע מוחלטים פשוטה של חלבונים וγ-synuclein. אנו מראים הממצאים לגבי ירידה לפרטים α-synuclein לכיוון PP2Ac במוח העכבר.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) וγ-Synuclein (gSyn) הם בני משפחה ההכפלה של חלבונים דמויי המלווה באים לידי ביטוי במיוחד ברקמות עצביים חוליות. של synucleins שלוש, רק aSyn היה חזק מעורב הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון, דמנציה עם גופיפי, ניוון המערכת מרובים. בלימוד פונקציה aSyn נורמלי, הנתונים מצביעים על ש-asyn הזאת מעוררת את הפעילות של יחידת משנה קטליטי של אנזים dephosphorylating ביטוי בשפע, PP2Ac חוץ גופית בתוך ויוו. נתונים קודמים מראים כי צבירת aSyn במוח האנושי מפחית PP2Ac פעילות באזורים עם פתולוגיה הגוף לוי, איפה aSyn מסיסים הפך לא מסיסים. עם זאת, כי כל synucleins שלוש יש הומולוגיה ניכר רצפי חומצות אמינו, ניסויים תוכננו כדי לבדוק אם כל יכול לווסת את פעילות PP2Ac. באמצעות recombinant synucleins ו- PP2Ac חלבון רקומביננטי, פעילות הוערכה על ידי assay ערכי צבע מוחלטים מלכיט ירוק. הנתונים חשף כי כל שלוש synucleins רקומביננטי גירוי הפעילות PP2Ac מבחני ללא תאים, מעלים את האפשרות כי הומולוגיה שנשמרת בין synucleins שיעניק כל homologs שלושה עם היכולת לאגד ולהפעיל את PP2Ac. נתונים Co-immunoprecipitation, עם זאת, מציעים כי סביר PP2Ac אפנון מתרחשת דרך אנדוגני אינטראקציות בין aSyn לבין PP2Ac ויוו.

Introduction

מחקרים הגדרת חלוקת synucleins המוח ואת חוט השדרה הצג את כל synucleins שלושה מועשרים ברקמות עצביות, למרות דפוסים שונים של לוקליזציה היה דיווח1. למשל, aSyn הוא הנפוץ ביותר באתרי presynaptic2,של קליפת המוח, גרעיני הבסיס-3, bSyn יש התפלגות אחידה יותר4,של המוח ואת חוט השדרה-5ו gSyn הוא יותר בשפע חוט השדרה הגרעינים היקפיים6. למרות כמה הביטוי עובריים של כל synucleins עלולה להתרחש, homologs שלוש הופכים בשפע רב יותר במהלך תקופת neonatal4,5,6,7,8. למרבה הפלא, נתונים synuclein עכברים knockout טריפל, מציינים כי אובדן של כל synucleins שלושה גורמת גיל תחילת בתפקוד עצביים9, תומך synuclein חשוב פונקציות של מערכת העצבים המרכזית (CNS)10, 11. זה עדיין לא ידוע אם עכברים knockout טריפל synuclein להציג שינויים PP2Ac הפצה או פעילות. נתונים עכברים knockout synuclein יחיד חושפים כי אובדן aSyn לבד הוא מסוגל להפחית באופן משמעותי את פעילות המוח12PP2Ac. בנוסף מערכת העצבים, synucleins כל להתאים לרקמות אחרות ברחבי הגוף13,14,15.

בגלל שלה ומבוססת גנטי קישורים הקשורים ניוון מוחיים16,17, aSyn הוא בין הטובים ביותר למד של synucleins 3. המעבדה פרז עבד זמן רב כדי להגדיר לפעילות רגילה פונקציונלי של aSyn, במיוחד ב- CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 , לאחרונה, רקמות היקפיים24,25. בין אלה, היה הגילוי הזה aSyn ממלא תפקיד הרגולציה מרכזי פעילות מגרה PP2Ac19. PP2A פעילות נרחב תורמת תפקודי מוח נורמלי, לרבות הסדרת של ייצור דופמין26. Holoenzyme PP2A מורכב שלוש subunits עצמאית, יחידת משנה קטליטי את C, PP2Ac, יחידת משנה של פיגומים א, ואחד של מספר שונה רגולטורי/מיקוד B subunits לעזור בתרגום PP2A כדי microdomains subcellular מסוים, ובכך לספק PP2A פונקציונלי27. מעידים כי aSyn אינטראקציות עם PP2Ac לתרום באופן משמעותי שלה פוספטאז הפעילות במבחנה , ויוו12,19,21,23, 25. כאשר aSyn שמצטבר אגרגטים חלבון, כפי שקורה כאשר לוי גופות טופס בתוך הנוירונים של מחלת פרקינסון, דמנציה עם גופיפי (DLB), רקמות עם aSyn צבור יש פחת PP2Ac פעילות23,25, מתי רמות של aSyn מסיסים תפחת. נתון כי כל synucleins שלוש יש הומולוגיה משמעותי28 (aSyn חולק 66% זהות עם bSyn ו- 56% עם gSyn), aSyn הזה תורם ההפעלה של PP2Ac, זה היה שיערו כי כל בני משפחת חלבונים synuclein ייתכן שניתן יהיה להגביר את פעילות PP2Ac, לפחות במבחנה. כדי להעריך את זה, PP2Ac פעילות נמדדה בתגובה aSyn רקומביננטי, bSyn ו- gSyn שימוש assay ערכי צבע מוחלטים פשוטה, על פי השיטה של פתחי. et al. 29. בשיטה זו, וכן ממצאי הרומן מפורטים במסמך זה.

Protocol

1. הכנת Buffers וראגנטים

  1. הכנת מאגר פוספט (pNPP) p-nitrophenyl
    1. להכין 50 מ של מאגר pNPP כדלקמן.
    2. שוקל את בסיס טריס 0.30285 g (ראה טבלה של חומרים) להמיס ב 25 מיליליטר מים יונים הנדסה גנטית.
      1. הוסף µL 41.6 CaCl 120 מ מ2. להתאים את ה-pH 7.0 עם 1 M HCl ולהביא את עוצמת הקול של הפתרון הסופי 50 מ ל מים יונים הנדסה גנטית.
      2. ודא כי הריכוז הסופי 50 מ"מ טריס-HCl, 100 מ מ CaCl2, pH 7.0.
      3. לאחסן מאגר pNPP בבית 4 oC.
  2. פתרונות מלכיט ירוק, להכין את הפעולות הבאות.
    1. להכין פתרון A על ידי הוספת 32.8 מ של HCl מרוכזת 67.2 מ ל מים יונים הנדסה גנטית כדי ליצור פתרון HCl 4 M.
      הערה: המלאכית פתרון מוכן בשכונה fume באמצעות כפפות חד פעמיות, מסיכת פנים בטיחות משקפי מגן.
    2. להכין פתרון B על ידי שוקל 4.2 גר' molybdate אמוניום והוספתה 95.8 מ של פתרון א
    3. להכין פתרון C על-ידי שוקל 0.045 גרם מלכיט ירוק אוקסלט מלח והוספת מים יונים הנדסה גנטית כדי להביא את הנפח הכולל הסופי 100 מ.
    4. להכין פתרון D על ידי ערבוב פתרונות B ו- C ביחס 1:3 (v/v), מערבבים לשעה בטמפרטורת החדר.
    5. לסנן D פתרון באמצעות מיקרומטר 0.22 נקבובית גודל ניטרוצלולוזה ממברנה מסנן יחידה באמצעות מזרק 50 מ.
    6. חנות פתרון מוכן מלכיט 4 oC מוגן מפני אור.
  3. הכנה של מפעיל
    1. להכין את ה 1% פתרון tween 20, פיפטה 10 µL של יצירת רצף 20 לתוך 990 µL של הנדסה גנטית יונים מים (v/v) ואז מערבולת עד יצירת רצף 20 מתמוסס לחלוטין.
  4. הכנת הפתרון עובד מלכיט ירוק Tween 20 (ההנהלה).
    1. מערבבים activator (שלב 1.3) עם הפתרון מלכיט ירוק (פתרון D, שלב 1.2.5) על יחס של בטחונות (למשל 1 µL activator לפתרון מלכיט ירוק µL 99).
  5. הכנת תראונין phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) המצע.
    1. כדי להכין מקום מניות, 2 מ מ בקבוקון phosphopeptide 1 מ ג על קרח, מוסיפים µL 550 מים יונים הנדסה גנטית, ואת מערבולת בעדינות כדי להמיס.
      1. להפוך aliquots ~ 10 ולאחסן נק' ב-20oC.
  6. הכנה Synuclein
    1. להכין synucleins בשכונה fume באמצעות כפפות חד פעמיות, מסיכת פנים בטיחות משקפי מגן.
    2. Resuspend 1 מ ג של synuclein רקומביננטי 1 מ"ל מים יונים הנדסה גנטית על ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
    3. מערבולת בעדינות כדי להמיס ומניחים על קרח.
    4. להכין 50 µL aliquots ולאחסן ב-80 oC.
  7. הכנת תקנים פוספט
    1. להכין את הפתרון מניות של פוספט 0.1 מ מ כדלקמן.
      1. שוקל ג' 0.1361 ח'2PO4 ומניחים בתוך עם 80 מ של מים יונים הנדסה גנטית. להוסיף בר stir, מיקס להתמוסס. העברת כל של הפתרון משורה ולהביא את הנפח הכולל הסופי 100 מ ל מים יונים הנדסה גנטית.
      2. לסנן את פתרון שלם באמצעות מיקרומטר 0.22 נקבובית גודל ניטרוצלולוזה ממברנה מסנן יחידה באמצעות מזרק 50 מ; הריכוז הסופי הוא 10 מ מ.
      3. לדלל את בטחונות פתרון (10 מ מ); הריכוז הסופי יהיה 0.1 מ מ פוספט (PO4) שישמש עבור תקנים וזמינותו.
      4. לאחסן הפתרון מניות פוספט בבית 4 oC.
    2. ראה טבלה 1 עבור הגבלת דילולים נהגה להכין פו סטנדרטים4 עם הנפח הכולל הסופי של 1250 µL. להוסיף את הכמות המתאימה של פוספט ומים יונים הנדסה גנטית 1.5 mL צינורות לפי טבלה 1.
      1. חנות מוכנה פו סטנדרטים4 ב-20 oC.
סטנדרטים פוספט
0.1 מ מ פו4 פתרון (mL) 0 75 150 300 600 1,200
מים יונים הנדסה גנטית (mL) 1,250 1,175 1,100 950 650 50
הריכוז הסופי של פו4 [pmol] 0 150 300 600 1,200 2,400

טבלה 1: סטנדרטים פוספט.

2. PP2A Assay בתגובה Synucleins רקומביננטי

הערה: הנפח הסופי הכולל עבור כל תגובה תהיה 60 µL, אז הנסיין עליך לכוונן את עוצמת pNPP מאגר ראשוני כראוי כדי להתאים את עוצמת הקול של synucleins המשמש עבור כל דגימה. ברוב המקרים, עוצמת הקול של pNPP מאגר יהיה בין 40 ו 44 µL.

  1. להכין את כל התגובה PP2Ac כדלקמן.
    1. צינור 1.5 mL, הוסף 39 µL pNPP מאגר ומקום על קרח.
    2. להוסיף 1 µL (105 ng/µL או U 0.0007/µL) של האדם PP2Ac רקומביננטי (rPP2Ac).
    3. להוסיף 4 µL של 0, 1.5, 7.5, 15 או 30 מיקרומטר synucleins כדי rPP2Ac במאגר pNPP הסופי ריכוזי 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 מיקרומטר, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על יחידת מסתובבת; עוצמת הקול הסופי יהיה 60 µL.
    4. לאחר 30 דקות, להעביר דגימות קרח ולהוסיף µL 16 של מצע pT 2 מ מ.
    5. דגירה כל תערובת assay PP2A 10 דקות ב 30 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים ברעידות לסירוגין.
    6. כדי צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח, להוסיף 25 µL של כל פו4 רגיל (0 150, 300, 600, 1200, 2,400 pmol) בבארות כפולים מנמוך לגבוה.
    7. לאחר מכן להוסיף 25 µL של כל מדגם ניסיוני (PP2A assay ± synuclein), שהוכנו בשלבים 2.1.1 כדי 2.1.6, לשכפל בארות באותה צלחת 96-ובכן.
    8. בשלב הבא, להוסיף µL 75 של הפתרון עובד ההנהלה לכל טוב המכיל סטנדרטים ודוגמאות.
    9. להשאיר צלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    10. להתבונן צבע לשנות בדגימות שיש הבדלים מדיד רמות פוספט.

3. ניתוח בהשוואת

  1. לנתח את הצלחת 96-ובכן המכיל סטנדרטים ודוגמאות שימוש בקורא spectrophotometric צלחת עם הגל מוגדר כ- 630 ננומטר29.
  2. התווה את עקומת ספיגת המיוצר (דוגמאות בסדום 630 ננומטר) ורשום שהוא נשאר ליניארית עד 2,400 pmol ריכוז של פו4.

Representative Results

פונקציה של חלבונים ופעילות יכול להשתנות על-ידי שינויים פוסט translational, כגון זירחון. חלבונים רבים שניתן phosphorylated על ידי קינאז או dephosphorylated על ידי פוספטאז. במקרה של 2A חלבון פוספטאז (PP2A), זה multisubunit פוספטאז מקלה את dephosphorylation של שאריות סרין, תראונין במספר רחב של phosphoproteins. פעילות PP2A לא תקין יכול להוביל dysregulation של פונקציה של חלבונים אשר מתרחשת בבמחלות רבות, ביניהן מחלת פרקינסון איפה aSyn יכול להיות hyperphosphorylated, וב -מחלת אלצהיימר איפה חלבון טאו יכולים להפוך hyperphosphorylated. זה סיפק הצדקה אופטימיזציה של הליך ללא צורך במיקור חוץ במהירות להעריך את פעילות PP2Ac ולקבוע אם פעילות PP2Ac לא תקין עלול להוביל בתפקוד הסלולר.

שימוש assay נטול תאים ערכי צבע מוחלטים הזה, PP2Ac פעילות נמדדה על ידי לכימות כמות פו חינם4 ביקע מן המצע pT (איור 1 א'), לעומת כמויות picomolar הידוע של פו4 בעקומת סטנדרטי (איור 1B ). פעילות PP2Ac נמדדה גם בתגובה 0.0 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 synucleins מיקרומטר (איור 1 א'), לעומת פעילות PP2Ac בסיסית, בהעדר synuclein נוסף (ליד החץ גדולה באיור 1A).

Figure 1
איור 1 : PP2A להפעלה באמצעות recombinant synucleins, נמדד ביחס רמות הידוע של פוספט בתקנים. (א) aSyn, bSyn ו- gSyn הוערכו בטווח של 0 - 2 מיקרומטר חלבון ריכוזים, כדי להשוות ל- 0 - 2400 pmol פו4 תקנים. עקומת סטנדרטי (B) A עבור וזמינותו PP2Ac מלכיט ירוק נוצר כדי לספק כמויות ידוע של פוספט שמולו ניתן לחשב ערכים שהושגו בתנאים ניסיוני. בכל המקרים, כאשר פעילות PP2Ac עולה, כמות חינם פו4 ביקע מן המצע pT מגביר ומייצרת צבע ירוק כהה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

התוצאות מראים כי תוספת של synucleins אל PP2Ac בשלב הדגירה הראשוני יכול להגביר את כמות חינם פו4 למדוד, ובכך להפגין פעילות מוגברת של PP2Ac. ניתוח סטטיסטי לאחר חזרות רבות מראים כי כל synucleins רקומביננטי שלוש (aSyn, bSyn, gSyn) להגביר באופן משמעותי פעילות PP2Ac (איור 2). תוצאות אלו מראים כי שינויים בסכום של synucleins הסלולר מסיסים יכולים לשנות פעילות PP2Ac; ובכך עשוי להשפיע הומאוסטזיס הסלולר. לא ידוע, עם זאת, אם כל synucleins שלושה לתרום ההפעלה של PP2Ac ויוו, למרות נתונים באיור 3 מציע את aSyn סביר תורמת PP2Ac פעילות ויוו.

Figure 2
איור 2 : PP2Ac פעילות הוא מגורה על ידי כל שלוש synucleins. ייצוג גרפי של הפעלת PP2Ac בתגובה ריכוזים שונים של recombinant aSyn, bSyn או gSyn מוצג. כל שלושת synucleins רקומביננטי מגורה PP2Ac פעילות. aSyn בניסויים רוב נראה קצת יותר חזק, למרות ANOVAs שבוצעה באמצעות תוכנה סטטיסטית היו דומים באופן כללי. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM של ניסויים עצמאית 4-9. ns, לא משמעותי; p < 0.05; p < 0.01; p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי להעריך אילו synuclein(s) יכול לקיים אינטראקציה עם PP2Ac במוח, בוצעו מבחני co-immunoprecipitation (Co-IP) באמצעות מוח העכבר פראי סוג PP2Ac-הספציפי-הנוגדן, 1D 6. חלבונים ואז היו מופרדים על ידי עמודים מרחביות ובחן שהכלים היו PP2Ac, aSyn, bSyn של gSyn באמצעות שיטות הוקמה19. Synuclein רקומביננטי פקדים מדגימים aSyn, bSyn, gSyn נוגדנים ירידה לפרטים (איור 3 א). Co-IP הנתונים חושפים כי synuclein העיקריים הקשורים PP2Ac במוח היה aSyn, כמו הרבה פחות bSyn ירד ב- co-IP (איור 3B), gSyn לא ירד ב- Co-IP (נתונים לא מוצג). הדבר מצביע על תפקיד ייחודי עבור aSyn אנדוגני בוויסות PP2Ac במוח. זה גם מעלה את האפשרות כי אפנון PP2Ac עם bSyn-מבוסס-טיפולים יכול יש פוטנציאל לשחזור PP2A פעילות אלה עם synucleinopathy, כידוע bSyn להיות nonamyloidogenic עדיין כמוצג כאן יכול לעורר PP2Ac30, 31.

Figure 3
איור 3: האינטראקציה של PP2Ac עם synucleins אנדוגני במוח העכבר. ASyn רקומביננטי (A), bSyn, gSyn היו שנבדק עם נוגדנים ספציפיים synuclein כפי שמתואר להלן. (B) באמצעות העכבר מוח homogenate Co-IP בוצעה עם נוגדן 1D 6, ואז דגימות נותחו על immunoblots. הנתונים מוצגים PP2Ac, aSyn, bSyn, אבל לא gSyn אשר עשה לא Co-IP עם PP2Ac. התחל דוגמאות להראות רמות היחסי של PP2Ac (ליין 1), aSyn (ליין 4), ו- bSyn (ליין 7) ב- homogenates הראשוני. סוף דוגמאות להראות את רמות הנותרים של PP2Ac (ליין 2), aSyn (ליין 5), ו- bSyn (ליין 8) ב- homogenates לאחר 1D 6 PP2Ac Co-IP. רמות משמעותיות של PP2Ac היו immunoprecipitated באמצעות 1D 6 נוגדנים (ליין 3), אשר גם הוריד כמויות רבות של aSyn (ליין 6, ב חץ) אבל מעט מאוד bSyn (ליין 9, חשיפת בחוזקה כדי להראות אות חלש bSyn, חץ). * כוכביות, סוגריים מרובעים מארק שאינם ספציפיים אותות על שהכלים. לראות את הטבלה של חומרים לפרטים על נוגדנים בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

זה וזמינותו מלכיט ירוק עם pT שימש למדידת פעילות PP2Ac כי זה קל יותר לביצוע מאשר השיטה הקלאסית המשתמשת 32מתויג P סובסטרטים. יתרון נוסף של assay הזה על מבחני רדיואקטיבי היא רדיואיזוטופים להוות סיכון מסוים, עשויה להיות יקרה, במיוחד 32מולקולות מתויג P זה יש חצי חייהם קצר, אשר מגביל את מספר מבחני אחד יכול לבצע לפני ריאגנטים לפוג. באמצעות מלכיט ירוק יותר מאשר רדיואקטיביות גם מבטל את הצורך להיפטר 32P פסולת. מבחני מלכיט ירוק הם גם מאוד רגיש כאשר מודדים את הפעילות של phosphatases סרין/תראונין בהשוואה assay ערכי צבע מוחלטים אחרת העושה את המצע p-nitrophenylphosphate (pNPP), וזו לא בררניים כפי שהוא יכול להיות dephosphorylated על ידי מספר רחב של אנזימים32.

קיטים מסחריים מלכיט ירוק כדי למדוד פעילות PP2A היו זמינים כבר כמה זמן, שימשו בעבר במעבדה. עם זאת, כאשר עושים מבחני מלכיט ירוק רבים, ערכות כאלה הפך יקר מדי. בנוסף, קיטים מסחריים לפעילות PP2A יציבים רק לשנה אחת, בעוד שיש ריאגנטים זמין בצורת אבקה, עם אחסון נאות, מספקים רכיבים זמינים assay יציבים מבחינה מבנית במשך פרקי זמן ארוכים.

לפני בדיקת bSyn ו- gSyn, aSyn שימש כפקד חיובי כדי לעורר פעילות PP2Ac, כדי לקבוע את כמות PP2Ac הדרושים עבור מבחני, גם כדי לוודא כי הנתונים המתקבלים יישארו על הסולם עם עקומת סטנדרטי (150-2400 pmol של פו4 ). ראוי לציין שאם aSyn מעוררת PP2Ac הנשים האלה, למרות התגובה היא בדרך כלל ליניארי, נתונים יכבה סולם, כימיקלים בפתרון ההנהלה לזרז, ואי אפשר למדוד כמויות מדויקות של חינם-פו שפורסמו4 עם צלחת הקורא.

בהתחשב בכך aSyn תורם PP2Ac פעילות בתוך vivo ו- in vitro לקשרי12,19,21,23,25, וכי כל synucleins יש הומולוגיה ניכרת, זה היה שיערו כי כל בני המשפחה synuclein עשוי להיות מסוגל לעורר PP2Ac בתוך התא מבחני חינם. באמצעות ערכי צבע מוחלטים וזמינותו המתוארת כאן, התברר כי אכן, כל synucleins רקומביננטי שלוש (aSyn, bSyn, gSyn) המרצת פעילות PP2Ac, מעלים את האפשרות כי כל synucleins שלוש עשויה לבצע פונקציות דומות במערכת העצבים. עם זאת, המוח של פרקינסון או דמנציה עם הגוף לוי מקרים יש פחות פעילות PP2Ac ברקמות המכילות מאוד המצטברים aSyn23. העכבר רקמות מחסה לוי פתולוגיה הגוף כמו גם ייתקלו צמצום פעילות PP2Ac25. ואת הנתונים החדשים באיור 3, כמו גם נתונים קודמים עכברים knockout aSyn12, ממליץ כי לא bSyn ולא gSyn יכול בדרך כלל לפצות על האובדן של aSyn מסיסים במוח, או לחלופין זה homologs synuclein האלה אולי לא לשייך PP2Ac כמו aSyn כמו שמוצג (איור 3). הרי האטלס המוח אלן מראה colocalization של mRNAs synuclein שלוש כל בתחומים רבים של המוח, למרות synuclein טריפל נוקאאוט עכברים היה שנוצר9,33, PP2Ac פעילות לא העריך במודל הזה. מעניין, aSyn זה הוא phosphorylated על Ser129 על ידי פולו דמוי קינאז 2, הוא פחות מסוגל להפעיל PP2Ac12, אבל הראיות המוצגות כאן עבור bSyn להציע את זרחון bSyn סביר לפגיעה פעילות PP2Ac, כפי bSyn מעט מאוד ירד עם PP2Ac במוח העכבר (איור 3). יחדיו, הנתונים מראים כי אנדוגני מאפננים פעילות PP2Ac, כמו aSyn, עשויה לתרום בריאות ומחלות.

פרוטוקול שמפורטות כאן היא טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה כדי לקבוע את הקיבולת של PP2Ac כדי dephosphorylate מצע phosphopeptide בתגובה טיפולים שונים. למשל, ניתן להשתמש באותה מתודולוגיה זו לבחון אחרים מפעילים PP2Ac, כגון סרמידים, כמו גם פוטנציאל הריפוי34, או כדי להעריך את ההשפעה של PP2Ac מעכבי במבחנה. חשוב גם לציין כי מבחני דומה יכול למדוד את הפעילות של PP2Ac זה מבודד 1D 6 immunoprecipitation תמציות תאים או רקמות הגוף, כפי שצוין בעבר שתואר על ידי מחברים12,19, 25. העתיד יישומים עבור וזמינותו מלכיט ירוק קיים מעבר מדידת פעילות PP2Ac, כפי ATP פעילות ניתן גם לקבוע באמצעות כזה וזמינותו של.

שימו לב, עיקול רגיל להפיקם בכל פעם עבור כל assay PP2Ac עצמאית. זה הכרחי כדי להבטיח כי ריאגנטים כל שימוש חינם, פוספט מלחי חינם באופן מלאכותי להגדיל את האות רקע, לתוצאות שגויות ביום של וזמינותו זה חיוני כדי להכין פתרון ההנהלה טריים מספיק עבור כל דוגמאות להיות לבדיקה. גם, ההנהלה הוא רק טוב היום. זה עשוי, נוטה לזרז אחרי כמה שעות. PP2Ac נרכשה מספק חייב להיות aliquotted ומאוחסנים קפוא מיד לאחר קבלתו כדי למנוע מחזורים הפשרת ההקפאה להפחית את פעילותה. כמו אחרים phosphatases ניתן dephosphorylate המצע pT (למשל PP1 ו PP535), כאשר ניתוח תמציות תאים או רקמות שבו PP2Ac לא היה מבודד על ידי immunoprecipitation, דגימות חייבים להיות מועברים על עמודות כדי להסיר פוספטים חינם מעכבים ספציפיים של phosphatases צריך לשמש כדי לאשר ירידה לפרטים פוספטאז, כפי שתואר לעיל18.

Disclosures

. ד ר פרז היה חבר של הפקולטה, המחלקה לנוירולוגיה בבית הספר לרפואה באוניברסיטת פיטסבורג מ 1999-2011.

Acknowledgments

המחברים מעריך את המאמצים על ידי חברי מעבדה מוקדמת Mackett קנדרה, סנדרה סלושר ו חן Jie שעבד לייעל את השיטה. המחברים גם מודה מכוני הבריאות הלאומיים, מייקל ג'יי פוקס קרן, טקסס טק אוניברסיטת בריאות מדעי מרכז El Paso בלווי פעילות מחקר הפרויקט (SARP), Lizanell, קולבר Coldwell קרן, הקואליציה ניוון המערכת מרובות, הוי המשפחה מחקר, אנה מיי דויל מתנה כספים עבור תמיכה כספית של מחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

מדעי המוח גיליון 126 וזמינותו ערכי צבע מוחלטים dephosphorylation מלכיט פוספט פעילות פוספטאז יחידה משנית קטליטי PP2A חומרים synucleins phosphopeptide תראונין

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

רקומביננטי α-β - ו γ-Synucleins להמריץ את פעילות החלבון פוספטאז 2A קטליטי יחידת משנה של מבחני חינם תא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter