Summary
细胞分化是由微环境因素的影响,包括基质组合物和基材的材料性质的宿主调节。我们在这里描述利用细胞微阵列与牵引力显微镜一起同时评估细胞分化和生物力学细胞 - 基底相互作用的微环境上下文的功能的技术。
Abstract
微制造蜂窝微阵列,其上的弹性的水凝胶表面由生物分子的接触印刷的组合,用于测量排列生化信号对细胞分化的影响提供一个紧密控制的,高通量的设计系统。采用细胞芯片最近作出的努力证明他们的组合研究中,许多微环境因素的并行呈现效用。然而,这些努力主要集中在调查生化线索对细胞反应的作用。在这里,我们提出了一个细胞芯片平台具有可调的材料特性为牵引力显微镜评估由免疫和生物力学的细胞 - 基底相互作用的两个细胞的分化。要做到这一点,我们已开发利用不同的杨氏模量在任显微镜载玻片或玻璃底培养皿中制成的聚丙烯酰胺水凝胶两种不同格式。我们提供BESŧ实践和故障排除的微阵列对这些水凝胶基质制造,芯片上的后续细胞培养和采集数据。该平台非常适合用在生物过程的调查对其中两个生化( 例如 ,细胞外基质组合物)和生物物理( 例如 ,基板的刚度)的线索可能发挥显著,相交的作用。
Introduction
细胞和周围微环境因素之间的相互作用介导了大量的各种整个发育,稳态和疾病的发病机制1,2,3,4的生物过程。这些微环境相互作用包括通过配体 - 受体结合递送的可溶性因子的细胞,细胞 - 基质结合,和细胞 - 细胞相互作用。除了上述的生化考虑,生物物理参数,如底物的机械性能( 例如 ,杨氏模量,孔隙率)和电池的形状,和相关的下游机械传导日益得到认可作为细胞分化5,6,7,8的关键介质, 9 10。从这些微环境相互作用产生的信号作为输入,基因网络和信号通路。此外,这些细胞的固有组分也通过分泌的因子和基质降解酶,完成细胞内在遗传计划和细胞外微环境因素5,11,12之间的复合物共同监管环路反馈提供给微环境。
使用用于微环境因素的控制介绍工程系统的范围内不同的上下文13,14,15的已被证明是有用的。特别是微制造的系统已通过小型化13促进蛋白质和细胞以及高度并行分析的精确的空间图案化16,17,18,19,20,21,22。细胞微阵列表示一个这样的微加工系统,其中的生物分子的组合是接触印刷到弹性聚丙烯酰胺水凝胶基底23,24,25。细胞粘接性成分(即基质蛋白)的加入使芯片上的持续细胞粘附和文化,这是经常其次是通过免疫组化和荧光记者下游分析。细胞芯片已经富有成效针对实现肝细胞表型的23,26,神经前体分化27 mammar的改进认识ý祖命运决定28,胚胎干细胞的维持/分化23,29,30,肺癌转移31,以及在黑色素瘤32的治疗反应。我们最近证明了使用细胞微阵列的用于限定在定形内胚层规范33,肝脏祖细胞分化34,35,和肺肿瘤细胞对药物的反应36外基质(ECM)蛋白的组合物的作用。在这些作品中,我们把重点放在扩大阵列平台的组合能力和探索细胞内在信号与细胞外基质成分及生物力学的交叉点。此外,我们在这个阵列平台上实现生物物理读数能力提供定量CHARAC细胞收缩的分化terize作用处理35。要做到这一点,我们综合牵引力显微镜(TFM)与细胞芯片,使细胞产生牵引的高通量评估。 TFM是测量细胞产生的牵引力一种广泛使用的方法,并提供了有关单细胞和组织水平的功能与组合物和局部微环境37,38,39,40的生物力学的协调显著见解。因此,TFM与细胞微阵列结合提供了一个高通量系统,用于测量键,生理学相关的生物物理参数。
这里描述的细胞微阵列平台由四部分组成:聚丙烯酰胺基板,阵列,细胞培养和测定的读出的制造,以及数据分析的制造。看到图1为前三个实验部分的示意性概要;参见图2的最后一节的重点放在免疫荧光分析数据的概要总结。为了适应在细胞微阵列平台来生物力学细胞-基底相互作用的研究中,我们使用可调谐的杨氏模量,但相似的孔隙率的聚丙烯酰胺底物,每Wen 等。 41。以使由它们的底物对细胞施加的力的TFM测量,我们实现除了厚的玻璃显微镜载片经常被其它基团使用的玻璃底培养皿的格式。因此,这种细胞芯片平台能够细胞分化通过对显微镜载玻片和细胞产生的力通过免疫荧光TFM单独的玻璃底菜并行测量。我们也应用了一些改进通常与电池芯片使用的分析方法。 SpecificalLY,代替整体岛强度的参数的Z得分,我们测量的单细胞的强度和以占非正常分布和更准确地描述细胞行为申请位数正常化。我们相信,这些改进提供了走向其生物化学和生物物理线索发挥显著,交叉作用的生物学过程的调查特别有用。此外,我们的分析改进使细胞芯片的一系列对这些单细胞和群体水平的行为发散细胞功能研究中的应用。
Protocol
1.聚丙烯酰胺基板的制造
- 清洁的玻璃基板 - 无论是标准显微镜玻片端点免疫荧光或玻璃 - 底部35 25mm培养皿为TFM - 以确保细胞培养期间最佳聚丙烯酰胺水凝胶的制造和完整性。可替代地,使用的预清洗的玻璃基板。
- 浸入玻璃基板在0.25%体积/体积的Triton X-100在蒸馏水(DH 2 O)。放置衬底上进行30分钟的轨道摇床。
- 除去的Triton X-100溶液和冲洗基板5次浸渍在最终漂洗和地点上30分钟轨道摇床的dh 2 O离开基板。
- 卫生署取下2 O和丙酮沉浸基板。放置衬底上进行30分钟的轨道摇床。
- 除去丙酮,并在甲醇浸泡衬底。放置衬底上进行30分钟的轨道摇床。
- 除去甲醇,与卫生署冲洗基板5次<子> 2的0.05N氢氧化钠O.浸没基材和发生在1小时轨道摇床。
注意:氢氧化钠是高度腐蚀性,可引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。戴防护手套,衣服和保护眼睛。 - 除去NaOH溶液和漂洗基片5次的dh 2 O使用过滤的压缩空气干燥基板和在110℃的热板上烘烤直至干燥(5 - 15分钟)。清洗过的衬底可在室温下无限期储存。
- 为了确保聚丙烯酰胺水凝胶的附着Silanize干净的玻璃基板。
- 浸入在乙醇新鲜制备的2%体积/体积的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(3-TPM)干净的玻璃基板。放置衬底上进行30分钟的轨道摇床。
小心:3- TPM是易燃液体。远离热源,火花,明火和热表面远离,且只能在化学通风柜使用。 - 除去3 TPM解决方案,并浸泡在ETHA基板NOL。放置衬底上5分钟轨道摇床。
- 使用过滤的压缩空气干燥基板和在110℃的热板上烘烤直至干燥(5 - 15分钟)。硅烷化的衬底可以存储在室温下长达1个月。
- 浸入在乙醇新鲜制备的2%体积/体积的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(3-TPM)干净的玻璃基板。放置衬底上进行30分钟的轨道摇床。
- 选项1:硅烷化显微镜玻片为终端制造免疫聚丙烯酰胺水凝胶。
- 制备在蒸馏水中的预聚合物溶液2 O具有期望的丙烯酰胺/双丙烯酰胺百分比(重量/体积)的比例来制造基材具有4千帕(4%丙烯酰胺,0.4%双丙烯酰胺),13千帕(6%丙烯酰胺,0.45的杨氏模量%双丙烯酰胺),或30千帕(8%丙烯酰胺,0.55%双丙烯酰胺)及类似的孔隙率,每Wen 等。 41。涡的解决方案,直到清晰过滤器0.2微米的注射器。预聚物溶液可以储存在4℃下3个月。
注意:暴露于丙烯酰胺或双丙烯酰胺可导致急性毒性,neurotoxicity,和刺激。戴防护手套,衣服和保护眼睛。 - 制备的20%w / v的的Irgacure 2959在甲醇中的光引发剂溶液。这种光引发剂溶液不能储存和新鲜每次必须准备。
- 混合在一个9预聚物和光引发剂溶液:1(预聚物:光引发剂)的比例。任选脱气用真空室为15分钟以除去气泡。
- 放置硅烷化载玻片到玻璃干燥托盘和吸管100微升9:1预聚合物:光引发剂溶液到每个滑动。轻轻盖上22×60毫米盖玻片各滑动,同时避免气泡的产生。需要注意的是盖玻片防止由氧聚合反应的抑制。
- 在UV交联剂地方干燥托盘和暴露滑动到365nm的紫外线,一种10分钟(4瓦/米2)。根据需要优化聚合时间。长时间曝光的风险难以去除盖玻片,由于过聚合。短的曝光时间řISK underpolymerization和低水凝胶稳定性。
- 沉浸在水凝胶卫生署2 O 5分钟。用剃刀取出盖玻片,注意不要损坏聚合水凝胶。
- 在室温下1离开水凝胶在卫生署2 O - 3天,卫生署2 O每天都在变化。脱水,在50℃的热板上的水凝胶至干(15 - 30分钟),并存储在室温下长达3个月。
- 制备在蒸馏水中的预聚合物溶液2 O具有期望的丙烯酰胺/双丙烯酰胺百分比(重量/体积)的比例来制造基材具有4千帕(4%丙烯酰胺,0.4%双丙烯酰胺),13千帕(6%丙烯酰胺,0.45的杨氏模量%双丙烯酰胺),或30千帕(8%丙烯酰胺,0.55%双丙烯酰胺)及类似的孔隙率,每Wen 等。 41。涡的解决方案,直到清晰过滤器0.2微米的注射器。预聚物溶液可以储存在4℃下3个月。
- 选项2:制作上的硅烷化35毫米玻璃底培养皿使用TFM细胞 - 底物相互作用的实时评价含荧光珠的聚丙烯酰胺水凝胶。
- 超声处理1微米荧光珠的储备溶液为15分钟以分散聚集体。
- 制备在蒸馏水中的预聚合物溶液2 O具有期望的丙烯酰胺/双丙烯酰胺百分比(重量/体积)的比例来制造基材具有4千帕(4%丙烯酰胺,0.4%双丙烯酰胺),13千帕(6%丙烯酰胺,0的杨氏模量45%双丙烯酰胺),或30千帕(8%丙烯酰胺,0.55%双丙烯酰胺)及类似的孔隙率,每Wen 等。 41。涡的解决方案,直到清晰过滤器0.2微米的注射器。预聚物溶液可以储存在4℃下3个月。
注意:暴露于丙烯酰胺或双丙烯酰胺可导致急性毒性,神经毒性,和刺激。戴防护手套,衣服和保护眼睛。 - 荧光珠的预聚物溶液在0.2%体积/体积和涡旋以混合的终浓度添加。
- 制备的20%w / v的的Irgacure 2959在甲醇中的光引发剂溶液。这种光引发剂溶液不能储存和新鲜每次必须准备。
- 混合在一个9预聚物/珠和光引发剂溶液:1(预聚物/珠:光引发剂)的比例。任选脱气用真空室为15分钟以除去气泡。
- 将硅烷化35毫米玻璃底培养皿放入玻璃烘盘和pIPET 20微升9:1预聚物/珠:光引发剂溶液到各培养皿的中心。轻轻盖上12mm的圆形盖玻片各滑动,同时避免气泡的产生。需要注意的是盖玻片防止由氧聚合反应的抑制。
- 为了将荧光珠分配到水凝胶的表面上,反转菜并在室温下保留20分钟,每诺尔等。 42。
- 同时仍然反相,暴露菜365nm的紫外线,一种10分钟(4瓦/米2)。根据需要优化聚合时间。长时间曝光的风险难以去除盖玻片,由于过聚合。较短的暴露风险underpolymerization和低水凝胶稳定性。
- 沉浸于0.1M 4-(2-羟乙基)水凝胶-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液,并在黑暗中在室温下过夜离开。用剃刀仔细地取出盖玻片,注意不要损坏聚合物:授权的水凝胶。
- 脱水,在50℃的热板上的水凝胶至干(15 - 30分钟)。水凝胶可以在室温下保存在黑暗中3个月。
2.阵列的制备
- 准备缓冲区打印生物分子。使用适合于所关心的生物分子打印缓冲器。生长因子(GF)的打印缓冲器是广泛适用于其它类分子,如细胞 - 细胞的配体。
- 以制备2×ECM蛋白打印缓冲器中,添加164毫克的乙酸钠和37.2毫克乙二胺四乙酸(EDTA)的6毫升卫生署2 O.涡旋并在37℃下孵育,彻底溶解。溶解后,加入预热的Triton X-100的50微升和4毫升甘油。涡旋并在37℃下孵育再次溶解。添加40 - 冰醋酸80微升,滴定将pH调节至4.8。 2×ECM蛋白打印缓冲器可以存储在4°℃下1个月。
注意:醋酸是易燃和腐蚀性。戴防护手套,衣服和保护眼睛。 - 以制备2×GF打印缓冲器中,添加105.5毫克乙酸钠和37.2毫克EDTA至6毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。涡和孵化,在37°C至彻底溶解。溶解后,加入100毫克3 - 甘油[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基] -1-丙烷(CHAPS)和4毫升。 2×GF蛋白打印缓冲器可以存储在4℃下1个月。
- 以制备2×ECM蛋白打印缓冲器中,添加164毫克的乙酸钠和37.2毫克乙二胺四乙酸(EDTA)的6毫升卫生署2 O.涡旋并在37℃下孵育,彻底溶解。溶解后,加入预热的Triton X-100的50微升和4毫升甘油。涡旋并在37℃下孵育再次溶解。添加40 - 冰醋酸80微升,滴定将pH调节至4.8。 2×ECM蛋白打印缓冲器可以存储在4°℃下1个月。
- 准备源板。
- 在384-孔V形底微量培养板,在双靶浓度结合的2与每个生物分子溶液×打印缓冲器等体积。
注:合适的目标浓度为最常见的ECM蛋白是250微克/毫升,而对其它类型的排列的因素目标浓度取决于在水凝胶和生物功能的保留。在每个孔中的总体积可以是低至5微升和需要不超过15微升。除了感兴趣的生物分子的组合,包括以促进下游的图像分析的阵列荧光标记物。使用罗丹明缀合的葡聚糖(2.5毫克/毫升)。 - 吹打混合每孔彻底,小心不要产生气泡。离心机源微孔板在100×g下1分钟。制造用在同一天制备并贮存在4℃直至芯片制造源板微阵列。
- 在384-孔V形底微量培养板,在双靶浓度结合的2与每个生物分子溶液×打印缓冲器等体积。
- 根据制造商的每一个芯片制造运行前的说明清洁针。加载清洁销直接进入微阵列的打印头。
- 使用制造商的软件,微阵列准备和计划。虽然下面的步骤是部分地专用于这里所用的特定微阵列,最microarrayers的操作是类似的。
- 打开增湿器单元上,调整设置点至65%RH(无-condensing),并等待流变仪设定点相匹配。将源盘在适当的适配器。
- 在50℃下脱水的水凝胶基底15分钟,并放置到相应的适配器。该微阵列具有这两个显微镜载玻片和微孔板适配器。为排列35毫米玻璃底培养皿中,装入菜到6孔微量培养板和微孔板置于上样仪微孔板适配器。
- 调整程序的参数以准确地反映源板,阵列设计,并且期望的格式( 例如 ,显微镜载玻片或微量含有35 25mm培养皿)的布局。包括使用每个条件之间的水和二甲基亚砜(DMSO),以防止结转和交叉污染的洗涤步骤。
- 启动阵列制造,检查不不少于一次的湿度并没有跌破65%RH(无冷凝)一小时,该引脚没有堵塞。如果腐殖dity意外下降,暂停排列填补了加湿器和清除凝结的相关管。如果销被堵塞,暂停排列清洁销或与预清洁销否则取代。注意,有可能数组多种类型的顺序的生物分子上提供了足够的干燥时间相同基片( 即 ,4小时到过夜)。
- 一旦该计划完成后,将捏造该阵列覆盖在室温下铝箔和65%RH(无冷凝)隔夜滑框或微孔板。需要注意的是,可能有必要利用一般蛋白质污渍或免疫荧光评估阵列质量和保留;看到Brafman 等。有关详细信息,25。
3.细胞培养和试验读数
- 制造后的第二天,将排列基材在4-腔菜(显微镜载玻片)或6孔微量(培养皿中),并在1%的沉浸在PBS V / V青霉素/链霉素;使用4毫升的幻灯片和3毫升的菜肴。暴露于UV下进行30分钟。交换青霉素/对细胞培养基链霉素溶液。
- 收集和计数细胞。种子到阵列在500×10 3 -以每显微镜载玻片4 mL和?35毫米的培养皿3毫升2×10 6个细胞/阵列。孵育阵列培养在37℃和5%CO 2的2 - 24小时或直至填充以及细胞岛的形成。同时调整播种密度,并根据需要为你的细胞和特定应用程序的时间。 Underseeding( 即低密度或播种时间)可能会导致阵列贫困人口和生物扭曲的结果。播( 即高密度或播种时间)可能会导致减少阵列完整性由于该岛脱离。
- 允许形成细胞岛,洗阵列培养两次预热细胞培养基后;再次使用4毫升的幻灯片和3毫升的菜肴。 OptionaLLY添加适当的控制和处理的感兴趣的生物系统( 例如 ,小分子抑制剂,生长因子等 )。改变每1阵列的媒体 - 2天,以保持任何治疗浓度。启动阵列文化的5 D - - 由内按1 TFM免疫或细胞底物相互作用评估细胞标记的表达和细胞功能看选项1和下面的选项2。
- 选项1:执行端点免疫。请注意,某些蛋白的免疫荧光可以使用甲醇,乙醇,或HCl需要更严格的透。由于以阵列的潜在损害,评估和大规模实验,使用前优化每个通透协议。
- 从阵列载玻片在4腔菜肴抽吸细胞培养基,并添加新鲜制备的4%体积的4毫升/滑动/ v的多聚甲醛(PFA)的PBS。孵育在室温下15分钟。
小心:世博会URE到PFA可导致急性毒性,也可刺激或接触皮肤腐蚀。戴防护手套,衣服和保护眼睛,只有在化学通风柜使用。 - PFA吸液和清洗每幻灯片3次,4毫升的PBS。此时,固定的幻灯片可以被存储在4℃下1周。它是可取的,但是,通过免疫标记和安装在同一天作为定影继续,以确保数组的完整性。
- 抽吸PBS并且加入0.25%体积的4毫升/滑动/体积的Triton X-100的PBS中。孵育在室温下10分钟。
- 抽吸的Triton X-100溶液和洗涤各滑动3次用4mL PBS中。添加相匹配的二级抗体的物种的5%体积/体积血清的4毫升/幻灯片( 例如 ,驴二抗驴血清)在PBS中并在室温下孵育1小时。
- 彻底去除每张幻灯片封闭液。加在PBS中的5%体积/体积的血清稀释的初级抗体的500微升/滑动。这个体积足以在4℃下以覆盖在室温下两1小时孵育阵列以及过夜孵育。
- 洗净每个阵列幻灯片3次,4毫升的PBS。彻底清除最后清洗,并添加PBS在5%V / V血清稀释适当的二级抗体的500微升/幻灯片。
- 洗净每个阵列幻灯片3次,4毫升的PBS。小心使用镊子解阵移除之前的幻灯片与卫生署2 O简要冲洗。使用实验室组织到灯芯或干残留卫生署2 O.
- 吸取100μL整个幻灯片安装用DAPI解决方案,同时目视确认整个阵列的全覆盖。
- 放置一个22×60毫米盖玻片在幻灯片安装。密封采用透明指甲油盖玻片的边缘。商店在黑暗中在4℃下直到成像,不早于第二天。
- 使用一个芯片扫描仪或倒置荧光显微镜图像equipp整个阵列编一个机器人的阶段。微阵列扫描仪提供更快的读出,但可能需要Cy3标记或Cy5的兼容的荧光团和往往有限的分辨率中的单个细胞的顺序( 即 ,1 - 10微米)。荧光显微镜提供使用各种荧光信道的选择和更高的分辨率(<1微米,约100×总放大倍数),但提供取决于机器人阶段和放大/物镜的质量更慢的读出。
- 下次捕获从任一方法作为TIFF文件整个阵列的图像,以防止与其它的文件格式( 例如 ,JPG)相关的数据压缩或损失。
- 从阵列载玻片在4腔菜肴抽吸细胞培养基,并添加新鲜制备的4%体积的4毫升/滑动/ v的多聚甲醛(PFA)的PBS。孵育在室温下15分钟。
- 选项2:执行使用TFM细胞 - 基底相互作用的实时评估。
- 制备1%体积/体积的牛血清白蛋白(BSA)和1%体积/体积的十二烷基硫酸钠(SDS)在PBS中的溶液TFM期间解离从基质细胞。
- 移动包含数组文化毫米至35毫米培养皿一个温育(37℃,5%CO 2),以用于TFM测量机器人阶段倒置荧光显微镜。
- 用相差显微镜个体细胞岛在一个碟中,标记的位置(X坐标,Y坐标)和聚焦平面(Z坐标)。
- 切换到远红荧光显微镜可视化的珠子。返回到每个保存在前面的步骤中的位置并修正,使得只有下面的细胞岛珠的第一层是在焦点的聚焦平面的Z坐标。保存新的坐标,并继续所有细胞海岛自动成像捕捉解离前阶段的对比度和远红荧光图像。
- 小心加BSA / SDS溶液150微升的菜,并等待5分钟,使从基板完整细胞分离;用相差显微镜监测细胞分离。
- 小区岛屿已经从基材分离后,返回到t他标记的位置,然后检查珠第一层仍然关注的焦点。如果这些珠是外的平面由于由细胞产生的牵引力引起的变形,然后纠正,使它们再一次在焦点的聚焦平面的Z坐标。保存校正的Z坐标和重复所有岛屿的自动成像捕捉解离后的远红荧光图像。
- 重复步骤3.5.1 - 3.5.4剩余的菜肴。
4.数据分析
- 免疫荧光分析数据。
- 过程中获得的图像阵列。分裂复合阵列的图像转化成含有单个通道( 即 ,红色,蓝色或绿色)的文件和转换为8位TIFF图像43,44。应用分级( 例如 ,2×2或4×4),以降低图像的大小来〜每通道32百万像素到ENTI下游单细胞分析期间减少内存需求重新排列的图像。参见“array_processing.ijm”为ImageJ的宏执行这些阵列处理步骤补充代码文件。
- 请注意,在左上,左下,以及右下罗丹明缀合的葡聚糖标记或排列条件的像素的坐标。使用这些坐标旋转8位TIFF图像是完全垂直,并且,以后,从与特定的排列条件的单细胞分析注释输出。看到这些阵列转动和网格步骤的实现补充编码文件名为“rb_array_rotater.ijm”,“rg_array_rotater.ijm”,“rgb_array_rotater.ijm”和“array_gridding.ijm”。
- IdentifyPrimaryObjects,IdentifySecondaryObjects和MeasureObjectIntensity:结合了出色的执行单细胞分析,使用下面的模块CellProfiler旋转8位TIFF图像(版本2.1.1)45。 IdentifyPrimaryObjects标识核,IdentifySecondaryObjects标识与每个细胞核相关immunolabels和MeasureObjectIntensity为双方提供核标签和immunolabels quantifications。
- 从使用ExportToSpreadsheet模块的所有三个模块由通道CSV文件输出的单节数据,便于以后下游分析。见补充编码文件名为“b_array_image_analysis.cppipe”,“gb_array_image_analysis.cppipe”,“rb_array_image_analysis.cppipe”和“rgb_array_image_analysis.cppipe”实施这些步骤包括红色,绿色或蓝色通道图像集CellProfiler管道。
- 转换数据以考虑实验变异性和非高斯单细胞分布,通过生物复制46应用位数正常化。这个过程跨越产生重复共享分发,使在immunolabel强度变化的无偏的比较。此外,UNL迈克的Z得分和其他参数的方法,分位数归一化是非参数和不承担数据的特定分布,允许更多的代表性的单细胞的行为分析作为排列条件的功能。
- 绘图数据和解释。根据不同的生物系统和假设上,计算和绘制的每个阵列条件下合奏一种或多种措施:
- 计算并绘制每岛细胞粘附和存活的在实验过程中的组合度量。
- 计算并绘制位数 - 分归immunolabel强度作为细胞命运或功能的量度。
- 计算以及由强度高于一个一致的阈值来确定,一般为2的sd阴性对照的平均强度以上绘制阳性细胞的immunolabel的百分比。
- 或者,为了immunolabel强度的情节分布研究和分类的单细胞的行为作为摆着条件的功能。这些分布可以进一步使用集中趋势(均值,中位数,模式)和变异(变异,变异系数,Fano的因子)和假设检验方法如Kolmogorov-Smirnov检验措施表征。
- 分析TFM数据。这里将描述巴特勒等人结合先前开发的算法的方法。王等人。 40,47。
- 使用ImageJ的批量图像转换成8位TIFF文件。适用像素平均像素合并( 例如 ,2×2),以减少下游分析的计算成本和时间。作为TFM算法已主要集中在单细胞分析,相比于单个细胞的细胞-基底界面的岛屿(〜17.5×10 3μm2以下)的大细胞-基底界面(75微米2)necessitates离散化的一步。
- 输入捕获的相衬和远红色荧光图像(包括预解离和离解后)转换成科学编程环境如MATLAB和过程中使用Butler 等的以前开发的算法。王等人。 40,47。
- 选择远离小区岛三个区域。这些区域被用于考虑到由于图像或样品漂移位移。
- 提供给从像素转换为微米( 例如 ,0.454像素/微米)的因子,杨氏模量的基片( 例如 ,13千帕),和泊松比( 例如 ,0.48为这里所描述的聚丙烯酰胺凝胶)。
- 对于每一个岛,周围画外围定义几何约束的边界;这个边界之外的所有力量都归零。这种约束制度合理给出的大DISTANCE( 即 450微米),岛屿之间。
- 计算每个岛根均方牵引应力和收缩的时刻。收缩的时刻是在整个细胞岛的残余应力的量度,并且已经显示出反映细胞-细胞相互作用48的强度。对于每个阵列条件下,平均根均方值在多个岛屿和生物学重复,并计算相关的假设检验方差。另外,也可以进行平均应力或力矩的分布在许多岛屿提供既措施几何形状从岛的中心的功能, 例如 ,距离的代表图。
Representative Results
使用此平台,我们研究在肝脏祖34,35的命运规范生物化学和生物物理线索的作用。 A / G蛋白偶联Notch配体显示出改善的保持和集群中的聚丙烯酰胺水凝胶( 图3A),并还能够驱动肝祖细胞分化走向胆管细胞命运( 图3B)。使用单细胞分析,我们量化的Notch配体的ECM蛋白胶原蛋白I,胶原蛋白III,胶原蛋白IV,纤连蛋白,和层粘连蛋白( 图3C)的反应,发现肝脏祖细胞的配体的反应也取决于ECM上下文。最后,我们利用shRNA的敲除产生肝祖没有配体DLL1和JAG1。向排列Notch配体的反应向变取决于公关任一配体的esence,确认该响应的细胞外配体也是细胞内在配体表达( 图3D)的功能。此外,我们观察到双阳性的一个独特的亚群(ALB + / OPN +)细胞中的DLL1击倒( 图3D)。总之,这些代表性的结果表明:(1)阵列格式的组合能力,例示由多个排列ECM蛋白和Notch配体与个别的配位体的击倒的配对; (2)不仅功能排列ECM蛋白,但也可通过蛋白A / G介导的偶联排列的细胞间的配体; (3)我们的单细胞分析和辨别独特的亚群的能力的实现。
我们还观察到肝祖细胞的分化取决于衬底的刚度和ECM组合物( 图4A上都翁>),特别是发现IV型胶原是软,硬衬底支持的分化,而纤连蛋白只支持刚性基板( 图4B)的分化。 TFM测量的代表热图表明,在对IV型胶原低的衬底的刚度持续牵引应力促进分化成胆管细胞( 图4C),通过平均根均方值( 图4D)证实这一发现。总之,这些代表性的结果表明:(1)TFM的成功整合与细胞微阵列上带有可调刚性基板来评估两个细胞表型和牵引应力; (2)同时与基质组合物和基板的刚度肝祖细胞命运的协调;及(3)在细胞微阵列我们的TFM分析和典型的牵引应力分布的执行。
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图1:概述示意图,显示前三的实验部分。在第一节中,玻璃基板清洗和硅烷化,以促进聚丙烯酰胺水凝胶的制备。在第2节中,感兴趣的生物分子的组合在384孔微孔板源制备。然后,机器人点样仪装有干净引脚,源微孔板和聚丙烯酰胺水凝胶和初始化,制造的水凝胶阵列。在第3节,细胞接种到阵列域和允许粘附,进行兴趣培养协议之后。在终点,细胞是固定的免疫细胞化学/免疫荧光分析或使用TFM。比例尺是75微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2:处理和阵列免疫荧光数据分析。 (A),瓷砖,复合32位RGB图像首先装箱,然后分割成单独的8位通道。使用排列的荧光标记物和细胞岛的组合,阵列的三个角被确定,以允许自动定向和阵列网格。 (B)中的单细胞数据是为输入阵列的每一个通道产生的。为了解释实验漂移,分位数归一化是通过生物复制施加,产生在所有重复单个共享分布。分位数归一化的数据随后被绘制并经由合奏测量计算解释( 例如 ,细胞/岛,平均强度,正面为一标签百分比细胞)或单细胞分布的直接分析。M /文件/ ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3:Notch配体介导介绍祖肝脏分化。 (A)的Fc重组Notch配体铁血-1(JAG1)和Delta样1(DLL1)展出时蛋白A / G摆着改进保留和集群。比例尺为50微米。 (二)肝祖细胞在与Notch配体呈现分化成胆管细胞。 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)是一种核标签,白蛋白(ALB)是肝细胞标志物,以及骨桥蛋白(OPN)是胆管细胞标记。比例尺为150微米。 (C)细胞百分比阳性OPN上的ECM蛋白的Notch配体JAG1,DLL1和Delta样4(DLL4)的量化胶原蛋白I,Collagen III,IV型胶原,纤连蛋白,层粘连蛋白。学生t -tests分别对每个ECM蛋白中的每个排列Notch配体与P值为P <0.05(*)表示对对照IgG进行。 (D)成像ALB和OPN对胶原III细胞呈现与Notch配体JAG1,DLL1和DLL4流式细胞仪。无缺口肝祖细胞配体DLL1和JAG1( 即 shDll1和shJag1)用shRNA的敲除产生。在(C)的数据表示为平均值±SEM这个数字已从Kaylan 等改性。 34。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4:基质成分和基质刚度首席运营官rdinate肝祖分化。 (一)肝祖分化为胆管细胞是依赖于这两个ECM成分和基质刚度。 DAPI是核标签,ALB是肝细胞标记,OPN是胆管细胞标志物。 (B)中的正面为OPN细胞百分比上的杨氏模量的基片30千帕,13千帕,并在4kPa用于胶原I(C1)的,IV型胶原(C 4),纤连蛋白(FN),以及所有的双向组合的定量这些细胞外基质蛋白。 (C)细胞牵引压力取决于两个基底刚度和细胞外基质成分上。 (D)上的杨氏模量的基片30千帕和4千帕为胶原蛋白I(C1),IV型胶原(C 4),纤连蛋白(FN),这些的所有双向组合牵引应力的根均方值的量化ECM的蛋白质。在(B)和(D),数据以平均值±SEM和学生t -tests分别针对30千帕执行用于与P值每个的ECM组合为P <0.05(*),P <0.01(**)表示,和P <0.001(***)。比例尺是50微米。这个数字已经从Kourouklis 等进行修改。 35。 请点击此处查看该图的放大版本。
部分 | 问题 | 可能原因 | 解 |
1.制造聚丙烯酰胺基质。 | 玻璃罩不能从水凝胶中移除。 | 过聚合。 | 减少聚合时间<10分钟(4瓦/米2)。检查UV crossli北部重点经济区产量预期范围之内。 |
可怜的聚丙烯酰胺水凝胶的聚合。 | Underpolymerization。 | 增加聚合时间> 10分钟(4瓦/米2)。检查UV交联剂产量预期范围之内。 | |
聚丙烯酰胺水凝胶去除玻璃罩后损坏。 | 软聚丙烯酰胺水凝胶是容易损坏。 | 我们观察减少为最柔软的特别( 即 4千帕)的水凝胶的水凝胶制造的成品率(〜50%)。轻拿轻放的水凝胶,增加的出发人数达到期望的收益率。 | |
2.制作阵列。 | 可怜的或不一致的斑点形态。 | 加湿器不一致功能。 | 检查加湿器和贯穿每个印数流变仪的功能,并保持65%RH。 |
卡在打印头堵塞或针GED。 | 清洁打印头,允许自由运动的针。干净彻底针或前每个打印运行之后,从销渠道除去聚集。 | ||
3.细胞培养和试验执行。 | 细胞脱落或死亡初始附件后阵列。 | 播和过度增生。 | 降低了初始接种密度和时间。使用数组文化中“维修”或“分化”媒体以减少细胞增殖。 |
从有毒的水凝胶丙烯酰胺单体的释放。 | 水凝胶浸泡在蒸馏水中2 O,至少3天,以允许丙烯酰胺单体的扩散/释放和减少细胞毒性。 | ||
细胞不重视阵列。 | Underseeding。 | 增加初始接种密度和时间。使用更强烈粘附的细胞类型。 | |
贫困沉积矩阵或生物分子的条件。 | 颗粒和聚集体的清洁销,确认印刷参数,并且评估荧光标记, 例如 ,若丹明共轭葡聚糖斑点。 | ||
细胞 - 基质相互作用的特异性。 | 不同的细胞类型专门坚持一些而不是其他细胞外基质蛋白。测试多个不同的ECM蛋白与你的细胞。 | ||
加工后的次优阵列存储。 | 我们建议在65%RH和室温下存放过夜捏造阵列,部分冻结期间避免阶段的变化。细胞粘附是既湿度,温度和存储时间敏感;确保这些参数都是一致的/你的实验进行了优化。 | ||
细胞培养过程中从玻璃基板的水凝胶的脱离。 | 可怜的滑动清洗和硅烷化。 | 幻灯片清洗更换工作方案和硅烷化。 | |
Overdehydrated水凝胶。 | 不离开水凝胶在热板上脱水长于15-30分钟。 | ||
4.分析数据。 | 重复点和幻灯片之间的高变异性。 | 变异阵列制造。 | 检查引脚和打印头清洁。确认加湿器的功能。可视化和使用荧光标记量化现货和阵列质量。存储阵列如上建议。 |
表1:故障排除。
Discussion
在我们的实验中,我们已经发现,最常见的故障都涉及到制造的阵列的质量和差的特征在于在感兴趣的生物系统响应。我们建议读者参考表1在细胞微阵列实验常见失效模式和相关的故障排除步骤。特别是关于阵列的质量,我们推荐以下。确认排列程序,参数,以及使用荧光标记的分子,例如若丹明共轭葡聚糖缓冲器的技术质量和鲁棒性。彻底清洁针之前或按照制造商的说明书排列,并进一步在视觉上后检查销渠道使用光学显微镜是明确的碎片。使用通用的蛋白质染色或免疫标记确认阵列生物分子的保留。需要注意的是低于70 kDa的分子量的生物分子经常不保留在水凝胶23, SUP> 31。使用多种细胞类型验证阵列的生物分子的细胞的功能。请注意,只有贴壁细胞与阵列兼容;另外,粘附到阵列是依赖于两个小区特定属性( 例如 ,整联表达谱),并将选定ECM蛋白。
由于篇幅有限,我们这里不提供阵列设计,布局和制造广泛的治疗和读者参考以前的作品23,25。我们一般使用10-20独特的生物分子的条件( 即 ,5-10个/条件)组成的100点的子阵列(150微米的光斑直径,450微米的中心-至-中心距离)。子阵列的一个阵列的数量取决于所感兴趣的生物分子的条件的数量,这可以舒适地按比例放大到1,280上的一个25×75毫米的显微镜载玻片(〜6400点的64子阵列)外部参照“> 25,31以上参数将取决于所感兴趣的图案尺寸进一步变化;能够从75产生图案的销- 450微米都是现成的。
阵列实验最好使用其他文化形式的利息高得分排列的情况下,法显装置和生物模型系统验证补充。具体而言,我们建议使用批量培养符合标准的分子生物学技术( 例如 ,定量RT-PCR,免疫印迹)或标准TFM一起进一步验证的选择摆着条件的影响。遗传操作在一个适当的生物模型系统还可以用来确认在阵列观察效果感兴趣的因子( 例如 ,敲除或过表达)。 在体内动物模型表示验证的另一种手段和最近使用的,例如,以确认在半乳凝素-3和半乳凝素8的中心作用肺癌转移的利基,如通过细胞芯片31,49初步确定。
其他一些方法已被用来探测细胞功能的微环境调控,包括各种二维微加工系统18,50,51,52,53,54,55和三维设计的生物材料系统56,57,58 ,59,60,61。与其他方法相比,这里描述的细胞微阵列平台的特别的优点包括:(1)的吞吐量达到数百或数千的因素的不同组合,可实现的相互作用效应的分析; (2)访问,自动成像和分析; (3)与排列因素控制介绍生物化学和生物物理读数的整合; (4),以改变基底材料特性的能力;和(5)含量高的细胞命运和功能的单细胞分析。
综上所述,随着TFM细胞芯片的可调谐基板刚性基材的结合使双方生物化学和生物物理线索的深入刻画。如这里介绍的,该平台是一般化并可以容易地应用于各种贴壁细胞类型和组织的上下文向细胞分化和机械传导的组合微环境调节的改进的理解。
Disclosures
作者宣称,他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们承认奥斯汀Cyphersmith和Mayandi Sivaguru(卡尔R. Woese研究所基因组生物学,伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校),与显微镜援助和在显微镜核心慷慨地容纳屏和视频捕捉。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4433 | Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes. |
100 × penicillin–streptomycin solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
22 × 60 mm coverglasses | Electron Microscopy Sciences | 63765 | |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) | Sigma-Aldrich | 440159 | Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood. |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) | Sigma-Aldrich | C3023 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | Cell E&G | GBD00002-200 | 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging. |
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile | USA Scientific | 1823-8400 | |
6-well polystyrene microplates | Fisher Scientific | 08-772-1B | 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179973 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Collagen I, rat tail | EMD Millipore | 08-115MI | |
Collagen III, human | EMD Millipore | CC054 | |
Collagen IV, human | EMD Millipore | CC076 | |
Crosslinker, 365 nm | UVP | CL-1000 | |
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa | ThermoFisher Scientific | D1841 | Used as a marker for array location. |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific (HyClone) | SH3001302 | |
Ethyl alcohol | Decon Labs | 2701 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED | |
Fc-recombinant DLL1, mouse | R&D Systems | 5026-DL-050 | |
Fc-recombinant DLL4, mouse | AdipoGen | AG-40A-0145-C050 | |
Fc-recombinant JAG1, rat | R&D Systems | 599-JG-100 | |
Fibronectin, human | Sigma-Aldrich | F2006 | |
Fluorescent microscope, inverted | Zeiss | Axiovert 200M | Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM. |
Fluoromount G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Glycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
Irgacure 2959 | BASF Corporation | 55047962 | |
Laminin, mouse | EMD Millipore | CC095 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179957 | |
Microarray scanner | GenePix | 4000B | Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible. |
Microarrayer | Digilab | OmniGrid Micro | Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted. |
Microscope slides, 25 × 75 mm | Sigma-Aldrich | CLS294775X25 | ~0.9 – 1.1 mm thickness. |
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) | Sigma-Aldrich | M7279 | CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood. |
Protein A/G, recombinant | ThermoFisher Scientific | 21186 | |
Pyrex drying tray, 2,000 mL | Fisher Scientific | 15-242B | |
Rectangular 4-chambered culture dish | Fisher Scientific (Nunc) | 12-565-495 | For cell culture on arrayed microscope slides. |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Stealth pin for arraying | ArrayIt | SMP3 | Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |
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