Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En High-throughput Cell microarray plattform for samsvarende analyse av celledifferensiering og Traction Forces

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55362
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana–Champaign

Summary

Celledifferensiering er regulert av en rekke microenvironmental faktorer, blant annet matrise sammensetning og underlaget materialegenskaper begge. Vi beskriver her en teknikk for anvendelse av mikromatriser celle i forbindelse med trekkraft mikroskopi for å evaluere både celledifferensiering og biomekaniske celle-substrat interaksjoner som en funksjon av microenvironmental sammenheng.

Abstract

Microfabricated cellulære mikromatriser, som består av kontakttrykte kombinasjoner av biomolekyler på en elastisk hydrogel overflate, gir en kontrollert, high-throughput konstruert system for å måle effekten av kledd biokjemiske signaler på celledifferensiering. Siste innsats med bruk av celle mikromatriser har vist sin nytte for kombinatoriske studier hvor mange microenvironmental faktorer presenteres i parallell. Imidlertid har dette arbeidet fokusert primært på å undersøke effekten av biokjemiske signaler på celle responser. Her presenterer vi en celle microarray plattform med tunbare materialegenskaper for å vurdere både celledifferensiering av immunfluorescens og biomekanisk celle-substrat interaksjoner med trekkraft mikroskopi. For å gjøre dette, har vi utviklet to forskjellige formater utnytte polyakrylamidprodukter hydrogeler av varierende Youngs modulus fabrikkert på enten objektglass eller glassbunn petriskåler. Vi tilbyr best praksis og feilsøking for fabrikasjon av mikromatriser på følgende hydrogel underlag, den påfølgende cellekultur på mikromatriser, og oppkjøpet av data. Denne plattformen er godt egnet for anvendelse ved undersøkelser av biologiske prosesser hvor det både biokjemiske (f.eks, ekstracellulær matrise-blandingen) og biofysiske (f.eks substrat stivhet) signaler kan spille betydelige, kryssende roller.

Introduction

Interaksjoner mellom celler og omkringliggende microenvironmental faktorer formidle et stort utvalg av biologiske prosesser gjennom utvikling, homeostase og sykdommer patogenese en, to, tre, fire. Disse microenvironmental interaksjoner omfatter levering av løselige faktorer til celler, celle-matrise binding, og celle-celle interaksjoner via ligand-reseptor binding. I tillegg til de ovennevnte biokjemiske betraktninger, biofysiske parametre, såsom substratet mekaniske egenskaper (f.eks, Youngs modulus, porøsitet) og celleform, og tilhørende nedstrøms mechanotransduction har i økende grad fått anerkjennelse som viktige mediatorer for celledifferensiering 5, 6, 7, 8, 9 10. Signaler som følge av disse microenvironmental interaksjoner tjene som input til genet nettverk og signalveier. Videre disse celle indre komponenter også gi tilbakemelding til mikromiljøet via skilles faktorer og matrisenedbrytende enzymer, som fullfører en kompleks co-reguleringssløyfe mellom celle iboende genetiske programmer og celle ytre microenvironmental faktorer 5, 11, 12.

Bruken av konstruerte systemer for kontrollert fremstilling av microenvironmental faktorer har vist seg nyttig i en rekke forskjellige sammenhenger 13, 14, 15. Microfabricated systemer i særdeleshet har tilrettelagt presis romlige fordelingen av proteiner og celler samt svært parallelized analyse via miniatyrisering 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Celle mikromatriser representere en slik microfabricated system i hvilke kombinasjoner av biomolekyler er kontakt-trykket på en elastisk polyakrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Inkluderingen av celleheftende komponenter (nemlig matriksproteiner) muliggjør vedvarende celleadhesjon og kultur på mikromatriser, som ofte følges av nedstrøms analyse via immunocytokjemi og fluorescerende pressen. Celle mikromatriser er produktivt rettet mot å oppnå en bedre forståelse av leveren celle fenotype 23, 26, nevrale forløper differensiering 27, Mammary stamfar skjebne beslutninger 28, embryonal stamcelle vedlikehold / differensiering 23, 29, 30, kreft metastase 31 lunge, og terapeutisk respons i melanom 32. Vi har nylig vist at bruken av celle mikromatriser for å definere rollen av ekstracellulær matriks (ECM) proteinsammensetningen i endoderm spesifikasjon 33, leverstamcelledifferensiering 34, 35, og lungetumorcellelegemiddelrespons 36. I disse arbeidene, har vi fokusert på å utvide kombinatoriske egenskapene til array plattform og utforske skjæringspunktene celle-egenverdi signale med ekstracellulære matrise sammensetning og biomekanikk. I tillegg har vi implementert biofysiske avlesninger i denne array plattform for å gi muligheten til å kvantitativt kjenneterize rolle celle kontraktilitet i differensieringsprosesser 35. For å gjøre dette, integrert vi trekkraft mikroskopi (TFM) med celle mikromatriser for å muliggjøre høy gjennomstrømming vurdering av celle-generert trekkraft. TFM er en mye brukt metode for å måle cellegenerert trekkrefter og har gitt betydelige innsikt om samordning av enkelt-celle og vev-nivå funksjon med den sammensetning og biomekaniske i den lokale mikro 37, 38, 39, 40. Dermed kombinerer TFM med celle mikromatriser gir en høy gjennomstrømming system for måling av nøkkel, fysiologisk relevante biofysiske parametere.

Cellen microarray plattformen er beskrevet her består av fire deler: fabrikasjon av polyakrylamid substrater, fabrikasjon av matriser, cellekulturen og analysen avlesning, og analyse av data. SeFigur 1 på en skjematisk oppsummering av de første tre forsøks seksjoner; se figur 2 for en skjematisk oversikt over den siste delen med fokus på analyse av immunfluorescens data. For å tilpasse den celle microarray plattformen til studier av biomekaniske celle-substrat interaksjoner, brukte vi polyakrylamid-substrater av avstembar Youngs modul, men lignende porøsitet, per Wen et al. 41. For å aktivere TFM måling av krefter som utøves av celler som på deres substrat, gjennomførte vi en glassbunn petriskål format i tillegg til den tykke glassobjektglassene hyppig benyttet av andre grupper. Således er i stand til å parallelle målinger av celledifferensiering via immunfluorescens på objektglass og celle-genererte krefter via TFM på separate glassbunn retter denne cellen microarray plattformen. Vi har også søkt flere forbedringer til den analytiske tilnærmingen er vanlig på celle mikromatriser. specifically, i stedet for parametrisk Z-scoring av generelle øya intensitet, måler vi encellede intensitet og gjelder quantile normalisering for å ta høyde for ikke-normalfordelinger og mer nøyaktig beskrive cellular atferd. Vi mener at disse forbedringene gir særlig nytte mot undersøkelser av biologiske prosesser der både biokjemiske og biofysiske signaler spille viktige, kryssende roller. Videre våre analytiske forbedringer muliggjøre anvendelsen av celle mikromatriser til studier av en rekke cellefunksjoner som enkelt-celle og populasjonsnivå oppførsel divergerer.

Protocol

1. Fabrikasjon av Polyakrylamidgeler Underlag

  1. Rene glass underlag - enten standard objektglass for endepunkts immunfluorescens eller glass-bunn 35 mm petriskåler for TFM - for å sikre optimal polyakrylamid hydrogel fabrikasjon og integritet under cellekultur. Alternativt kan du bruke pre-renset glass underlag.
    1. Dyppe glassubstrater i 0,25% volum / volum Triton X-100 i destillert vann (dH 2 O). Plasser substrater på en orbital-rystemaskin i 30 min.
    2. Fjern Triton X-100 og skyll underlag 5 ganger med dH 2 O. La underlag midt i siste skylling og sted på en orbital shaker i 30 min.
    3. Fjern dH 2 O og fordype underlag i aceton. Plasser substrater på en orbital-rystemaskin i 30 min.
    4. Fjern aceton og fordype underlag i metanol. Plasser substrater på en orbital-rystemaskin i 30 min.
    5. Fjerne metanol og skyll substrater 5 ganger med dH <sub> 2 O. fordype substrater i 0,05 N NaOH og legg dem på en orbital shaker i 1 time.
      FORSIKTIG: NaOH er svært etsende og kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Bruk vernehansker, klær og vernebriller.
    6. Fjern NaOH-oppløsning og skyll substrater 5 ganger med dH 2 O. Bruk filtrert komprimert luft for å tørke substrater og stek ved 110 ° C på en varm plate til tørr (5 - 15 min). Rengjorte underlag kan oppbevares i romtemperatur på ubestemt tid.
  2. Silanize rene glass-substrater for å sikre festing av polyakrylamid hydrogel.
    1. Dyppe rene glass-substrater i nylaget 2% volum / volum 3- (trimetoksysilyl) propyl-metakrylat (3-TPM) i etanol. Plasser substrater på en orbital-rystemaskin i 30 min.
      FORSIKTIG: 3-TPM er en brennbar væske. Holdes vekk fra varme, gnister, åpen ild og varme overflater og bruk kun i et avtrekksskap.
    2. Fjern 3-TPM-løsning og fordype substrater i EthaNol. Plasser substrater på en orbital-rystemaskin i 5 min.
    3. Bruk filtrert komprimert luft for å tørke bærerne og stek ved 110 ° C på en varm plate til tørr (5 - 15 min). HSTTanBeTiandlet underlag kan oppbevares i romtemperatur i opptil en måned.
  3. Alternativ 1: Frem polyakrylamidprodukter hydrogeler på silanerte objektglass for endepunkts immunfluorescens.
    1. Fremstille en pre-polymerløsning i dH 2 O med den ønskede akrylamid / bisakrylamid prosentandel (w / v) forhold for å fremstille substrater med Young-moduler 4 kPa (4% akrylamid, 0,4% bisakrylamid), 13 kPa (6% akrylamid, 0,45 % bisakrylamid), eller 30 kPa (8% akrylamid, 0,55% bisakrylamid) og lignende porøsitet, per Wen et al. 41. Vortex-løsning inntil den var klar og filter med en 0,2 um sprøyte. Pre-polymeroppløsninger kan lagres ved 4 ° C i 3 måneder.
      FORSIKTIG: Eksponering for akrylamid eller bisacrylamide kan resultere i akutt giftighet, Neurotoxicity, og irritasjon. Bruk vernehansker, klær og vernebriller.
    2. Forbered en fotoinitiator løsning av 20% vekt / volum Irgacure 2959 i metanol. Dette fotoinitiator løsningen kan ikke lagres, og må være forberedt frisk hver gang.
    3. Bland den pre-polymeren og fotoinitiator løsninger i en 9: 1 (pre-polymer: fotoinitiator) forhold. Eventuelt avgasse med et vakuumkammer i 15 minutter for å fjerne bobler.
    4. Plasser silanerte lysbilder i et glass tørke skuffen og pipettér 100 ul 9: 1 pre-polymer: fotoinitiator løsning på hvert lysbilde. Forsiktig dekke hvert lysbilde med en 22 × 60 mm dekkglass og samtidig unngå å skape bobler. Legg merke til at dekk forhindrer inhibering av polymerisasjonsreaksjonen av oksygen.
    5. Place tørking brett i en UV tverrbinder og eksponere lysbilder til 365 nm UV A i 10 min (4 W / m 2). Optimal polymeriseringstid etter behov. Lengre eksponeringer risiko problemer med å fjerne dekkglass på grunn av overpolymerization. Kortere eksponeringer rISK underpolymerization og lav hydrogel stabilitet.
    6. Fordyp hydrogeler i dH 2 O i 5 min. Fjern Dekk med en barberhøvel, tar seg ikke å skade de polymeriserte hydrogeler.
    7. La hydrogeler i dH 2 O ved romtemperatur i 1 - 3 d, endrer dH 2 O daglig. Dehydrere hydrogeler ved 50 ° C på en varm plate til den er tørr (15-30 min) og oppbevar ved romtemperatur i inntil 3 måneder.
  4. Alternativ 2: Frem fluorescerende perle holdig polyakrylamidprodukter hydrogeler på silanerte 35 mm med glassbunn petriskåler for live evaluering av celle-substrat interaksjoner ved bruk av TFM.
    1. Sonikere en stamløsning av 1 um fluorescerende kuler i 15 minutter for å spre aggregater.
    2. Fremstille en pre-polymerløsning i dH 2 O med den ønskede akrylamid / bisakrylamid prosentandel (w / v) forhold for å fremstille substrater med Young-moduler 4 kPa (4% akrylamid, 0,4% bisakrylamid), 13 kPa (6% akrylamid, 00,45% bisakrylamid), eller 30 kPa (8% akrylamid, 0,55% bisakrylamid) og lignende porøsitet, per Wen et al. 41. Vortex-løsning inntil den var klar og filter med en 0,2 um sprøyte. Pre-polymeroppløsninger kan lagres ved 4 ° C i 3 måneder.
      FORSIKTIG: Eksponering for akrylamid eller bisacrylamide kan resultere i akutt giftighet, nevrotoksisitet, og irritasjon. Bruk vernehansker, klær og vernebriller.
    3. Legg fluorescerende kuler til den pre-polymer-oppløsning ved en sluttkonsentrasjon på 0,2% volum / volum og vortex å blande.
    4. Forbered en fotoinitiator løsning av 20% vekt / volum Irgacure 2959 i metanol. Dette fotoinitiator løsningen kan ikke lagres, og må være forberedt frisk hver gang.
    5. Bland pre-polymer / perle og fotoinitiator løsninger i en 9: 1 (pre-polymer / vulst: fotoinitiator) forhold. Eventuelt avgasse med et vakuumkammer i 15 minutter for å fjerne bobler.
    6. Plasser silanerte 35 mm med glassbunn petriskåler i et glass tørke skuffen og pIpet 20 mL av 9: 1 pre-polymer / perle: fotoinitiator løsning på midten av hver tallerken. dekke hvert lysbilde med en 12 mm rund dekk forsiktig og unngå å skape bobler. Legg merke til at dekk forhindrer inhibering av polymerisasjonsreaksjonen av oksygen.
    7. For å fordele de fluorescerende kuler til overflaten av hydrogelen, inverterer retter og forlater ved romtemperatur i 20 min, pr Knoll et al. 42.
    8. Mens han fortsatt invertert, utsetter retter til 365 nm UV A i 10 min (4 W / m 2). Optimal polymeriseringstid etter behov. Lengre eksponeringer risiko problemer med å fjerne dekkglass på grunn av overpolymerization. Kortere eksponeringer risiko underpolymerization og lav hydrogel stabilitet.
    9. Dyppe hydrogeler i 0,1 M 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer og la ved romtemperatur i mørket over natten. Fjern Dekk forsiktig med en barberhøvel, tar seg ikke å skade polymer materialerv e d hydrogeler.
    10. Dehydrere hydrogeler ved 50 ° C på en varm plate til tørr (15 - 30 min). Hydrogeler kan lagres ved romtemperatur i mørke i 3 måneder.

2. Fabrikasjon av matriser

  1. Forbered buffere for å skrive ut biomolekyler. Bruk utskrift buffer i forhold til de biomolekyler av interesse. Vekstfaktor (GF) trykking buffer er i stor grad egner seg for andre klasser av molekyler, slik som celle-celle-ligander.
    1. For å fremstille 2 x ECM-protein trykking buffer, tilsett 164 mg natriumacetat og 37,2 mg av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 6 ml dH 2 O. Vortex og inkuber ved 37 ° C for å oppløse grundig. Etter solubilization, tilsett 50 mL av forvarmes Triton X-100 og 4 ml glyserol. Vortex og inkuber ved 37 ° C på nytt for å oppløse. Legg 40 - 80 ul iseddik, titrering for å justere pH til 4,8. 2 × ECM protein utskrift buffer kan lagres ved 4° C for en måned.
      FORSIKTIG: Eddiksyre er brannfarlig og etsende. Bruk vernehansker, klær og vernebriller.
    2. For å fremstille 2 x GF trykking buffer, tilsett 105,5 mg natriumacetat og 37,2 mg EDTA til 6 ml fosfat-bufret saltvann (PBS). Vortex og inkuber ved 37 ° C for å oppløse grundig. Etter oppløsning tilsettes 100 mg 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) og 4 ml glycerol. 2 x GF-proteinet trykking buffer kan lagres ved 4 ° C i en måned.
  2. Forbered kilde plate.
    1. I en 384-brønners V-bunn mikro, kombiner like volumer av 2 x trykking buffer med hver biomolekyl løsning ved dobbelt den bestemte konsentrasjonen.
      MERK: En passende mål konsentrasjon for de vanligste ECM proteiner er 250 mikrogram / ml, mens målkonsentrasjoner for andre typer kledd faktorer varierer avhengig oppbevaring i hydrogel og biologisk funksjon. Totalvolumet i hver brønn kan bliså lavt som 5 pl og trenger ikke være mer enn 15 pl. I tillegg til de biomolekyl kombinasjoner av interesse, omfatter en Arrayed fluorescerende markør for å lette nedstrøms bildeanalyse. Bruk rhodaminkonjugert dekstran (2,5 mg / ml).
    2. Bland hver brønn grundig ved pipettering, tar seg ikke å generere bobler. Sentrifuger kilden mikro i 1 min ved 100 x g. Dikte mikromatriser bruker kilde plater forberedt på samme dag og lagret ved 4 ° C inntil microarray fabrikasjon.
  3. Rengjør pins i henhold til produsentens instruksjoner før hver microarray fabrikasjon løp. Last rene pins direkte inn i skrivehodet på microarrayer.
  4. Forbered microarrayer og programmet med produsentens programvare. Selv om fremgangsmåten nedenfor er dels spesifikke for bestemte microarrayer brukt her, er driften av de fleste microarrayers lignende.
    1. Slå på luftfukter enhet, justere settpunktet til 65% RF (ikke-condensing), og vente til rheometer matcher settpunktet. Plasser kilde plate i riktig adapter.
    2. Dehydrere hydrogel substrater ved 50 ° C i 15 minutter og legges i riktig adapter. Den microarrayer har adaptere for både objektglass og mikro. For arraying 35 mm med glassbunn petriskåler, sette inn serviset inn i en seks-brønns mikroplate og plasser mikro inn i mikro adapteren på arrayer.
    3. Justere parametere i programmet for å stemme overens med oppsettet av kildeplaten, array design, og ønsket format (f.eks objektglass eller mikro inneholder 35 mm petriskåler). Omfatte vasketrinn ved bruk av både vann og dimetylsulfoksyd (DMSO) mellom hver tilstand for å forhindre overhenget og krysskontaminering.
    4. Begynn rekke fabrikasjon, sjekker ikke sjeldnere enn en gang i timen at fuktigheten ikke har falt under 65% RH (ikke-kondenserende), og at pinnene er ikke tett. Hvis HUMIdity har falt uventet, pause arraying å fylle luftfukter og fjerne tilhørende rør av kondens. Hvis pinnene er tette, pause arraying å rengjøre pinnene eller på annen måte erstatte med pre-renset nålene. Merk at det er mulig å matrise flere typer biomolekyler sekvensielt på samme underlag gitt tilstrekkelig tørketid (dvs. 4 h til over natten).
    5. Når programmet er ferdig, plasserer fabrikkert arrays i et lysbilde boks eller mikro dekket med aluminiumsfolie ved romtemperatur og 65% RH (ikke-kondenserende) over natten. Legg merke til at det kan være nødvendig å vurdere matrise kvalitet og retensjon ved hjelp av generell proteinflekker eller immunofluorescensanalyse; se Brafman et al. for mer informasjon 25.

3. Cellekultur og analyse Timer

  1. Dagen etter fabrikasjon, plasserer kledd underlag i 4-kamret retter (objektglass) eller 6-brønners mikroplater (petriskåler) og legg de i en%v / v penicillin / streptomycin i PBS; bruke 4 ml for lysbilder og 3 ml for retter. Utsettes for UV-C i 30 min. Utveksling penicillin / streptomycin løsning for cellekulturmedier.
  2. Samle og telle celler. Seed på arrays på 500 × 3 til 2 oktober × 10 6 celler / utvalg på 4 ml per objektglass og 3 ml per 35 mm petriskål. Inkuber array-kulturer ved 37 ° C og 5% CO 2 for 2-24 timer eller til dannelsen av godt befolkede celle øyene. Juster begge seeding tetthet og tid som er nødvendig for celler og bestemt program. Underseeding (dvs. lav tetthet eller seeding tid) kan føre til dårlig utvalg befolkningen og skjeve biologiske resultater. Seeding (dvs. høy tetthet eller seeding tid) kan resultere i redusert rekke integritet på grunn av øya avløsning.
  3. Etter noe som åpner for dannelsen av celle øyer, vaske matrise kulturer to ganger med forvarmet cellekultur media; igjen bruke 4 ml for lysbilder og 3 ml for retter. optionally legge hensiktsmessige kontroller og behandlinger (f.eks, små molekyl hemmere, vekstfaktorer, etc.) av interesse for det biologiske systemet. Endre media til gruppene hver med 1 - 2 dager for å opprettholde konsentrasjonen av eventuelle behandlinger. Vurdere celle markør uttrykk og cellefunksjon ved immunfluorescens eller celle-substrat interaksjoner med TFM innen 1-5 d initiere array-kulturer - se alternativ 1 og alternativ 2 nedenfor.
  4. Alternativ 1: Utfør endepunkt immunfluorescens. Legg merke til at immunfluorescens av noen proteiner kan kreve strengere permeabiliseringen ved anvendelse av metanol, etanol, eller HCl. På grunn av potensiell skade på matriser, evaluere og optimalisere hver permeabilization protokollen før bruk i større skala eksperimenter.
    1. Sug cellekulturmedier fra rekke lysbilder i 4-kamret retter og tilsett 4 ml / slide av nylaget 4% v / v Paraformaldehyde (PFA) i PBS. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
      FORSIKTIG: Exposure til PFA kan resultere i akutt giftighet og kan også irritere eller korrodere huden ved kontakt. Bruk vernehansker, klær og vernebriller, og bruk kun i et avtrekksskap.
    2. Aspirer PFA-oppløsning og vaske hvert lysbilde 3 ganger med 4 ml PBS. På dette punktet, kan faste lysbilder lagres ved 4 ° C i en uke. Det anbefales imidlertid å fortsette gjennom immunolabeling og montering på den samme dag som feste for å sikre matrise integritet.
    3. Aspirer PBS og tilsett 4 ml / lysbilde på 0,25% volum / volum Triton X-100 i PBS. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
    4. Sug av Triton X-100-løsning og vask hvert lysbilde 3 ganger med 4 ml PBS. Tilsett 4 ml / lysbilde av 5% volum / volum serum tilpasset arten av det sekundære antistoff (f.eks esel serum for esel sekundære antistoffer) i PBS og inkubert ved romtemperatur i 1 time.
    5. Fjern grundig blokkering løsning fra hvert lysbilde. Tilsett 500 pl / lysbilde av primært antistoff fortynnet i 5% volum / volum serum i PBS. Dette volum er tilstrekkelig til å dekke arrays for både 1 h inkubering ved værelsestemperatur, så vel som over natten inkubering ved 4 ° C.
    6. Vask hver oppstilling lysbilde 3 ganger med 4 ml PBS. Fjern grundig siste vask og tilsett 500 pl / lysbilde av den passende sekundært antistoff fortynnet i 5% volum / volum serum i PBS.
    7. Vask hver oppstilling lysbilde 3 ganger med 4 ml PBS. Vask kort med dH 2 O før forsiktig fjerne array-lysbilder fra løsning med tang. Bruk et laboratorium vev for å transportere eller tørr rest dH 2 O.
    8. Pipetter 100 mL av monteringsløsning med DAPI over lysbildet mens visuelt bekrefte fullstendig dekning av hele array.
    9. Plasser en 22 x 60 mm dekkglass over lysbilde for å montere. Forsegle kantene på dekkglass med klar neglelakk. Oppbevares i mørke ved 4 ° C til bildebehandling, tidligst neste dag.
    10. Bilde hele arrays ved hjelp av enten en microarray scanner eller invertert fluorescerende mikroskop equipped med en robot scenen. Microarray skannere gir raskere avlesning, men kan kreve Cy3- eller Cy5-kompatible fluorophores og er ofte begrenset oppløsning på rekkefølgen av enkeltceller (dvs. 1-10 mikrometer). Fluorescent mikroskoper gir muligheten til å bruke en rekke fluorescerende kanaler og høyere oppløsning (<1 mikrometer, ~ 100 × total forstørrelse), men gir tregere avlesning avhengig av kvaliteten av robot scenen og forstørrelse / objektiv.
    11. Lagre tatt bilder av hele arrays fra enten metode som TIFF-filer for å hindre datakomprimering eller tap knyttet til andre filformater (for eksempel JPG).
  5. Alternativ 2: Fremfør live evaluering av celle-substrat interaksjoner ved bruk av TFM.
    1. Fremstille en oppløsning av 1% volum / volum bovint serumalbumin (BSA) og 1% v / v natriumdodecylsulfat (SDS) i PBS for å skille cellene fra substrater under TFM.
    2. Flytt 35 mm petriskåler som inneholder matrise kulturer åen inkubert (37 ° C, 5% CO2), invertert fluorescerende mikroskop med en robot scene for TFM målinger.
      1. I en tallerken, merker stillinger (X-koordinat, Y-koordinat) og fokus flyene (Z-koordinat) av enkelte celle øyene som bruker fasekontrastmikroskop.
      2. Bytt til langt rød fluorescerende mikroskopi for å visualisere perlene. Tilbake til hver av posisjonene som er lagret i det foregående trinn og korrigere Z-koordinaten for fokusplanet, slik at bare det første lag av perler under cellen øya er i fokus. Lagre de nye koordinatene og fortsett til automatisert avbildning av alle celle øyer å fange pre-dissosiasjon fasekontrast og langt røde fluorescerende bilder.
    3. Tilsett forsiktig 150 mL av BSA / SDS-løsning til parabolen og vente 5 min for å tillate fullstendig celledissosiasjon fra underlaget; overvåke celledissosiasjon bruker fasekontrastmikroskop.
    4. Etter at celle øyene har blitt skilt fra underlaget, gå tilbake til tHan merket stillinger og sjekk at det første laget av perler er fortsatt i fokus. Hvis disse perler er ute av planet på grunn av deformasjon induseres av celle-genererte trekkraft, og deretter rette den Z-koordinaten for fokusplanet, slik at de igjen er i fokus. Lagre de korrigerte Z-koordinater og gjenta automatisert avbildning av alle øyer å fange post-dissosiasjon langt røde fluorescerende bilder.
    5. Gjenta trinn 3.5.1 - 3.5.4 for de resterende retter.

4. Analyse av data

  1. Analyse av immunfluorescens data.
    1. Prosess kjøpt array-bilder. Splitte sammensatte array-bilder til filer som inneholder individuelle kanaler (dvs. rød, blå eller grønn) og konvertere til 8-bits TIFF-bilder 43, 44. Påfør binning (f.eks 2 × 2 eller 4 × 4) for å redusere bildestørrelsen til ~ 32 megapiksler per kanal for å redusere minnekrav under nedstrøms encellet analyse av entire array-bilder. Se Supplemental Kode File tittelen "array_processing.ijm" for en ImageJ makro gjennomføringen av disse rekke behandlingstrinn.
    2. Merk koordinatene i piksler øverst til venstre, nederst til venstre, og nederst til høyre rhodaminkonjugert dekstran markører eller kledd forhold. Bruk disse koordinatene til å rotere 8-bits TIFF-bilder for å være helt loddrett, og senere for å kommentere utgang fra encellede analyse med konkrete kledd forhold. Se Supplemental Kode filer med tittelen "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", og "array_gridding.ijm" for implementasjoner av disse rekke roterende og kloss trinn.
    3. Utfør encellede analyse av binned, roteres 8-bits TIFF-bilder i CellProfiler (versjon 2.1.1) 45 ved hjelp av følgende moduler: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects, og MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects identifiserer kjerner, IdentifySecondaryObjects identifiserer immunolabels knyttet til hver cellekjernen, og MeasureObjectIntensity gir quantifications for både atom etiketter og immunolabels.
      1. Utgang encellede data fra alle tre moduler som en CSV-fil ved kanalen bruker ExportToSpreadsheet modulen for å lette senere nedstrøms analyse. Se Supplemental Kode filer med tittelen "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", og "rgb_array_image_analysis.cppipe" for CellProfiler rørledninger implementere disse trinnene for bildesett som inneholder røde, grønne eller blå kanaler.
    4. Å transformere data å gjøre rede for eksperimentell variabilitet og ikke-Gaussiske encellede distribusjoner, gjelder quantile normalisering av biologisk replikere 46. Denne prosessen genererer en felles fordeling mellom replikater og gjør det mulig objektive sammenligninger av endringer i immunolabel intensitet. Videre UNLike Z-scoring og andre parametriske metoder, er quantile normalisering ikke-parametrisk og ikke anta en bestemt fordeling av data, noe som åpner for mer representative analyser av enkeltcelle atferd som en funksjon av kledd tilstand.
    5. Plotte data og tolke. Avhengig av det biologiske system og hypotese, beregne og plotte en eller flere av de følgende ensemble tiltak for hver oppstilt tilstand:
      1. Beregne og plotte celler pr øy som et kombinert mål på adhesjonen og overlevelse i løpet av forsøket.
      2. Beregne og plotte quantile-normalisert immunolabel intensitet som et mål på celle skjebne eller funksjon.
      3. Beregne og plotte den prosentandelen av celler som var positive for en immunolabel som bestemmes av intensiteten over en konsistent terskel, vanligvis to sd ovenfor den midlere intensitet av en negativ kontroll.
      4. Alternativt kan du plotte fordelinger av immunolabel intensitet i orden undersøke og kategorisere enkeltcelle oppførselsom en funksjon av oppstilt tilstand. Disse fordelingene kan videre karakteriseres ved hjelp av målinger av sentraltendens (gjennomsnitt, median, modus) og variasjon (varians, variasjonskoeffisient, Fano faktor) og hypotesetestmetoder som Kolmogorov-Smirnov test.
  2. Analyse av TFM data. Her beskrives en tilnærming som omfatter et tidligere utviklet algoritme ved Butler et al. og Wang et al. 40, 47.
    1. Bruk ImageJ å batch konvertere bildene til 8-bits TIFF-filer. Gjelder piksel-midlet binning (for eksempel 2 x 2) for å redusere beregnings kostnader og tid for genetisk analyse. Som algoritmer for TFM har fokusert i stor grad på enkeltcelle-analyse, den store celle-substrat grensesnitt av øyene (~ 17,5 x 10 3 mikrometer 2) i forhold til den celle-substrat grensesnittet til en enkelt celle (75 mikrometer 2) nødvendigheter;Tates den binning trinn.
    2. Input fanget fasekontrast og langt røde fluorescerende bilder (både pre-dissosiasjon og post-dissosiasjon) i en vitenskapelig programmering miljø som MATLAB og prosessen ved hjelp av de tidligere utviklet algoritmer for Butler et al. og Wang et al. 40, 47.
      1. Velg tre regioner fjernt fra cellen øya. Disse regionene er vant til å ta hensyn til forskyvninger på grunn av bilde eller prøve drift.
      2. Gi den faktor for å konvertere fra piksler til mikrometer (f.eks 0,454 bildepunkter / um), Youngs modulus av substratet (f.eks, 13 kPa), og Poissons tall (for eksempel 0,48 for polyakrylamidgeler er beskrevet her).
      3. For hver øy, tegne en grense rundt periferien for å definere de geometriske begrensninger; alle krefter utenfor denne grensen, er nullstilt. Dette begrenset system er rimelig gitt store distaNCE (dvs. 450 mikrometer) mellom øyene.
    3. Beregn rot-middel-kvadrat trekkraft stress og kontraktile øyeblikk for hver øy. Den kontraktile øyeblikk er et mål på restspenningen over cellen øya og har vist seg å gjenspeile styrken av celle-celle interaksjoner 48. For hver kledd tilstand, gjennomsnittlig rot-middel-kvadrat verdier over flere øyer og biologiske replikat og beregne tilhørende varians for hypotesetesting. Det er også mulig å gjennomsnitt fordelingen av spenninger eller øyeblikk over mange øyer å gi et representativt kartet både tiltak som en funksjon av geometri, for eksempel, avstand fra sentrum av øya.

Representative Results

Ved hjelp av denne plattform, undersøkte vi rolle både biokjemiske og biofysiske signaler i skjebnen spesifisering av lever forløpere 34, 35. Protein A / G-konjugert Notch ligander viste forbedret retensjon og clustering i polyakrylamid hydrogel (figur 3A) og var dessuten i stand til å kjøre differensiering av leverstamfedre mot en gallegang celle skjebne (figur 3B). Ved hjelp av enkelt-celle analyse, vi kvantifisert reaksjon på de Notch ligander for ECM-proteiner kollagen, kollagen III, collagen IV, fibronektin og laminin (figur 3C), finne at responsen av lever progenitorceller til liganden avhenger også av ECM sammenheng. Sist, benyttet vi shRNA knockdown å generere lever forfedre uten ligander Dll1 og Jag1. Responsen på oppstilt Notch ligand varierte avhengig av presence av enten liganden, som bekrefter at responsen til den celle ytre ligand er også en funksjon av den celle indre ligand ekspresjon (figur 3D). Videre observerte vi en tydelig undergruppe av dobbel-positive (ALB + / OPN +) celler i Dll1 knockdown (figur 3D). Sammen utgjør disse representative resultater viser: (1) den kombinatoriske egenskapene til matrisen format, som eksemplifisert ved sammenkoblingen av flere oppstilt ECM-proteiner og Notch ligander med knockdown av individuelle ligander; (2) funksjonaliteten ikke bare kledd ECM-proteiner, men også oppstilt celle-celle-ligand via protein A / G-mediert konjugasjon; og (3) gjennomføring av våre enkelt-celle-analyse, og dens evne til å skjelne unike subpopulasjoner.

Vi har også observert at differensiering av progenitorceller leveren er avhengig av både substratet stivhet og ECM sammensetning (figur 4A ong>), spesielt opplever at kollagen IV er støttende for differensiering på både myke og stive underlag mens fibronektin støtter bare differensiering på stive underlag (figur 4B). Representative varme kart TFM målinger antydet at vedvarende trekkraft stress på lav underlaget stivhet på kollagen IV fremmet differensiering i gallegang celler (Figur 4C), et funn bekreftet av gjennomsnittlig root-middel-kvadrat verdier (Figur 4D). Sammen utgjør disse representative resultatene viser: (1) en vellykket integrering av TFM med celle mikromatriser på underlag med en fleksibel stivhet for å vurdere både cellefenotyp og trekkraft stress, (2) samordning av leveren stamcelle skjebne med både matrise-blandingen og substratet stivhet; og (3) gjennomføringen av våre TFM analyse og typiske trekkraft belastningsprofiler i celle mikromatriser.

e en "src =" / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversikt Skjematisk Viser de første tre Eksperimentelle paragrafer. I § ​​1 blir glass underlag rengjøres og HSTTanBeTiandlet å lette fabrikasjon av polyakrylamid hydrogeler. I avsnitt 2 er biomolekyl kombinasjoner av interesse forberedt på en 384-brønnen kilde mikro. En robot arrayer blir så lastet med rene pinner, kilden mikro, og polyakrylamid hydrogeler og initialisert, fabrikasjon arrays på hydrogeler. I avsnitt 3, blir cellene sådd ut på det oppstilt domenene og lov til å følge, hvoretter kulturen protokoll av interesse er utført. Ved endepunktet, blir cellene enten fast for immunocytochemistry / immunfluorescens eller analysert ved hjelp av TFM. Skala barer er 75 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

innen-page = "1"> Figur 2
Figur 2: Behandling og analyse av immunfluorescens data fra Arrays. (A) Flis, kompositt 32-biters RGB-bilder blir først binned og deretter delt inn i individuelle 8-bits-kanaler. Ved hjelp av en kombinasjon av kledd fluorescerende markører og celleøyene, er tre hjørner av matrisen identifisert til å brukes ved automatisk orientering og gridding av oppstillingene. (B) En-celle data genereres for hver kanal av inngangs matriser. For å ta hensyn til eksperimentell drift, er quantile normalisering påføres ved biologisk gjengivelse, som produserer en enkelt delt fordeling på tvers av alle replikater. Quantile normalisert data blir deretter plottet og tolket via beregning av ensemble målinger (f.eks, celler / øy, mener intensitet, prosent celler positive for en etikett) eller direkte analyse av encellede distribusjoner.m / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Notch Ligand Presentasjon som megler Liver Progenitor Differensiering. (A) Fc-rekombinant Notch ligander Jagged-en (JAG1) og Delta-lignende en (DLL1) viste forbedret retensjon og clustering når kledd med Protein A / G. Scale bar er 50 mikrometer. (B) Lever forfedre differensiert i gallegang celler ved presentasjon med Notch ligand. 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) er en kjernefysisk etikett, albumin (ALB) er en levercellemarkør, og osteopontin (OPN) er en gallegang cellemarkør. Scale bar er 150 mikrometer. (C) Kvantifisering av prosentandel av celler positivt for OPN for Notch ligander JAG1, DLL1, og Delta-lignende 4 (DLL4) på ECM proteiner kollagen, collagen III, IV kollagen, fibronektin og laminin. Student t -UNDERSØKELSER ble utført i forhold til kontroll-IgG for hvert oppstilt Notch ligand innenfor hver ECM-protein med P-verdiene som er angitt for P <0,05 (*). (D) Imaging cytometri av ALB og OPN for celler på kollagen III presentert med hakket ligander JAG1, DLL1, og DLL4. Leverstamfedre uten hakk ligander Dll1 og Jag1 (dvs. shDll1 og shJag1) ble generert ved hjelp shRNA knockdown. Data i (C) presentert som gjennomsnitt ± SEM Dette tallet er blitt endret fra Kaylan et al. 34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Matrix sammensetning og Substrat Stivhet Coordinate Liver Progenitor Differensiering. (A) Liver stamfar differensiering til gallegang celler er avhengig av både ECM sammensetning og underlaget stivhet. DAPI er en kjernefysisk etikett, ALB er en levercellemarkør, og OPN er en gallegang cellemarkør. (B) Kvantifisering av prosentandelen av celler positive for OPN på substrater av Youngs modul 30 kPa, 13 kPa, og 4 kPa for kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), og alle to-bestanddelers kombinasjoner ifølge disse ECM proteiner. (C) Celle trekkraft spenning er avhengig av både substrat stivhet og ECM sammensetning. (D) Kvantifisering av rot-middel-kvadrat-verdier av trekkraft belastning på substrater av Youngs modul 30 kPa og 4 kPa for kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), og alle to-veis kombinasjoner av disse ECM proteiner. I (B) og (D), ble dataene presentert som gjennomsnitt ± SEM og Student t -UNDERSØKELSERDet ble utført mot 30 kPa for hver ECM kombinasjon med P-verdiene som er angitt for P <0,05 (*) P <0,01 (**), og P <0,001 (***). Skala barer er 50 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Kourouklis et al. 35. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Seksjon Problem mulige årsaker Løsning
1. Fabrikasjon av polyakrylamid substrat. Dekkglass kan ikke fjernes fra hydrogel. Overpolymerization. Redusere polymerisasjonstiden til <10 minutter (4 W / m 2). Sjekk at UV crosslinker produksjonen er innenfor forventet område.
Dårlig polyakrylamid hydrogel polymerisasjon. Underpolymerization. Øke polymeriseringstid til> 10 minutter (4 W / m 2). Sjekk at UV tverrbinder produksjonen er innenfor forventet område.
Polyakrylamid hydrogeler er skadet etter fjerning av dekkglass. Myke polyakrylamid hydrogeler er lett å skade. Vi observerer minkende hydrogel fabrikasjon yield (~ 50%) for den mykeste (dvs. 4 kPa) hydrogeler spesielt. Håndtak hydrogeler forsiktig og øke startnummer for å oppnå ønsket utbytte.
2. Fabrikasjon av matriser. Dårlig eller inkonsekvent sted morfologi. Inkonsekvent luftfukter funksjon. Sjekk at luftfukter og rheometer en funksjonell gjennom hver opplag og vedlikeholde 65% RF.
Pins fast i skrivehodet eller tetteged. Rengjør skrivehodet for å tillate fri pin bevegelse. Rengjør pins grundig før eller etter hver utskriftsjobb for å fjerne aggregater fra pin-kanaler.
3. Cellekultur og analyse Execution. Cell avløsning eller død på arrays etter første vedlegg. Seeding og overdreven spredning. Redusere initial seeding tetthet og tid. Bruk "vedlikehold" eller "differensiering" media under rekke kultur for å redusere celleproliferasjon.
Frigjøring av giftig akrylamid monomer fra hydrogel. Sug hydrogeler i dH 2 O i minst 3 dager for å tillate diffusjon / frigjøring av akrylamidmonomer og redusere celletoksisitet.
Cellene ikke feste til arrays. Underseeding. Øke initial seeding tetthet og tid. Bruk en sterkere tilhenger celletype.
Dårlig avsetning avmatrise eller biomolekyl tilstand. Rengjør pins av partikler og aggregater, bekrefte utskriftsparametere og vurdere spotting av fluorescerende markører, f.eks rhodaminkonjugert dekstran.
Spesifisitet av celle-matriks-interaksjoner. Ulike celletyper holder seg spesielt til noen, men ikke andre ECM proteiner. Teste flere ulike ECM proteiner med cellene.
Suboptimal rekke lagring etter fabrikasjon. Vi anbefaler å lagre fabrikkerte arrays over natten ved 65% RF og romtemperatur, blant annet for å unngå faseendringer under frysing. Celleadhesjon er følsom for både fuktighet, temperatur og lagringstid; sørge for at disse parametrene er konsistente / optimalisert for eksperimentene.
Løsgjøring av hydrogel fra glass-substrat under cellekultur. Dårlig lysbilde rengjøring og silanisering. Skift arbeidsløsninger for lysbilde rengjøring ogsilanisering.
Overdehydrated hydrogel. Ikke la hydrogeler dehydrerende på en varm plate i mer enn 15-30 min.
4. Analyse av data. Høy variasjon mellom replikere flekker og lysbilder. Variasjon i matrisen fabrikasjon. Sjekk at pinnene og skrivehodet er rene. Bekreft luftfukter funksjon. Visualisere og kvantifisere sted og rekke kvalitet ved hjelp av fluorescerende markører. Lagre arrays som anbefalt ovenfor.

Tabell 1: Feilsøking.

Discussion

I våre forsøk har vi funnet at de mest vanlige feil er knyttet til kvaliteten av fabrikkerte matriser og dårlig karakterisert reaksjon i det biologiske system av interesse. Vi henviser leseren til tabell 1 for vanlige feilmodi i celle microarray eksperimenter og tilhørende feilsøkingen. Når det gjelder kvaliteten på arrays i særdeleshet, anbefaler vi følgende. Bekreft den tekniske kvaliteten og robustheten arraying programmer, parametere og buffere bruker fluorescensmerkede molekyler som rhodaminkonjugert dekstran. Rengjør pins enten før eller etter arraying per produsentens instruksjoner og videre visuelt sjekke at PIN-kanaler er fri for rusk å bruke et lysmikroskop. Bekreft Arrayed biomolecule oppbevaring bruke generelle protein flekker eller immunolabeling. Legg merke til at biomolekyler med en molekylvekt under 70 kDa blir ofte ikke holdes tilbake i hydrogelen 23, sup> 31. Validere Arrayed biomolecule celle-funksjonalitet ved hjelp av flere celletyper. Merk at bare adherente celler er kompatible med matriser; i tillegg, er adhesjon til matriser avhengig av både celle-spesifikke egenskaper (for eksempel integrin uttrykk profil), og de valgte ECM-proteiner.

På grunn av begrenset plass, har vi ikke gitt en omfattende behandling av matrise design, layout og fabrikasjon her og henviser leseren til forrige fungerer 23, 25. Vi bruker vanligvis 100 stikk undergrupper (150 mikrometer sted diameter, 450 mikrometer senter-til-senter avstand) består av 10-20 unike biomolekyl forhold (dvs. 5-10 flekker / tilstand). Antallet underordnede rekker i en matrise varierer avhengig av antall biomolekyl tilstander av interesse, som kan være komfortabelt skaleres opp til 1280 på en 25 x 75 mm objektglass (~ 6.400 flekker i 64 undergrupper)xref "> 25, 31 Parametrene ovenfor vil ytterligere variere avhengig av mønsterstørrelsen er av interesse;. nålene som er i stand til å generere mønstre 75-450 um er lett tilgjengelige.

Array eksperimenter er best supplert med validering av høy-scoring kledd forhold av interesse ved hjelp av andre kultur formater, analyseavlesninger, og biologiske modellsystemer. Spesielt anbefaler vi ytterligere validering av effekter av utvalgte kledd forholdene ved hjelp av bulk kulturer i forbindelse med standard molekylærbiologiske teknikker (f.eks QRT-PCR, immunoblotting) eller standard TFM. Genetisk manipulasjon (f.eks knockdown eller overekspresjon) av faktor av interesse i et egnet biologisk modellsystem kan også tjene til å bekrefte effektene som observeres i matriser. In vivo dyremodeller representerer en annen metode for validering og ble nylig anvendt, for eksempel, for å bekrefte den sentrale rollen til galectin-3 og galectin-8 ilungekreft metastatisk nisje, som i utgangspunktet identifisert via celle microarray 31, 49.

En rekke andre fremgangsmåter har vært anvendt for å probe microenvironmental regulering av cellefunksjoner, inkludert en rekke to-dimensjonale microfabricated-systemer 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 og tredimensjonale konstruerte biomateriale systemer 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I sammenligning med andre metoder, de spesielle fordeler ved cellen microarray plattformen som er beskrevet her består av: (1) gjennomstrømning inntilhundrevis eller tusenvis av forskjellige kombinasjoner av faktorer, slik at analyse av interaksjonseffekter; (2) tilgjengelig, automatisert bildebehandling og analyse; (3) integrering av både biokjemiske og biofysiske avlesninger med kontrollert presentasjon av oppstilt faktorer; (4) evnen til å variere underlaget materialegenskaper; og (5) høyt innhold av single-celle analyse av celle skjebne og funksjon.

I sammendraget, en kombinasjon av celle mikromatriser med TFM på underlag av fleksibel substrat stivhet gjør grundig karakterisering av både biokjemiske og biofysiske signaler. Som presenteres her, er denne plattformen generaliseres og kan lett anvendes på en rekke adherente celletyper og vev-kontekster i retning av en forbedret forståelse av kombinatorisk microenvironmental regulering av celledifferensiering og mechanotransduction.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi erkjenner Austin Cyphersmith og Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institutt for Genomisk Biology, University of Illinois i Urbana-Champaign) for å få hjelp med mikroskopi og for sjenerøst imøtekommende skjerm og videoopptak på mikros kjernen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. , Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).

Tags

Bioteknologi tissue engineering biomaterialer biomekanikk mikrocelle microarrays stem og stamcellebiologi
En High-throughput Cell microarray plattform for samsvarende analyse av celledifferensiering og Traction Forces
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P.,… More

Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces. J. Vis. Exp. (121), e55362, doi:10.3791/55362 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter