Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En High-throughput Cell Microarray Platform for korrelative Analyse af Cell Differentiering og Traction Forces

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55362
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana–Champaign

Summary

Celledifferentiering er reguleret af en række microenvironmental faktorer, herunder både matrix sammensætning og substrat materialeegenskaber. Vi beskriver her en teknik under anvendelse af celle microarrays sammenholdt med trækkraft mikroskopi at evaluere både celledifferentiering og biomekaniske celle-substrat-interaktioner som funktion af microenvironmental kontekst.

Abstract

Mikrofabrikerede cellulære mikroarrays, der består af kontakt-trykte kombinationer af biomolekyler på en elastisk hydrogel overflade, giver en tæt kontrolleret, high-throughput manipuleret system til måling af virkningen af ​​array biokemiske signaler på celledifferentiering. De seneste bestræbelser bruger celle microarrays har vist deres anvendelighed for kombinatoriske undersøgelser, hvor mange microenvironmental faktorer er vist i parallel. Imidlertid har disse bestræbelser primært fokuseret på at undersøge effekten af ​​biokemiske signaler på celle responser. Her præsenteres en celle microarray platform med afstemmelige materialeegenskaber til evaluering både celledifferentiering ved immunfluorescens og biomekaniske celle-substrat-interaktioner ved trækkraft mikroskopi. For at gøre dette, har vi udviklet to forskellige formater udnytte polyacrylamid hydrogeler af varierende Youngs modul fremstillet på enten objektglas eller glas-bottom petriskåle. Vi leverer best praksis og fejlmelding af fremstilling af mikroarrays på disse hydrogel substrater, den efterfølgende cellekultur på mikroarrays, og erhvervelse af data. Denne platform er velegnet til anvendelse i undersøgelser af biologiske processer, for hvilke både biokemiske (f.eks, ekstracellulær matrix sammensætning) og biofysisk (fx substrat stivhed) signaler kan spille betydelige, krydsende roller.

Introduction

Interaktioner mellem celler og omgivende microenvironmental faktorer medierer en lang række biologiske processer i hele udvikling, homeostase, og sygdom patogenese 1, 2, 3, 4. Disse microenvironmental interaktioner omfatter levering af opløselige faktorer til celler, celle-matrix binding, og celle-celle-interaktioner via ligand-receptor-binding. Ud over de ovennævnte biokemiske betragtninger biofysiske parametre, såsom substrat mekaniske egenskaber (f.eks, Youngs modul, porøsitet) og celleform, og tilhørende nedstrøms mechanotransduction har i stigende grad vundet anerkendelse som vigtige mediatorer af celledifferentiering 5, 6, 7, 8, 9 10. Signaler som følge af disse microenvironmental interaktioner tjener som input til gen-netværk og signalveje. Desuden er disse celle-iboende komponenter giver også feedback til mikromiljø via udskilles faktorer og matrix-nedbrydende enzymer, der fuldfører en kompleks samregulering loop mellem celle-iboende genetiske programmer og celle-ydre microenvironmental faktorer 5, 11, 12.

Anvendelsen af konstruerede systemer til kontrolleret præsentation af microenvironmental faktorer har vist sig nyttige i en række forskellige sammenhænge 13, 14, 15. Mikrofabrikerede systemer i særdeleshed har lettet præcis rumlig mønsterdannelse af proteiner og celler samt parallelt i stor analyse via miniaturisering 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cell microarrays repræsenterer et sådant mikrofabrikerede system, hvor kombinationer af biomolekyler er kontakt-trykt på en elastisk polyacrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Medtagelsen af ​​celle-klæbende komponenter (dvs. matrixproteiner) aktiverer vedvarende celleadhæsion og kultur på mikroarrays, der ofte efterfulgt af nedstrøms analyse via immunocytokemi og fluorescerende reportere. Cell microarrays er produktivt rettet mod at opnå en forbedret forståelse af lever-fænotype 23, 26, neural forløber differentiering 27, Mammary stamfader skæbne beslutninger 28, embryonale stamceller vedligeholdelse / differentiering 23, 29, 30, lungekræft metastase 31, og terapeutisk respons i melanom 32. Vi har for nylig demonstreret brugen af celle- microarrays for at definere rollen af ekstracellulær matrix (ECM) protein sammensætning i endoderm specifikation 33, liver progenitor differentiering 34, 35 og lunge tumor celle lægemiddelrespons 36. I disse værker, har vi fokuseret på at udvide de kombinatoriske evner array-platformen og udforske krydsene med celle-iboende signalering med ekstracellulær matrix sammensætning og biomekanik. Derudover har vi implementeret biofysiske udlæsninger i dette array platform for at tilvejebringe evnen til kvantitativt karakrisere rolle celle kontraktilitet i differentiering processer 35. For at gøre dette, vi integreret trækkraft mikroskopi (TFM) med celle microarrays at aktivere high-throughput vurdering af celle-genereret trækkraft. TFM er en bredt anvendt fremgangsmåde til måling af celle-genereret trækkræfter og har givet betydelige indsigter om koordinering af enkelt-celler og væv-niveau funktion med sammensætningen og biomekanik det lokale mikromiljø 37, 38, 39, 40. Således kombinerer TFM med celle mikroarrays tilvejebringer en høj kapacitet til måling Key, fysiologisk relevante biofysiske parametre.

Cellen microarray platform beskrevet her består af fire sektioner: fremstilling af polyacrylamid substrater, fabrikation af arrays, cellekultur og assay udlæsning og analyse af data. SeFigur 1 for en skematisk oversigt over de første tre eksperimentelle sektioner; se figur 2 for en skematisk oversigt over det sidste afsnit med fokus på analyse af immunofluorescens data. For at tilpasse cellen microarray platform til studier af biomekaniske celle-substrat-interaktioner, vi anvendte polyacrylamid substrater af afstemmelige Youngs modul men lignende porøsitet, pr Wen et al. 41. For at aktivere TFM målinger af kræfter, der udøves af celler på deres substrat, vi gennemført en glasbund petriskål format udover den tykke mikroskopglasplader ofte anvendes af andre grupper. Således er denne celle microarray platform er i stand til parallelle målinger af celledifferentiering via immunofluorescens på mikroskopobjektglas og celle-genererede kræfter via TFM på separate glas-bottom retter. Vi har også anvendt flere forbedringer i den analytiske tilgang almindeligt anvendt med celle mikroarrays. bestemt foreskriverly, i stedet for parametrisk Z-scoren for den samlede ø intensitet måler vi encellede intensitet og anvende fraktil normalisering for at tage højde for ikke-normale fordelinger og mere præcist beskriver cellulær adfærd. Vi mener, at disse forbedringer giver særlig anvendelighed over for undersøgelser af biologiske processer, hvor både biokemiske og biofysiske tidskoder spiller væsentlige, krydsende roller. Endvidere vores analytiske forbedringer gør det muligt at anvende celle microarrays til undersøgelser af en række cellulære funktioner, for hvilke encellede og population-niveau adfærd afviger.

Protocol

1. Fremstilling af Polyacrylamid Substrater

  1. Clean glassubstrater - enten standard objektglas for endpoint immunofluorescens eller glas-bund 35 mm petriskåle til TFM - for at sikre optimal polyacrylamid hydrogel fabrikation og integritet under celledyrkning. Alternativt brug pre-rengjort glas substrater.
    1. Fordybe glassubstrater i 0,25% v / v Triton X-100 i destilleret vand (dH 2 O). Placer substrater på en orbitalryster i 30 minutter.
    2. Fjern Triton X-100 opløsning og skyl substrater 5 gange med dH 2 O. Udfyld substrater neddykket i sidste skylning og sted på en orbitalryster i 30 minutter.
    3. Fjern dH 2 O og fordybe substrater i acetone. Placer substrater på en orbitalryster i 30 minutter.
    4. Fjern acetone og fordybe substrater i methanol. Placer substrater på en orbitalryster i 30 minutter.
    5. Fjern methanol og skyl substrater 5 gange med dH <sub> 2 O. Nedsænk substrater i 0,05 N NaOH og sted på en orbitalryster i 1 time.
      ADVARSEL: NaOH er meget ætsende og kan forårsage svære forbrændinger af huden og øjenskader. Bær beskyttelseshandsker, tøj og øjenbeskyttelse.
    6. Fjern NaOH-opløsning og skylles substrater 5 gange med dH 2 O. Brug filtreret trykluft til at tørre substrater og bages ved 110 ° C på en varmeplade indtil tørhed (5 - 15 min). Rensede substrater kan opbevares ved stuetemperatur i det uendelige.
  2. Silanize rene glassubstrater for at sikre fastgørelse af polyacrylamid hydrogel.
    1. Fordybe rene glassubstrater i frisk fremstillet 2% v / v 3- (trimethoxysilyl) propylmethacrylat (3-TPM) i ethanol. Placer substrater på en orbitalryster i 30 minutter.
      ADVARSEL: 3-TPM er en brændbar væske. Holdes væk fra varme, gnister, åben ild, og varme overflader og anvendes kun i et stinkskab.
    2. Fjern 3-TPM løsning og fordybe substrater i Ethanol. Placer substrater på en orbitalryster i 5 minutter.
    3. Brug filtreret trykluft til at tørre substraterne og bages ved 110 ° C på en varmeplade indtil tørhed (5 - 15 min). Silaniserede substrater kan opbevares ved stuetemperatur i op til 1 måned.
  3. Mulighed 1: Fabricate polyacrylamid hydrogeler på silaniserede objektglas til endpoint immunofluorescens.
    1. Forbered en præpolymer opløsning i dH2O med den ønskede acrylamid / bisacrylamid procentdel (vægt / volumen) forhold at fremstille substrater med Youngs moduli af 4 kPa (4% acrylamid, 0,4% bisacrylamid), 13 kPa (6% acrylamid, 0,45 % bisacrylamid), eller 30 kPa (8% acrylamid, 0,55% bisacrylamid) og lignende porøsitet, pr Wen et al. 41. Vortex-opløsning, indtil klar og filter med en 0,2 um sprøjte. Pre-polymeropløsninger kan opbevares ved 4 ° C i 3 måneder.
      ADVARSEL: Udsættelse for acrylamid eller bisacrylamid kan resultere i akut toksicitet, NeurotHuman Toksicitet og irritation. Bær beskyttelseshandsker, tøj og øjenbeskyttelse.
    2. Der fremstilles en fotoinitiator opløsning af 20% vægt / volumen Irgacure 2959 i methanol. Denne fotoinitiator løsning kan ikke lagres og skal fremstilles hver gang.
    3. Bland præ-polymer og fotoinitiator løsninger i en 9: 1 (præ-polymer: fotoinitiator) -forhold. Eventuelt afgasses med et vakuumkammer i 15 minutter for at fjerne bobler.
    4. Placer silaniserede dias i et glas tørring bakke og Pipettér 100 pi af 9: 1 pre-polymer: fotoinitiator løsning på hvert dias. dækker forsigtigt hver slide med en 22 × 60 mm dækglas og samtidig undgå at skabe bobler. Bemærk, at dækglasset forhindrer inhibering af polymerisationsreaktionen med oxygen.
    5. Sted tørring bakke i en UV tværbinder og udsætte objektglas 365 nm UV A i 10 minutter (4 W / m2). Optimer polymerisationstid efter behov. Længere eksponeringer risiko svært at fjerne dækglasset grund overpolymerization. Kortere eksponeringer risk underpolymerization og lav hydrogel stabilitet.
    6. Fordyb hydrogeler i dH 2 O i 5 min. Fjern dækglas med en barberkniv, pas på ikke at beskadige polymeriserede hydrogeler.
    7. Efterlad hydrogeler i dH2O ved stuetemperatur i 1 - 3 D, skiftende dH2O dagligt. Dehydrer hydrogeler ved 50 ° C på en varmeplade, indtil tørt (15-30 min) og opbevares ved stuetemperatur i op til 3 måneder.
  4. Mulighed 2: Fabricate fluorescerende perle-holdige polyacrylamid hydrogeler på silaniserede 35 mm glas-bottom petriskåle for levende evaluering af celle-substrat interaktioner ved hjælp TFM.
    1. Sonikeres en stamopløsning på 1 um fluorescerende kugler i 15 minutter for at dispergere aggregater.
    2. Forbered en præpolymer opløsning i dH2O med den ønskede acrylamid / bisacrylamid procentdel (vægt / volumen) forhold at fremstille substrater med Youngs moduli af 4 kPa (4% acrylamid, 0,4% bisacrylamid), 13 kPa (6% acrylamid, 0.45% Bisacrylamid), eller 30 kPa (8% acrylamid, 0,55% bisacrylamid) og lignende porøsitet, pr Wen et al. 41. Vortex-opløsning, indtil klar og filter med en 0,2 um sprøjte. Pre-polymeropløsninger kan opbevares ved 4 ° C i 3 måneder.
      ADVARSEL: Udsættelse for acrylamid eller bisacrylamid kan resultere i akut toksicitet, neurotoksicitet, og irritation. Bær beskyttelseshandsker, tøj og øjenbeskyttelse.
    3. Tilføj fluorescerende kugler til præpolymer opløsning ved en slutkoncentration på 0,2% v / v og vortex at blande.
    4. Der fremstilles en fotoinitiator opløsning af 20% vægt / volumen Irgacure 2959 i methanol. Denne fotoinitiator løsning kan ikke lagres og skal fremstilles hver gang.
    5. Bland pre-polymer / perle og fotoinitiator løsninger i en 9: 1 (præ-polymer / perle: fotoinitiator) -forhold. Eventuelt afgasses med et vakuumkammer i 15 minutter for at fjerne bobler.
    6. Placer silaniserede 35 mm glas-bottom petriskåle i et glas tørring bakke og pipet 20 pi 9: 1 præpolymer / bead: fotoinitiator opløsning på midten af ​​hver skål. dækker forsigtigt hver slide med en 12 mm cirkulær dækglas og samtidig undgå at skabe bobler. Bemærk, at dækglasset forhindrer inhibering af polymerisationsreaktionen med oxygen.
    7. For at fordele de fluorescerende perler på overfladen af hydrogelen, vendes retterne og henstår ved stuetemperatur i 20 minutter, pr Knoll et al. 42.
    8. Mens stadig inverteret, udsætte retter til 365 nm UV A i 10 minutter (4 W / m2). Optimer polymerisationstid efter behov. Længere eksponeringer risiko svært at fjerne dækglasset grund overpolymerization. Kortere engagementer risiko underpolymerization og lav hydrogel stabilitet.
    9. Fordybe hydrogeler i 0,1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) buffer og henstår ved stuetemperatur i mørke natten over. Fjern dækglas forsigtigt med en barberkniv, pas på ikke at beskadige polymerized hydrogeler.
    10. Dehydrere hydrogeler ved 50 ° C på en varmeplade indtil tørhed (15 - 30 min). Hydrogeler kan opbevares ved stuetemperatur i mørke i 3 måneder.

2. Fremstilling af Arrays

  1. Forbered buffere at udskrive biomolekyler. Brug trykning buffer er relevant for de biomolekyler af interesse. Vækstfaktor (GF) udskrivning buffer er generelt egnede til andre klasser af molekyler, såsom celle-celle-ligander.
    1. Til fremstilling 2 × ECM protein trykning buffer, tilsæt 164 mg natriumacetat og 37,2 mg ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til 6 ml dH 2 O. vortexes og inkuberes ved 37 ° C til grundigt solubilisere. Efter solubilisering tilsættes 50 pi forvarmet Triton X-100 og 4 ml glycerol. Vortexes og inkuberes ved 37 ° C igen for at solubilisere. Tilsæt 40 ​​- 80 uL iseddike, titrere at justere pH til 4,8. 2 × ECM protein trykning buffer kan opbevares ved 4° C i 1 måned.
      ADVARSEL: Eddikesyre er brændbart og ætsende. Bær beskyttelseshandsker, tøj og øjenbeskyttelse.
    2. Til fremstilling 2 × GF trykning buffer, tilsæt 105,5 mg natriumacetat og 37,2 mg EDTA til 6 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Vortexes og inkuberes ved 37 ° C til grundigt solubilisere. Efter solubilisering, tilsættes 100 mg 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) og 4 ml glycerol. 2 × GF protein trykning buffer kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
  2. Forbered source plade.
    1. I en 384-brønds V-bund mikroplade, kombinere lige store volumener af 2 × trykning buffer med hver biomolekyle opløsning til dobbelt målkoncentration.
      BEMÆRK: Det ønskede målkoncentration for mest almindelige ECM-proteiner er 250 ug / ml, mens målkoncentrationer for andre typer af grupperede faktorer varierer afhængigt af retention i hydrogelen og biologiske funktion. Det samlede volumen i hver brønd kan væreså lav som 5 uL og behøver ikke være mere end 15 uL. Foruden biomolekylet kombinationer af interesse, indbefatter en array fluorescerende markør for at lette downstream billedanalyse. Brug rhodamin-konjugeret dextran (2,5 mg / ml).
    2. Bland hver brønd grundigt ved pipettering, pas på ikke at generere bobler. Centrifugeres kilden mikropladen i 1 min ved 100 x g. Fabrikere mikroarrays bruger source plader forberedt på samme dag og opbevares ved 4 ° C indtil microarray fabrikation.
  3. Rene stifter i henhold til de anvisninger fra producenten før hver microarray fabrikation køre. Indlæse rene stifter direkte ind i skrivehovedet af microarrayer.
  4. Forberede microarrayer og programmet ved hjælp af producentens software. Selvom nedenstående trin er delvist specifikke for den bestemte microarrayer anvendes her, driften af ​​de fleste microarrayers er den samme.
    1. Tænd luftfugter enhed, justere setpunktet til 65% relativ luftfugtighed (ikke-condensing), og vente, indtil Rheometer matcher setpunktet. Placer kilde plade i passende adapter.
    2. Dehydrere hydrogel substrater ved 50 ° C i 15 minutter og anbringes i passende adapter. Den microarrayer har adaptere til både objektglas og mikroplader. Til gruppering 35 mm glas-bottom petriskåle, indlæse retter i en 6-brønds mikroplade og placere mikropladen i mikropladen adapter på arrayer.
    3. Justere parametrene i programmet præcist at afspejle opstillingen af kildepladen, array design, og ønskede format (f.eks mikroskopobjektglas eller mikroplade indeholdende 35 mm petriskåle). Inkluderer vasketrin under anvendelse af både vand og dimethylsulfoxid (DMSO) mellem hver tilstand for at forhindre overførsel eller krydskontaminering.
    4. Start vifte fabrikation, kontrol ikke mindre hyppigt end en gang i timen, at luftfugtigheden ikke er faldet til under 65% RH (ikke-kondenserende), og at benene er ikke tilstoppet. Hvis Humidity er faldet uventet, pause gruppering at fylde befugteren og rydde tilhørende rør af kondens. Hvis benene er tilstoppede, pause arraying at rense benene eller på anden måde erstatte med præ-renset ben. Bemærk, at det er muligt at Array flere typer af biomolekyler sekventielt på de samme substrater leveret tilstrækkelig tørretid (dvs. 4 timer og natten over).
    5. Når programmet er afsluttet, placere fabrikerede arrays i et dias boks eller mikroplade dækket med aluminiumsfolie ved stuetemperatur og 65% relativ luftfugtighed (ikke-kondenserende) natten over. Bemærk, at det kan være nødvendigt at evaluere matrix kvalitet og fastholdelse under anvendelse af almen protein pletter eller immunofluorescens; se Brafman et al. for flere detaljer 25.

3. Cell Culture og Assay udlæsning

  1. Dagen efter fabrikation, placere opstillede substrater i 4-kamre retter (mikroskop dias) eller 6-brønds mikroplader (petriskåle) og fordybe i 1%v / v penicillin / streptomycin i PBS; bruge 4 ml til dias og 3 ml til retter. Udsættes for UV C i 30 minutter. Exchange penicillin / streptomycin løsning til celledyrkningsmedier.
  2. Indsamle og tælle celler. Frø onto arrays ved 500 × 10 3 - 2 × 10 6 celler / matrix ved 4 ml pr objektglas og 3 ml pr 35 mm petriskål. Inkuber array-kulturer ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 - 24 t eller indtil dannelsen af godt befolkede celle øer. Juster både såning tæthed og tid som er nødvendig for dine celler og særlige anvendelse. Underseeding (dvs. lav densitet eller podning tid) kan resultere i dårlig matrix befolkning og skæv biologiske resultater. Eftersåning (dvs. høj densitet eller såning tid) kan resultere i reduceret matrix integritet på grund af ø løsrivelse.
  3. Korrigeret for dannelse af celle øer, vask array-kulturer to gange med forvarmet cellekultur medier; igen bruge 4 ml til dias og 3 ml til retter. Optionally tilføje passende kontroller og behandlinger (f.eks, småmolekyleinhibitorer, vækstfaktorer, etc.) af interesse for den biologiske system. Skift medierne af arrays hver 1 - 2 ud d for at opretholde koncentrationen af ​​nogen behandlinger. Vurdere celle markør udtryk og cellefunktion ved immunfluorescens eller celle-substrat interaktioner ved TFM inden for 1 - 5d initiere array-kulturer - se Mulighed 1 og Alternativ 2 nedenfor.
  4. Mulighed 1: Udfør endpoint immunofluorescens. Bemærk, at immunfluorescens af nogle proteiner kan kræve strengere permeabilisering anvendelse af methanol, ethanol eller HCI. På grund af potentiel skade på arrays, evaluere og optimere hver permeabilisering protokol før brug i større skala eksperimenter.
    1. Aspirer cellekulturmedier fra array-objektglas i 4 kamre retter og tilsæt 4 ml / slide frisk fremstillet 4% volumen / volumen paraformaldehyd (PFA) i PBS. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
      ADVARSEL: Exposure til PFA kan resultere i akut toksicitet og kan også irritere eller korroderer hud ved kontakt. Bær beskyttelseshandsker, tøj og øjenbeskyttelse og anvendes kun i et stinkskab.
    2. Aspirer PFA løsning og vask hver slide 3 gange med 4 ml PBS. På dette tidspunkt kan fikseret materiale opbevares ved 4 ° C i 1 uge. Det er tilrådeligt imidlertid at fortsætte gennem immunolabeling og montering på samme dag som fastgørelse for at sikre matrix integritet.
    3. Aspirer PBS og tilsæt 4 ml / slide på 0,25% v / v Triton X-100 i PBS. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Aspirer Triton X-100 opløsning og vask hver slide 3 gange med 4 ml PBS. Tilsæt 4 ml / slide af 5% v / v serum matches til arten af det sekundære antistof (f.eks æsel serum til donkey sekundære antistoffer) i PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
    5. Grundigt fjerne blokeringen opløsning fra hvert dias. Tilsæt 500 pl / slide af primært antistof fortyndet i 5% v / v serum i PBS. Denne mængde er tilstrækkelig til at dække arrays til både 1 h inkuberinger ved stuetemperatur samt overnattende inkubationer ved 4 ° C.
    6. Vask hvert array slide 3 gange med 4 ml PBS. fjerne grundigt den sidste vask, og der tilsættes 500 pl / slide af det passende sekundære antistof fortyndet i 5% v / v serum i PBS.
    7. Vask hvert array slide 3 gange med 4 ml PBS. Vask kortvarigt med dH 2 O før forsigtigt fjerner array-slides fra løsning ved hjælp af pincet. Brug et laboratorium væv at væge eller tør rest dH 2 O.
    8. Pipette 100 pi monteringsløsning med DAPI tværs af dias, mens visuelt bekræfter fuldstændig dækning af hele systemet.
    9. Placer en 22 × 60 mm dækglas over slide at montere. Forsegle kanterne af dækglasset med klar neglelak. Opbevares i mørke ved 4 ° C indtil billeddannelse, tidligst den næste dag.
    10. Billede hele arrays ved hjælp af enten en microarray scanner eller omvendt fluorescerende mikroskop equipped med en robot fase. Microarray scannere giver hurtigere udlæsning men kan kræve Cy3- eller Cy5-kompatible fluorophorer og er ofte af begrænset opløsning på rækkefølgen af enkelte celler (dvs. 1 - 10 pm). Fluorescerende mikroskoper giver mulighed for at bruge en bred vifte af fluorescerende kanaler og højere opløsning (<1 um, ~ 100 × total forstørrelse) men giver langsommere udlæsning afhængigt af kvaliteten af ​​den robot scenen og forstørrelse / mål.
    11. Gem fangede billeder af hele arrays fra begge metoder som TIFF-filer for at forhindre datakomprimering eller tab forbundet med andre filformater (f.eks JPG).
  5. Mulighed 2: Udfør levende evaluering af celle-substrat interaktioner ved hjælp TFM.
    1. Der fremstilles en opløsning af 1% volumen / volumen bovint serumalbumin (BSA) og 1% v / v natriumdodecylsulfat (SDS) i PBS til dissociere celler fra substrater under TFM.
    2. Flyt 35 mm petriskåle indeholdende Array kultureren inkuberet (37 ° C, 5% CO2), inverteret fluorescensmikroskop med en robot fase for TFM målinger.
      1. I en skål, markere positioner (X-koordinat, Y-koordinat) og fokusere fly (Z-koordinat) af individuelle celle øer ved hjælp af fasekontrast mikroskopi.
      2. Skift til langt rødt fluorescerende mikroskopi at visualisere perlerne. Vende tilbage til hver af positionerne, der er gemt i det foregående trin og korrigere Z-koordinaten for fokus plan, således at kun det første lag af perler under cellens øen er i fokus. Gem de nye koordinater og gå videre til automatiseret billeddannelse af alle celle øer til at fange pre-dissociation fasekontrast og langt rødt fluorescerende billeder.
    3. Derefter tilsættes forsigtigt 150 pi BSA / SDS-opløsning i skålen og vent 5 min for at tillade fuldstændig celle dissociation fra substrat; overvåge celledissociering hjælp fasekontrastmikroskopi.
    4. Efter celle øer er blevet adskilt fra substratet, vende tilbage til tHan markerede positioner, og kontrollere, at det første lag af perler er stadig i fokus. Hvis disse perler er ude af plan som følge af deformation fremkaldt af celle-genereret trækkraft, og derefter korrigere Z-koordinaten for fokusplanet så de er igen i fokus. Gem de korrigerede Z-koordinaterne og gentag automatiseret billeddannelse af alle øer at fange post-dissociation langt rødt fluorescerende billeder.
    5. Gentag trin 3.5.1 - 3.5.4 for de resterende retter.

4. Analyse af data

  1. Analyse af immunofluorescens data.
    1. Proces erhvervet array-billeder. Split sammensatte array-billeder i filer, der indeholder individuelle kanaler (dvs. røde, blå eller grønne), og konvertere til 8-bit TIFF-billeder 43, 44. Påfør binning (f.eks 2 × 2 eller 4 × 4) for at reducere billedstørrelsen til ~ 32 megapixels per kanal for at reducere hukommelse krav under nedstrøms encellede analyse af entire array-billeder. Se Supplerende Code File titlen "array_processing.ijm" for en ImageJ makro gennemførelse af disse kildebehandling trin.
    2. Bemærk koordinaterne i pixels øverst til venstre, nederst til venstre, og nederste højre rhodamin-konjugeret dextran markører eller opstillede betingelser. Brug disse koordinater til at rotere 8-bit TIFF-billeder til at være helt lodret og senere at anmærke output fra encellede analyse med specifikke opstillede betingelser. Se supplerende kode Files titlen "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", og "array_gridding.ijm" for implementeringer af disse vifte roterende og klods trin.
    3. Udfør encellede analyse af arkiveret lodret, roteres 8-bit TIFF-billeder i CellProfiler (version 2.1.1) 45 under anvendelse af følgende moduler: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects, og MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects identificerer kerner, IdentifySecondaryObjects identificerer immunolabels forbundet med hver cellekernen, og MeasureObjectIntensity giver kvantificeringer til både nukleare etiketter og immunolabels.
      1. Output encellede data fra alle tre moduler som en CSV-fil ved kanal ved hjælp af ExportToSpreadsheet modulet for at lette senere nedstrøms analyse. Se supplerende kode Files titlen "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", og "rgb_array_image_analysis.cppipe" for CellProfiler rørledninger gennemfører disse trin for billedsæt, der indeholder røde, grønne eller blå kanaler.
    4. At omdanne data til tegner sig for eksperimentel variation og ikke-Gauss encellede distributioner, anvende fraktil normalisering af biologisk replikere 46. Denne proces genererer en fælles fordeling på tværs gentagelser og muliggør upartiske sammenligninger af ændringer i immunolabel intensitet. Endvidere Ubegrike Z-scoring og andre parametriske metoder, fraktil normalisering er ikke-parametrisk og påtager sig ikke en bestemt distribution af data, der giver mulighed for mere repræsentative analyser af enkelt-celle adfærd som en funktion af klædt tilstand.
    5. Plot data og fortolke. Afhængigt af det biologiske system og hypotese, beregne og plotte en eller flere af følgende ensemble foranstaltninger for hver opstillet tilstand:
      1. Beregne og plotte celler pr ø som en kombineret måling af adhæsion og overlevelse i løbet af forsøget.
      2. Beregn og plot fraktil-normaliseret immunolabel intensitet som et mål for celle skæbne eller funktion.
      3. Beregne og plotte procentdelen af ​​celler positive for en immunolabel som bestemt ved intensitet over en konsistent tærskel, sædvanligvis 2 sd over middelværdien intensiteten af ​​en negativ kontrol.
      4. Alternativt til plot fordelinger af immunolabel intensitet for at undersøge og kategorisere encellede adfærdsom en funktion af klædt tilstand. Disse fordelinger kan yderligere karakteriseres ved hjælp af målinger af centrale tendens (middelværdi, median, mode) og variation (varians, variationskoefficient, Fano faktor) og hypotese testmetoder såsom Kolmogorov-Smirnov test.
  2. Analyse af TFM data. Her beskrives en tilgang, der omfatter en tidligere udviklet algoritme af Butler et al. og Wang et al. 40, 47.
    1. Brug ImageJ til batch konvertere billederne til 8-bit TIFF-filer. Påfør pixel-gennemsnit binning (f.eks 2 × 2) for at reducere den beregningsmæssige omkostninger og tid for downstream analyse. Som algoritmer til TFM har hovedsagelig drejede sig om enkelt-celle analyse, den store celle-substrat-grænsefladen af øerne (~ 17,5 x 10 3 um 2) i sammenligning med celle-substrat-grænsefladen af en enkelt celle (75 um 2) fornødenhedertates den binning trin.
    2. Input den erobrede fase kontrast og langt rødt fluorescerende billeder (både før dissociation og post-dissociation) i en videnskabelig programmeringsmiljø såsom MATLAB og proces ved hjælp af de tidligere udviklede algoritmer af Butler et al. og Wang et al. 40, 47.
      1. Vælg tre regioner fjernt fra cellen øen. Disse regioner anvendes til at tage højde for forskydninger på grund af billede eller prøve afdrift.
      2. Give den faktor konverteres fra pixel til mikrometer (fx 0,454 pixels / um), Youngs modul af substratet (f.eks 13 kPa) og Poissons forhold (f.eks, 0,48 for polyacrylamidgeler beskrevet her).
      3. For hver ø, tegne en afgrænsning omkring periferien til at definere de geometriske begrænsninger; alle kræfter uden for denne grænse er nulstillet. Denne begrænsede system er rimelig i betragtning af det store distance (dvs. 450 um) mellem øerne.
    3. Beregn roden middelværdi firkantet trækkraft stress og kontraktile øjeblik for hver ø. Den kontraktile øjeblik er et mål for den resterende stress over cellen ø og har vist sig at afspejle styrken af celle-celle-vekselvirkninger 48. For hver klædt tilstand, gennemsnitlige rod middelværdi firkantede værdier over flere øer og biologiske gentagelser og beregne tilhørende varians for hypotese test. Det er også muligt at gennemsnit fordelingen af spændinger eller momenter over mange øer at give et repræsentativt kort over begge foranstaltninger som funktion af geometrien, fx, afstand fra centrum af øen.

Representative Results

Brug af denne platform, undersøgte vi den rolle, både biokemiske og biofysiske stikord i skæbne specifikation af lever progenitorer 34, 35. Protein A / G-konjugeret Notch-ligander viste forbedret retention og klyngedannelse i polyacrylamid hydrogel (figur 3A) og var desuden i stand til at drive differentiering af lever progenitorer mod en galdegang celleskæbne (figur 3B). Anvendes enkelt-celle analyse, vi kvantificeret reaktionen på kærven ligander for ECM-proteiner collagen I, collagen III, collagen IV, fibronektin og laminin (figur 3C), fastslog, at reaktionen af leveren progenitorer til liganden afhænger også af den ECM sammenhæng. Sidst, vi udnyttet shRNA knockdown at generere lever progenitorer uden liganderne Dll1 og Jag1. Reaktionen på klædt Notch ligand varierede afhængigt af PResence af enten liganden, hvilket bekræfter, at reaktionen på celle-extrinsiske ligand er også en funktion af cellen-intrinsic ligand ekspression (figur 3D). Endvidere observerede vi en tydelig underpopulation af dobbelt-positive (ALB + / OPN +) celler i Dll1 knockdown (figur 3D). Tilsammen udgør disse repræsentative resultater viser: (1) de kombinatoriske evner array format, som eksemplificeret ved parring af multiple klædt ECM-proteiner og Notch-ligander med knockdown af individuelle ligander; (2) funktionaliteten af ​​ikke kun opstillet ECM-proteiner, men også opstillet celle-celle-ligand via protein A / G-medieret konjugering; og (3) gennemførelsen af ​​vores single-celle analyse og dens evne til at skelne unikke subpopulationer.

Vi observerede også, at differentieringen af leveren progenitorer er afhængig af både substratet stivhed og ECM sammensætning (figur 4A ong>), specifikt at finde, at kollagen IV støtter differentiering på både bløde og stive substrater mens fibronektin understøtter kun differentiering på stive substrater (figur 4B). Repræsentative varme kort over TFM målinger antydede, at vedvarende trækkraft stress ved lav substrat stivhed på kollagen IV fremmet differentiering i galde rørledning celler (figur 4C), en konstatering bekræftes af gennemsnitlige rod-middelværdier-square værdier (Figur 4D). Tilsammen udgør disse repræsentative resultater viser: (1) en vellykket integration af TFM med celle microarrays på substrater med en justerbar stivhed til at vurdere både celle fænotype og trækkraft stress; (2) koordination af leveren progenitorcelle skæbne med både matrixkompositionen og substratet stivhed; og (3) gennemførelsen af ​​vores TFM analyse og typiske trækkraft stress profiler i celle microarrays.

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversigt Skematisk Viser de første tre Eksperimentelle Sektioner. I afsnit 1, er glassubstrater rengøres og silaniseret at lette fremstillingen af ​​polyacrylamid hydrogeler. I afsnit 2 er biomolekylære kombinationer af interesse udarbejdet i en 384-brønd kilde mikroplade. En robot arrayer derefter fyldt med rene nåle, kilden mikroplade, og polyacrylamid hydrogeler og initialiseret, opdigte arrays på hydrogelerne. I afsnit 3 podes celler på de grupperede domæner og får lov til at klæbe, hvorefter kulturen protokollen af ​​interesse udføres. På endpoint, cellerne enten fastsættes for immuncytokemi / immunofluorescens eller analyseret med TFM. Scale barer er 75 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

inden-side = "1"> Figur 2
Figur 2: Behandling og analyse af Immunofluorescens data fra Arrays. (A) Flise-, komposit 32-bit RGB-billeder først arkiveret lodret og derefter opdelt i individuelle 8-bit-kanaler. Ved hjælp af en kombination af grupperede fluorescerende markører og celle øer, er tre hjørner af grupperingen identificeret til at muliggøre automatiseret orientering og klods af grupperingerne. (B) encellede data genereres for hver kanal af input arrays. For at tage højde for eksperimentel drift, er fraktil normalisering anvendes af biologisk gentagelse, der producerer en enkelt delt fordeling på tværs af alle gentagelser. Fraktil normaliseret data efterfølgende plottet og fortolkes via beregning af ensemble-målinger (fx celler / ø, betyder intensitet, procentvise celler er positive for en etiket) eller direkte analyse af encellede distributioner.m / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Notch ligand Præsentation formidler Lever progenitorceller Differentiering. (A) Fc-rekombinant Notch ligander Jagged-1 (JAG1) og Delta-lignende 1 (DLL1) udstillet forbedret fastholdelse og klyngedannelse, når klædt med protein A / G. Scale bar er 50 um. (B) Lever progenitorer differentieret i galde rørledning celler mod forevisning med Notch ligand. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) er et nukleart etiket, albumin (ALB) er en hepatisk celle markør, og osteopontin (OPN) er et galdegang cellemarkør. Scale bar er 150 um. (C) Kvantificering af procentdelen af celler positive for OPN for Notch-ligander JAG1, DLL1, og Delta-lignende 4 (DLL4) på ECM-proteiner kollagen I, collagen III, collagen IV, fibronektin og laminin. Students t -tests blev udført mod kontrol IgG for hvert array Notch-ligand inden for hver ECM protein med P-værdier indikeret for P <0,05 (*). (D) Imaging cytometri af ALB og OPN for celler på kollagen III præsenteret med Notch ligander JAG1, DLL1, og DLL4. Lever progenitorer uden Notch ligander Dll1 og Jag1 (dvs. shDll1 og shJag1) blev dannet ved anvendelse shRNA knockdown. Data i (C) præsenteres som gennemsnit ± sem Dette tal har været ændret siden Kaylan et al. 34. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Matrix Sammensætning og Substrat Stivhed Coordinate Lever progenitorceller Differentiering. (A) Lever progenitor differentiering til galdegangsceller er afhængig af både ECM sammensætning og substrat stivhed. DAPI er en nuklear etiket, ALB er en hepatisk celle markør, og OPN er en galdegang cellemarkør. (B) Kvantificering af procentdelen af celler positive for OPN på substrater af Youngs modul 30 kPa, 13 kPa, og 4 kPa for collagen I (C1), collagen IV (C4), fibronektin (FN), og alle tovejskombinationer af disse ECM-proteiner. (C) Cell trækkraft stress er afhængig af både substrat stivhed og ECM sammensætning. (D) Kvantificering af root middelværdi square værdier af trækkraft stress på substrater af Youngs modul 30 kPa og 4 kPa for collagen I (C1), collagen IV (C4), fibronectin (FN), og alle tovejs kombinationer af disse ECM-proteiner. I (B) og (D) blev data præsenteret som middelværdi ± SEM og Students t -testsblev udført mod 30 kPa for hvert ECM kombination med P-værdier indikeret for P <0,05 (*), P <0,01 (**) og P <0,001 (***). Scale barer er 50 um. Dette tal har været ændret siden Kourouklis et al. 35. Klik her for at se en større version af dette tal.

Afsnit Problem Potentielle årsager Løsning
1. Fremstilling af Polyacrylamide substrat. Dækglas kan ikke fjernes fra hydrogel. Overpolymerization. Reducere polymerisation tid til <10 minutter (4 W / m2). Kontroller, at UV crosslinker output er inden forventet interval.
Dårlig polyacrylamid hydrogel polymerisation. Underpolymerization. Øge polymerisation tid til> 10 minutter (4 W / m2). Kontroller at UV tværbinder output er inden forventet interval.
Polyacrylamid-hydrogeler er beskadiget efter fjernelse af dækglas. Bløde polyacrylamid hydrogeler er nemme at skade. Vi observerer faldende hydrogel fabrikation udbytte (~ 50%) for den blødeste (dvs. 4 kPa) hydrogeler i særdeleshed. Håndtag hydrogeler blidt og øge startnumre til at nå det ønskede udbytte.
2. Fabrikation af Arrays. Dårlig eller inkonsekvent spot morfologi. Inkonsekvent luftfugter funktion. Kontroller at luftfugter og rheometer en funktionel hele hver oplag og fastholde 65% relativ luftfugtighed.
Pins fast i printhovedet eller træskoGed. Rens skrivehovedet for at tillade fri pin bevægelse. Rengør stifter grundigt før eller efter hver oplaget at fjerne aggregater fra pin-kanaler.
3. Cell Culture og Assay Execution. Cellefrigørelse eller død på arrays efter indledende vedhæftet fil. Eftersåning og overdreven proliferation. Reducer indledende seeding tæthed og tid. Brug "vedligeholdelse" eller "differentiering" medier under vifte kultur for at reducere celleproliferation.
Frigivelse af giftige acrylamid monomer fra hydrogel. Soak hydrogeler i dH 2 O i mindst 3 d at give mulighed for diffusion / frigivelse af acrylamid monomer og reducere celle toksicitet.
Celler ikke tillægger arrays. Underseeding. Øg indledende seeding tæthed og tid. Brug en stærkere klæbende celletype.
Dårlig aflejring afmatrix eller biomolekyle tilstand. Rene stifter af partikler og aggregater, bekræfter udskrivning parametre, og evaluere spotting af fluorescerende markører, fx rhodamin-konjugeret dextran.
Specificitet af celle-matrix interaktioner. Forskellige celletyper klæber specifikt til nogle, men ikke andre ECM-proteiner. Teste flere forskellige ECM-proteiner med dine celler.
Suboptimal vifte opbevaring efter fabrikation. Vi anbefaler lagring fabrikerede arrays natten over ved 65% RH og stuetemperatur, dels at undgå faseændringer under frysning. Celleadhæsion er følsom over for både fugtighed, temperatur og lagringstid; sørge for disse parametre er konsekvente / optimeret til dine eksperimenter.
Frigørelse af hydrogel fra glassubstratet under celledyrkning. Dårlig slide rengøring og silanisering. Udskift arbejder løsninger til slide rengøring ogsilanisering.
Overdehydrated hydrogel. Lad ikke hydrogeler dehydrerende på en varmeplade i mere end 15-30 min.
4. Analyse af data. Høj variation mellem replikere pletter og dias. Variation i matrix fabrikation. Kontroller at stifter og skrivehovedet er rene. Bekræft luftfugter funktion. Visualiser og kvantificere spot og array kvalitet ved hjælp af fluorescerende markører. Opbevar arrays som anbefalet ovenfor.

Tabel 1: Fejlfinding.

Discussion

I vores eksperimenter har vi fundet, at de mest almindelige fejl er relateret til kvaliteten af ​​jern- arrays og dårligt karakteriseret respons i det biologiske system af interesse. Vi henviser læseren til tabel 1 for fælles svigt celle microarray eksperimenter og tilhørende fejlfindingstrin. Vedrørende kvaliteten af ​​arrays i særdeleshed, anbefaler vi følgende. Bekræft teknisk kvalitet og soliditet gruppere programmer, parametre og buffere hjælp fluorescensmærkede molekyler såsom rhodamin-konjugeret dextran. Grundigt rene stifter enten før eller efter at gruppere pr producentens anvisninger og yderligere visuelt kontrollere, at pin-kanaler er fri for snavs ved hjælp af et lysmikroskop. Bekræft array biomolekyle fastholdelse ved hjælp af generelle protein pletter eller immunolabeling. Bemærk, at biomolekyler med en molekylvægt under 70 kDa ofte ikke tilbageholdes i hydrogelen 23, sup> 31. Validere array biomolekyle celle-funktionalitet ved hjælp af flere celletyper. Bemærk, at kun adhærente celler er forenelige med arrays; derudover, adhæsion til arrays er afhængig både celle-specifikke egenskaber (fx integrin ekspression profil) og de udvalgte ECM-proteiner.

På grund af begrænset plads, har vi ikke givet en omfattende behandling af array design, layout og fabrikation her og henvise læseren til forrige værker 23, 25. Vi bruger generelt 100 spot subarrays (150 um spot diameter, 450 um center-til-center afstand) sammensat af 10-20 unikke biomolekylære betingelser (dvs. 5-10 pletter / tilstand). Antallet af subarrays i ét array varierer afhængigt af antallet af biomolekylære betingelser af interesse, som kan være komfortabelt opskaleres til 1.280 på en 25 x 75 mm mikroskopobjektglas (~ 6.400 pletter i 64 subarrays)xref "> 25, 31 Parametrene ovenfor vil yderligere variere afhængigt af mønstret størrelse af interesse;. pins stand til at generere mønstre på 75 - 450 um er let tilgængelige.

Array eksperimenter er bedst suppleret med validering af høj scoring opstillede betingelser af interesse ved hjælp af andre kultur-formater, assay udlæsninger og biologiske modelsystemer. Konkret anbefaler vi yderligere validering effekter af udvalgte opstillede betingelser ved hjælp bulk-kulturer i forbindelse med standard molekylærbiologiske teknikker (f.eks QRT-PCR, immunoblotting) eller standard TFM. Genetisk manipulation (f.eks knockdown eller overekspression) af faktoren af interesse i et givet biologisk modelsystem kan også bekræfte, effekter observeret i arrays. In vivo dyremodeller repræsenterer et andet middel til validering og blev for nylig brugt, for eksempel til at bekræfte den centrale rolle, galectin-3 og galectin-8 ilungekræft metastatisk niche, som oprindeligt identificeret via celle microarray 31, 49.

En række andre fremgangsmåder er blevet anvendt til at probe microenvironmental regulering af cellulære funktioner, herunder en række to-dimensionale mikrofabrikerede systemer 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 og de tredimensionelle manipulerede biomateriale systemer 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I sammenligning med andre metoder, de særlige fordele ved den celle microarray platform beskrevet her består af: (1) kapacitet Op tilhundredvis eller tusindvis af forskellige kombinationer af faktorer, der gør det muligt analyse af interaktion effekter; (2) tilgængelige, automatiseret billedbehandling og analyse; (3) integration af både biokemiske og biofysiske udlæsninger med kontrolleret præsentation af grupperede faktorer; (4) evne til at variere substrat materialeegenskaber; og (5) med højt indhold encellede analyse af celle skæbne og funktion.

Sammenfattende kombinationen af ​​celle- microarrays med TFM på substrater af afstemmelig substrat stivhed muliggør grundig karakterisering af både biokemiske og biofysiske signaler. Som præsenteres her, denne platform er generaliseres og kan let anvendes til en række af adhærente celletyper og væv sammenhænge i retning af en bedre forståelse af kombinatorisk microenvironmental regulering af celledifferentiering og mechanotransduction.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender Austin Cyphersmith og Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institut for Genomic Biologi, University of Illinois i Urbana-Champaign) for at få hjælp med mikroskopi og for generøst imødekommende skærm og videooptagelse på mikroskopi kerne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. , Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).

Tags

Bioengineering tissue engineering biomaterialer biomekanik mikromiljø celle mikroarrays stængel og stamfader cellebiologi
En High-throughput Cell Microarray Platform for korrelative Analyse af Cell Differentiering og Traction Forces
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P.,… More

Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces. J. Vis. Exp. (121), e55362, doi:10.3791/55362 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter