Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En hög kapacitet Cell microarray plattform för Korrelat analys av celldifferentiering och dragkrafter

doi: 10.3791/55362 Published: March 1, 2017

Summary

Celldifferentiering är reglerad av en mängd microenvironmental faktorer, bland annat båda matriskomposition och substratmaterialegenskaper. Vi beskriver här en teknik som utnyttjar cellarrayer jämförd med dragkraft mikroskopi för att utvärdera både celldifferentiering och biomekaniska cell-substratinteraktioner som en funktion av microenvironmental sammanhang.

Abstract

Mikrofabricerade cell mikroarrayer, som består av kontakt tryckta kombinationer av biomolekyler på ett elastiskt hydrogel yta, ger en hårt kontrollerad, hög genomströmning konstruerad system för att mäta effekten av ordnade biokemiska signaler på celldifferentiering. Nya ansträngningar använder cellarrayer har visat sin användbarhet för kombistudier där många microenvironmental faktorer presenteras parallellt. Emellertid har dessa ansträngningar främst fokuserat på att undersöka effekterna av biokemiska signaler på cellsvar. Här presenterar vi en cell microarray plattform med avstämbara materialegenskaper för att utvärdera både celldifferentiering genom immunofluorescens och biomekanisk cellsubstratinteraktioner genom dragkraft mikroskopi. För att göra detta, har vi utvecklat två olika format som använder polyakrylamid hydrogeler med varierande Youngs modul tillverkas på antingen objektglas eller glasbottnade petriskålar. Vi tillhandahåller best metoder och felsökning för tillverkning av microarrays på dessa hydrogel substrat, den efterföljande cellodling på mikroarrayer, och förvärvet av data. Denna plattform är väl lämpad för användning i undersökningar av biologiska processer där både biokemiska (t.ex. extracellulära matriskomposition) och biofysikalisk (t.ex. substrat styvhet) kan ledtrådar spela betydande korsande roller.

Introduction

Interaktioner mellan celler och omgivande microenvironmental faktorer förmedlar en stor mängd biologiska processer i hela utveckling, homeostas och sjukdom patogenes 1, 2, 3, 4. Dessa microenvironmental interaktioner omfattar leverans av lösliga faktorer till celler, cellmatris bindning, och cell-cell-interaktioner via ligand-receptorbindning. Förutom de ovan nämnda biokemiska överväganden biofysiska parametrar, såsom substrat mekaniska egenskaper (t.ex., Youngs modul, porositet) och cellform, och de associerade nedströms mechanotransduction har alltmer vunnit erkännande som viktiga mediatorer av celldifferentiering 5, 6, 7, 8, 9 10. Signaler till följd av dessa microenvironmental interaktioner tjänar som insignaler till gennätverk och signalvägar. Dessutom är dessa cell inneboende komponenterna ger också återkoppling till mikromiljön via utsöndrade faktorer och matrisnedbrytande enzymer, som kompletterar en komplex samreglerande slinga mellan cell inneboende genetiska program och cell-extrinsic microenvironmental faktorer 5, 11, 12.

Användning av konstruerade system för den kontrollerade presentation av microenvironmental faktorer har visat sig vara användbara i en rad olika sammanhang 13, 14, 15. Mikrofabricerade system i synnerhet har underlättat exakt rumslig mönstring av proteiner och celler samt mycket parallelliserad analys via miniatyrisering 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cellarrayer representerar en sådan mikrofabricerade system där kombinationer av biomolekyler är kontakt tryckt på en elastisk polyakrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Införandet av cell lim komponenter (nämligen matrixproteiner) möjliggör varaktig celladhesion och kultur på mikroarrayer, som ofta följs av nedströms analys via immunocytokemi och fluorescerande reportrar. Cellarrayer har produktivt inriktad uppnå en ökad förståelse av lever cellfenotyp 23, 26, neurala föregångare differentiering 27, mammary stamfader öde beslut 28, embryonala stamceller underhåll / differentiering 23, 29, 30, lungcancer metastaser 31 och terapeutiskt svar i melanom 32. Vi har nyligen visat att användningen av cellarrayer för definitionen av extracellulär matrix (ECM) proteinkomposition i endoderm specifikation 33, lever progenitor differentiering 34, 35, och lungtumörcellläkemedelssvar 36. I dessa verk, har vi fokuserat på att utvidga kombi funktionerna i uppsättningen plattformen och utforska korsningar av cell inneboende signalering med extracellulära matriskomposition och biomekanik. Dessutom har vi genomfört biofysikaliska avläsning i denna array plattform för att ge möjlighet att kvantitativt känneterize roll cellkontraktilitet i differentieringsprocesser 35. För att göra detta, integrerade vi dragkraft mikroskopi (TFM) med cellarrayer för att möjliggöra hög genomströmning bedömning av cell-genererade dragkraft. TFM är en allmänt används metod för att mäta cell genererade dragkrafter och har gett betydande insikter om samordning av encelliga och vävnadsnivå funktion med sammansättningen och biomekanik den lokala mikro 37, 38, 39, 40. Således kombinerar TFM med cellarrayer ger en hög genomströmning system för mätning av nyckel, fysiologiskt relevanta biofysiska parametrar.

Cellmicroarray plattform som beskrivs här består av fyra delar: tillverkning av polyakrylamid substrat, tillverkning av matriser, cellodling och analys avläsning och analys av data. SeFigur 1 för en schematisk sammanfattning av de tre första experimentella sektioner; se figur 2 för en schematisk sammanfattning av det sista avsnittet med fokus på analys av immunfluorescensdata. För att anpassa cellen microarray plattform för att studier av biomekaniska cellsubstratinteraktioner, använde vi polyakrylamid substrat av avstämbar Youngs modul men liknande porositet, per Wen et al. 41. Att göra det möjligt TFM mätningar av krafter som utövas av celler på deras substrat, genomförde vi en glasbottnad petriskål format utöver den tjocka glasobjektglas ofta utnyttjas av andra grupper. Således är denna cell microarray plattform kan parallella mätningar av celldifferentiering via immunofluorescens på objektglas och cellgenererade styrkor via TFM på separata glasbottnade rätter. Vi har också tillämpas flera förbättringar av analytisk metod som vanligen används med cellarrayer. Specifically, i stället för parametrisk Z-poäng av totalt ö intensitet, mäter vi encelliga intensitet och tillämpa -kvantilen normalisering för att ta hänsyn till icke-normala fördelningar och mer exakt beskriva cellulära beteende. Vi anser att dessa förbättringar ge särskild användbarhet mot undersökningar av biologiska processer där både biokemiska och biofysiska signaler spelar betydande, korsande roller. Vidare våra analys förbättringar möjliggör tillämpningen av cellarrayer studier av en rad cellulära funktioner som encelliga och populationsnivå beteende avviker.

Protocol

1. Tillverkning av polyakrylamid Substrat

  1. Rengör glassubstrat - antingen standard objektglas för endpoint immunofluorescens eller glasbotten 35 mm petriskålar för TFM - för att säkerställa optimal polyakrylamid hydrogel tillverkning och integritet under cellodling. Alternativt användning förrenglassubstrat.
    1. Doppa glassubstrat i 0,25% volym / volym Triton X-100 i destillerat vatten (dH 2 O). Placera substrat på en orbitalskak under 30 minuter.
    2. Avlägsna Triton X-100-lösning och skölj substrat 5 gånger med dH2O Lämna substrat nedsänkta i den slutliga sköljningen och placera på en orbital shaker i 30 min.
    3. Ta bort dH 2 O och fördjupa substrat i aceton. Placera substrat på en orbitalskak under 30 minuter.
    4. Ta bort aceton och fördjupa substrat i metanol. Placera substrat på en orbitalskak under 30 minuter.
    5. Avlägsnande av metanol och skölj substrat 5 gånger med dH <sub> 2 O. doppa substrat i 0,05 N NaOH och plats på en orbital skakanordning under 1 h.
      VARNING: NaOH är starkt frätande och kan orsaka allvarliga frätskador på hud och ögon. Skyddshandskar, kläder och skyddsglasögon.
    6. Ta bort NaOH-lösning och skölj substrat 5 gånger med dH 2 O. Använd filtrerad tryckluft för att torka substraten och grädda vid 110 ° C på en varm platta tills den är torr (5-15 min). Rengjorda substrat kan lagras vid rumstemperatur under obegränsad tid.
  2. Silaniseras rena glassubstrat för att säkerställa fastsättningen av polyakrylamid hydrogel.
    1. Doppa rena glassubstrat i nyframställd 2% volym / volym 3- (trimetoxisilyl) propylmetakrylat (3-TPM) i etanol. Placera substrat på en orbitalskak under 30 minuter.
      VARNING: 3-TPM är en brännbar vätska. Hålla sig borta från värme, gnistor, öppen eld och heta ytor och användas endast i dragskåp.
    2. Ta bort 3-TPM-lösning och fördjupa substrat i EthaNol. Placera substrat på en skakapparat under 5 minuter.
    3. Använda filtrerad tryckluft för att torka substraten och grädda vid 110 ° C på en varm platta tills den är torr (5-15 min). Silaniserade substrat kan lagras vid rumstemperatur under upp till en månad.
  3. Alternativ 1: Tillverka polyakrylamid hydrogeler på silaniserade objektglas för endpoint immunofluorescens.
    1. Förbered en pre-polymerlösning i dH 2 O med önskad akrylamid / bisakrylamid procent (w / v) förhållandet att tillverka substrat med Youngs moduler av 4 kPa (4% akrylamid, 0,4% bisakrylamid), 13 kPa (6% akrylamid, 0,45 % bisakrylamid), eller 30 kPa (8% akrylamid, 0,55% bisakrylamid) och liknande porositet, per Wen et al. 41. Vortex lösningen tills klar och filter med en 0,2 ìm spruta. Pre-polymerlösningar kan förvaras vid 4 ° C under 3 månader.
      VARNING: Exponering för akrylamid eller bisakrylamid kan leda till akut toxicitet, neurotoxicity och irritation. Skyddshandskar, kläder och skyddsglasögon.
    2. Bered en fotoinitiator lösning av 20% vikt / volym Irgacure 2959 i metanol. Denna fotoinitiator lösning kan inte lagras och måste beredas på nytt varje gång.
    3. Blanda pre-polymer och fotoinitiatorsystem lösningar i en 9: 1 (pre-polymer: fotoinitiator) förhållande. Eventuellt degas med en vakuumkammare under 15 minuter för avlägsnande av bubblor.
    4. Placera silaniserade objektglas i en glastorknings fack och pipettera 100 mikroliter av 9: 1 pre-polymer: fotoinitiator lösningen på varje objektglas. täcka försiktigt varje bild med en 22 x 60 mm täck samtidigt som man undviker att skapa bubblor. Notera att täckglaset förhindrar inhibering av polymerisationsreaktionen genom syre.
    5. Plats torkbricka i en UV-tvärbindningsmedel och utsätta glasen till 365 nm UV-A under 10 min (4 W / m 2). Optimera polymerisationstiden behov. Längre exponeringar risk svårt att ta bort täck grund av overpolymerization. Kortare exponeringar risk underpolymerization och låg hydrogel stabilitet.
    6. Doppa hydrogeler i dH 2 O under 5 minuter. Ta bort täck med en rakkniv, noga med att inte skada polymeriserade hydrogel.
    7. Lämna hydrogeler i dH 2 O vid rumstemperatur i 1-3 d, ändra dH 2 O dagligen. Torka hydrogeler vid 50 ° C på en het platta tills den är torr (15-30 min) och förvara vid rumstemperatur under upp till 3 månader.
  4. Alternativ 2: Tillverka fluorescerande pärla innehållande polyakrylamid hydrogeler på silaniserade 35 mm glasbottnade petriskålar för levande utvärdering av cellsubstratinteraktioner med hjälp av TFM.
    1. Sonikera en stamlösning av 1 | j, m fluorescerande pärlor under 15 min för att dispergera aggregat.
    2. Förbered en pre-polymerlösning i dH 2 O med önskad akrylamid / bisakrylamid procent (w / v) förhållandet att tillverka substrat med Youngs moduler av 4 kPa (4% akrylamid, 0,4% bisakrylamid), 13 kPa (6% akrylamid, 00,45% bisakrylamid), eller 30 kPa (8% akrylamid, 0,55% bisakrylamid) och liknande porositet, per Wen et al. 41. Vortex lösningen tills klar och filter med en 0,2 ìm spruta. Pre-polymerlösningar kan förvaras vid 4 ° C under 3 månader.
      VARNING: Exponering för akrylamid eller bisakrylamid kan leda till akut toxicitet, neuro och irritation. Skyddshandskar, kläder och skyddsglasögon.
    3. Lägg fluorescerande pärlor till pre-polymerlösning vid en slutlig koncentration av 0,2% volym / volym och vortexa att blanda.
    4. Bered en fotoinitiator lösning av 20% vikt / volym Irgacure 2959 i metanol. Denna fotoinitiator lösning kan inte lagras och måste beredas på nytt varje gång.
    5. Blanda pre-polymer / pärla och fotoinitiatorsystem lösningar i en 9: 1 (pre-polymer / kula: fotoinitiator) förhållande. Eventuellt degas med en vakuumkammare under 15 minuter för avlägsnande av bubblor.
    6. Placera silaniserade 35 mm glasbottnade petriskålar i ett glas torkning fack och pIpet 20 mikroliter av 9: 1 pre-polymer / pärla: fotoinitiator lösning på mitten av varje maträtt. Försiktigt täcka varje bild med en 12 mm cirkulär täck samtidigt som man undviker att skapa bubblor. Notera att täckglaset förhindrar inhibering av polymerisationsreaktionen genom syre.
    7. För att fördela de fluorescerande pärlor på ytan av hydrogel, invertera disken och låt stå i rumstemperatur i 20 minuter, per Knoll et al. 42.
    8. Medan fortfarande inverterad, utsätta rätter till 365 nm UV-A under 10 min (4 W / m 2). Optimera polymerisationstiden behov. Längre exponeringar risk svårt att ta bort täck grund av overpolymerization. Kortare exponeringar risk underpolymerization och låg hydrogel stabilitet.
    9. Fördjupa hydrogeler i 0,1 M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffert och låt stå i rumstemperatur i mörker över natten. Ta bort täck försiktigt med ett rakblad, noga med att inte skada polymetecknat hydrogeler.
    10. Dehydratisera hydrogeler vid 50 ° C på en värmeplatta tills den är torr (15-30 min). Hydrogeler kan förvaras vid rumstemperatur i mörker under 3 månader.

2. Tillverkning av matriser

  1. Förbered buffertar för att skriva ut biomolekyler. Använda utskriftsbufferten är lämplig för de biomolekyler av intresse. Tillväxtfaktor (GF) tryckbuffert är stort är lämpliga för andra klasser av molekyler, såsom cell-cell-ligander.
    1. För att framställa två × ECM-protein tryckbuffert, tillsätt 164 mg natriumacetat och 37,2 mg etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till 6 ml dH2O Vortex och inkubera vid 37 ° C för att solubiliseras ordentligt. Efter solubilisering, tillsätt 50 | il av förvärmda Triton X-100 och 4 ml glycerol. Vortex och inkubera vid 37 ° C igen för att lösa. Tillsätt 40 - 80 mikroliter isättika, titrering för att justera pH till 4,8. 2 × ECM-protein tryckbuffert kan lagras vid 4° C under en månad.
      VARNING: Ättiksyra är brandfarligt och frätande. Skyddshandskar, kläder och skyddsglasögon.
    2. För att framställa två × GF tryckbuffert, tillsätt 105,5 mg natriumacetat och 37,2 mg EDTA till 6 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Vortex och inkubera vid 37 ° C till solubiliseras ordentligt. Efter solubilisering, tillsätt 100 mg 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) och 4 ml glycerol. 2 × GF protein tryckbuffert kan lagras vid 4 ° C under en månad.
  2. Förbereda källplatta.
    1. I en 384-brunnars V-botten mikro, kombinera lika volymer av 2 × utskrift buffert med varje biomolekyl lösning på dubbla målkoncentrationen.
      ANMÄRKNING: En lämplig målkoncentration för de vanligaste ECM-proteiner är 250 | ig / ml medan målkoncentrationer för andra typer av grupperade faktorer varierar beroende på retention i hydrogelen och biologisk funktion. Den totala volymen i varje brunn kan varaså låg som 5 mikroliter och behöver inte vara mer än 15 mikroliter. I tillägg till biomolekylen kombinationer av intresse, inkluderar en klädd fluorescerande markör för att underlätta nedströms bildanalys. Använd rodamin-konjugerat dextran (2,5 mg / ml).
    2. Blanda varje brunn noggrant genom pipettering, noga med att inte skapa bubblor. Centrifugera källmikro under 1 minut vid 100 x g. Tillverka mikroarrayer använder källplattor framställda på samma dag och lagras vid 4 ° C tills microarray tillverkning.
  3. Rena stift enligt instruktionerna från tillverkaren före varje microarray tillverkning körning. Ladda rena stift direkt i skrivhuvudet för microarrayer.
  4. Förbered microarrayer och program med hjälp av tillverkarens programvara. Även om stegen nedan är delvis specifika för den speciella microarrayer som används här, är driften av de flesta microarrayers liknande.
    1. Slå på luftfuktare enheten, justera börvärdet till 65% RH (icke-condensing), och vänta tills reometern matchar den inställda punkten. Placera källplatta i lämplig adapter.
    2. Torka hydrogel substrat vid 50 ° C under 15 minuter och placera i en lämplig adapter. Den microarrayer har adaptrar för både objektglas och mikro. För ordnande 35 mm glasbottnade petriskålar, ladda disken i en 6-brunnsmikro och placera mikro i mikro adaptern på arrayer.
    3. Justera parametrarna i programmet för att spegla utformningen av källplattan, array design och önskat format (t.ex. objektglas eller mikro innehållande 35 mm petriskålar). Inkludera tvättsteg med både vatten och dimetylsulfoxid (DMSO) mellan varje tillstånd för att förhindra överföring och korskontaminering.
    4. Börja array tillverkning, kontroll inte mindre ofta än en gång i timmen att fuktigheten inte har sjunkit under 65% RH (icke-kondenserande) och att kontaktstiften inte är igensatta. Om Humifuktigheten har sjunkit oväntat, pausa grupperings att fylla luftfuktare och rensa tillhörande rör av kondens. Om stiften är tilltäppta, pausa grupperings att rengöra stift eller på annat sätt ersätta med förren stift. Observera att det är möjligt att array flera typer av biomolekyler i följd på samma substrat som tillräcklig torktid (dvs 4 h till över natten).
    5. När programmet är klart, placera tillverkade arrayer i ett bildspel låda eller mikro täckt med aluminiumfolie vid rumstemperatur och 65% relativ fuktighet (icke-kondenserande) över natten. Observera att det kan vara nödvändigt att utvärdera array kvalitet och lagring med hjälp av allmänna proteinfläckar eller immunofluorescens; se Brafman et al. för mer information 25.

3. Cell Culture och analys Avläsning

  1. Dagen efter tillverkning, placera anordnade substrat i 4 kammare rätter (objektglas) eller 6 mikrobrunnar (petriskålar) och fördjupa sig i ett%v / v penicillin / streptomycin i PBS; Använd 4 ml för diabilder och 3 ml för rätter. Utsättas för UV-C i 30 min. Utbyte penicillin / streptomycin lösning för cellodlingsmedia.
  2. Samla in och räkna celler. Seed på arrayer på 500 x Oktober 3-02 x 10 6 celler / array på 4 ml per objektglas och 3 ml per 35 mm petriskål. Inkubera array kulturer vid 37 ° C och 5% CO2 under 2-24 timmar eller tills bildningen av väl befolkade cell öar. Justera både sådd densitet och tid som behövs för dina celler och viss tillämpning. Underseeding (dvs låg densitet eller sådd tid) kan resultera i dålig array befolkning och skeva biologiska resultat. Overseeding (dvs hög densitet eller sådd tid) kan leda till minskad array integritet på grund av ön lossnar.
  3. Efter att för bildning av cell öar, tvätta array kulturer två gånger med förvärmda cellodlingsmedier; återigen använda 4 ml för diabilder och 3 ml för rätter. Optionally lägga lämpliga kontroller och behandlingar (t.ex., småmolekylinhibitorer, tillväxtfaktorer, etc.) av intresse för det biologiska systemet. Ändra media uppsättningarna varje 1-2 d för att hålla koncentrationen av eventuella behandlingar. Utvärdera cellmarkör uttryck och cellfunktion genom immunofluorescens eller cellsubstratinteraktioner av TFM inom 1-5 d initiera gruppkulturer - se Alternativ 1 och Alternativ 2 nedan.
  4. Alternativ 1: Utför slutpunkt immunofluorescens. Observera att immunofluorescens av vissa proteiner kan kräva strängare permeabilization användning av metanol, etanol, eller HCI. På grund av risken för att skada arrayer, utvärdera och optimera varje permeabilization protokollet innan användning i större skala experiment.
    1. Aspirera cellodlingsmedier från arrayobjektglas i 4-chambered rätter och tillsätt 4 ml / rutschbanan i nyberedd 4% volym / volym paraformaldehyd (PFA) i PBS. Inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
      VARNING: Exposure till PFA kan leda till akut toxicitet och kan också irritera eller fräta huden vid kontakt. Skyddshandskar, kläder och skyddsglasögon och använd endast i dragskåp.
    2. Aspirera PFA lösning och tvätta varje bild 3 gånger med 4 ml PBS. Vid denna punkt, kan fixerade glas lagras vid 4 ° C under en vecka. Det är tillrådligt dock att fortsätta genom immunmärkningen och montering på samma dag som fastställandet för att säkerställa array integritet.
    3. Aspirera PBS och tillsätt 4 ml / objektglas av 0,25% v / v Triton X-100 i PBS. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
    4. Aspirera Triton X-100-lösning och tvätta varje slid 3 gånger med 4 ml PBS. Lägg 4 ml / objektglas av 5% v / v serum matchas till den art av den sekundära antikroppen (t.ex., åsna serum för åsna sekundära antikroppar) i PBS och inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
    5. Noggrant bort den blockerande lösningen från varje bild. Tillsätt 500 | il / slide av primär antikropp utspädd i 5% volym / volym serum i PBS. Denna volym är tillräcklig för att täcka matriser för både 1 h inkubationer vid rumstemperatur såväl som över natten inkubationer vid 4 ° C.
    6. Tvätta varje uppsättning glid 3 gånger med 4 ml PBS. Grundligt bort den slutliga tvättningen och tillsätt 500 | il / slide av lämplig sekundär antikropp utspädd i 5% volym / volym serum i PBS.
    7. Tvätta varje uppsättning glid 3 gånger med 4 ml PBS. Tvätta snabbt med dH 2 O innan noggrant ta bort array diabilder från lösning med hjälp av pincett. Använd ett laboratorium vävnad att sugas eller torr resterande dH 2 O.
    8. Pipettera 100 mikroliter av monteringslösning med DAPI över bilden medan visuellt bekräftar fullständig täckning av hela gruppen.
    9. Placera en 22 x 60 mm täck över bilden för att montera. Försegla kanterna på täckglas med klart nagellack. Förvara i mörker vid 4 ° C tills avbildning, tidigast nästa dag.
    10. Bild hela arrayer med hjälp av antingen en microarray scanner eller inverterat fluorescensmikroskop equipped med en robot skede. Microarray skannrar ge snabbare avläsning men kan kräva Cy3- eller Cy5-kompatibla fluoroforer och är ofta av begränsad upplösning på order av enskilda celler (dvs 1-10 pm). Fluorescerande mikroskop ger möjlighet att använda en mängd olika fluorescerande kanaler och högre upplösning (<1 um, ~ 100 × total förstoring) men ger långsammare avläsning beroende på kvaliteten på robot scenen och förstoring / mål.
    11. Spara tagna bilder av hela matriser från båda metoderna som TIFF-filer för att förhindra datakomprimering eller förlust i samband med andra filformat (t.ex. JPG).
  5. Alternativ 2: Utför levande utvärdering av cellsubstratinteraktioner med hjälp av TFM.
    1. Bered en lösning av 1% volym / volym bovint serumalbumin (BSA) och 1% volym / volym natriumdodecylsulfat (SDS) i PBS för att dissociera cellerna från substrat under TFM.
    2. Flytta 35 mm petriskålar innehållande array kulturer atten inkuberades (37 ° C, 5% CO2), inverterad fluorescerande mikroskop med en robot scen för TFM mätningar.
      1. I en skål, markerar positioner (X-koordinat, Y-koordinat) och fokusera plan (Z-koordinat) av enskilda cell öar med hjälp av faskontrastmikroskopi.
      2. Växla till långt röd fluorescerande mikroskopi för att visualisera pärlorna. Återvända till varje av positionerna som sparats i det tidigare steget och korrigera Z-koordinaten för fokusplanet, så att endast det första skiktet av pärlor under cell ön är i fokus. Spara de nya koordinaterna och gå vidare till automatisk avbildning av alla cell öar att fånga pre-dissociation faskontrast och långt rött fluorescerande bilder.
    3. Tillsätt försiktigt 150 pl BSA / SDS-lösning till skålen och vänta 5 min för att medge fullständig cell dissociation från substratet; övervaka cell dissociation använder faskontrastmikroskopi.
    4. Efter cell öarna har skiljas från substratet tillbaka till tHan markerade positioner och kontrollera att det första lagret av pärlor är fortfarande i fokus. Om dessa pärlor är ut-ur-planet på grund av deformering inducerad av cellgenererade dragkraft, korrigera sedan Z-koordinaten för fokusplanet så att de är återigen i fokus. Spara korrigerade Z-koordinater och upprepa automatisk avbildning av alla öar för att fånga efter dissociation långt rött fluorescerande bilder.
    5. Upprepa steg 3.5.1 - 3.5.4 för de återstående rätter.

4. Analys av data

  1. Analys av immunfluorescensdata.
    1. Process förvärvade array bilder. Split array bilder sammansatta till filer som innehåller enskilda kanaler (dvs röda, blå eller gröna) och konvertera till 8-bitars TIFF-bilder 43, 44. Applicera binning (t.ex. 2 x 2 eller 4 x 4) för att minska bildstorleken till ~ 32 megapixlar per kanal för att minska minneskraven under nedströms encelliga analys av lockandere array bilder. Se Kompletterande kodfil titeln "array_processing.ijm" för en ImageJ makro genomförandet av dessa array processteg.
    2. Notera koordinaterna i pixlar i det övre vänstra, nedre vänstra och nedre högra rodamin-konjugerat dextran markörer eller klädd villkor. Använd dessa koordinater för att rotera 8-bitars TIFF-bilder för att vara helt vertikal och senare att kommentera utsignalen från encelliga analys med specifika klädd villkor. Se Supplemental Code Filer med titeln "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", och "array_gridding.ijm" för implementeringar av dessa array roterande och gridding steg.
    3. Utför encelliga analys av arkiveras, roteras 8-bitars TIFF-bilder i CellProfiler (version 2.1.1) 45 med följande moduler: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects och MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects identifierar kärnor, IdentifySecondaryObjects identifierar immunolabels samband med varje cellkärna, och MeasureObjectIntensity ger kvantifieringar för både kärn etiketter och immunolabels.
      1. Utgångs encelliga data från alla tre moduler som en CSV-fil genom kanalen med hjälp av ExportToSpreadsheet modulen för att underlätta senare nedströms analys. Se Kompletterande kodfiler titeln "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", och "rgb_array_image_analysis.cppipe" för CellProfiler rörledningar genomför dessa steg för bilduppsättningar som innehåller röda, gröna eller blå kanaler.
    4. Att omvandla data till svars för experimentell variabilitet och icke-gaussiska encelliga distributioner, tillämpa -kvantilen normalisering av biologiska replikat 46. Denna process genererar en delad distributions över replikat och möjliggör objektiva jämförelser av förändringar i immunolabel intensitet. Vidare Unlike Z-poäng och andra parametriska metoder, är -kvantilen normalisering icke-parametrisk och inte anta en viss distribution av data, vilket möjliggör mer representativa analyser av encelliga beteende som en funktion av klädd tillstånd.
    5. Rita uppgifter och tolka. Beroende på det biologiska systemet och hypotes, beräkna och plotta en eller flera av följande ensemble åtgärder för varje klädd tillstånd:
      1. Beräkna och plotta celler per ö som ett kombinerat mått på vidhäftning och överlevnad under loppet av experimentet.
      2. Beräkna och plotta kvantil-normaliserad immunolabel intensitet som ett mått på cellernas öde eller funktion.
      3. Beräkna och plotta procentandelen celler som var positiva för en immunolabel bestämd genom intensitet över en konsekvent tröskel, vanligtvis 2 SD över medelintensiteten av en negativ kontroll.
      4. Alternativt, för att plot fördelningar av immunolabel intensitet i syfte att undersöka och kategorisera encelliga beteendesom en funktion av klädd tillstånd. Dessa fördelningar kan vidare karakteriseras med användning av centralmått (medelvärde, median, mode) och variation (varians, variationskoefficient, Fano faktor) och hypotes testmetoder som Kolmogorov-Smirnov test.
  2. Analys av TFM-data. Här beskrivs en strategi som innehåller en tidigare utvecklad algoritm genom Butler et al. och Wang et al. 40, 47.
    1. Använd ImageJ till parti konvertera bilderna till 8-bitars TIFF-filer. Applicera pixel genomsnitt binning (t.ex. 2 x 2) för att minska beräknings kostnaden och tiden för efterföljande analys. Såsom algoritmer för TFM har till stor del inriktad på enkelcellanalys, den stora cellsubstratgränsytan av öarna (~ 17,5 × 10 3 | im 2) i jämförelse med den cellsubstratgränsytan av en enda cell (75 | j, m 2) necessitates binning steget.
    2. Mata in fångade faskontrast och långt rött fluorescerande bilder (både före dissociation och efter dissociation) i en vetenskaplig programmeringsmiljö som MATLAB och processen med hjälp av de tidigare utvecklade algoritmer för Butler et al. och Wang et al. 40, 47.
      1. Välj tre regioner långt från cell ön. Dessa regioner används för att redogöra för förskjutningar på grund av bilden eller provglidning.
      2. Tillhandahålla den faktor för att konvertera från pixlar till mikrometer (t.ex. 0,454 pixlar / xm), Youngs modul av substratet (t.ex., 13 kPa), och Poissons tal (t.ex., 0,48 för polyakrylamidgeler som beskrivs här).
      3. För varje ö, dra en gräns runt periferin för att definiera geometriska begränsningar; alla krafter utanför denna gräns nollställs. Detta begränsade systemet är rimlig med tanke på den stora distaiou (dvs., 450 | j, m) mellan öar.
    3. Beräkna root-mean-square drag stress och sammandragande ögonblick för varje ö. Den kontraktila ögonblick är ett mått på restspänningen över cell ö och har visat sig återspegla styrkan i cell-cell-interaktioner 48. För varje ordnade tillstånd genomsnittliga rms-kvadratvärden över flera öar och biologiska replikat och beräkna tillhörande variansen för hypotesprövning. Det är också möjligt att jämna ut fördelningen av spänningar eller moment under många öar för att ge en representativ karta över båda åtgärderna som en funktion av geometri, till exempel, avstånd från centrum av ön.

Representative Results

Med hjälp av denna plattform, undersökte vi rollen av både biokemiska och biofysiska ledtrådar i öde specifikation av leverstamfäder 34, 35. Protein A / G-konjugerad Notch-ligander visade förbättrad retention och klustring i polyakrylamid hydrogel (Figur 3A) och var dessutom kapabel att driva differentiering av leverstamfäder mot en gallgången cell öde (Figur 3B). Med hjälp av encelliga analys, vi kvantifierat svar på Notch-ligander för ECM-proteiner kollagen I, kollagen III, kollagen IV, fibronektin och laminin (figur 3C), fann att svaret av leverstamfäder till liganden beror också på ECM sammanhang. Slutligen utnyttjade vi shRNA knockdown att generera leverstamfäder utan ligandema Dll1 och JAG1. Gensvaret på klädd Notch-ligand varierade beroende på presence antingen ligand, vilket bekräftar att responsen för cell yttre liganden är också en funktion av cell inneboende ligand uttryck (Figur 3D). Vidare observerade vi en tydlig subpopulation av dubbelpositiva (ALB + / OPN +) celler i Dll1 knockdown (Figur 3D). Tillsammans utgör dessa representativa resultat visar: (1) de kombi kapacitet arrayformat, som exemplifieras av hopkopplingen av flera klädd ECM-proteiner och Notch-ligander med knockdown av enskilda ligander; (2) funktionalitet inte bara klädd ECM-proteiner utan också klädd cell-cell-ligand via protein A / G-medierad konjugation; och (3) genomförandet av vår encelliga analys och dess förmåga att urskilja unika subpopulationer.

Vi observerade också att differentieringen av leverstamfäder är beroende av både substratet styvhet och ECM sammansättning (figur 4A ong>), särskilt konstatera att kollagen IV stöder differentiering på både mjuka och styva substrat medan fibronektin stöder endast differentiering på styva substrat (Figur 4B). Representativa värme kartor över TFM mätningar tyder på att ihållande dragkraft stress i låg substrat styvhet på kollagen IV främjade differentiering till galla kanalceller (Figur 4C), ett konstaterande bekräftas av genomsnittliga root-mean-square värden (Figur 4D). Tillsammans utgör dessa representativa resultat visar: (1) en framgångsrik integration av TFM med cellarrayer på substrat med en avstämbar styvhet för att bedöma både cellfenotyp och driv stress; (2) samordning av levern progenitorcell öde med både matriskompositionen och substratet styvhet; och (3) genomförandet av våra TFM analys och typiska dragspännings profiler i cellarrayer.

e en "src =" / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
Figur 1: Översikt schema som visar de tre första Experimentella avsnitt. I avsnitt 1, är glassubstrat rengörs och silaniserad för att underlätta tillverkning av polyakrylamid hydrogeler. I avsnitt 2, är biomolekylen kombinationer av intresse ställdes i en 384 brunnar källmikro. En robot arrayer laddas sedan med rena nålar, källmikro, och polyakrylamid hydrogeler och initieras, tillverka matriser på hydrogel. I avsnitt tre celler såddes på de grupperade domäner och fick fästa, varefter kulturen protokollet av intresse utförs. Vid slutpunkten, celler antingen fastställts för immuncytokemi / immunofluorescens eller analyseras med hjälp av TFM. Skala barer är 75 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

inom-page = "1"> figur 2
Figur 2: bearbetning och analys av Immunofluorescens Data från arrayer. (A) Klinker, sammansatta 32-bitars RGB-bilder först arkiveras och sedan upp i flera enskilda 8-bitars kanaler. Med användning av en kombination av grupperade fluorescerande markörer och cell öar, är tre hörnen i arrayen identifieras för att möjliggöra för automatiserad orientering och gridding av de matriser. (B) Single-cell data genereras för varje kanal av inmatnings arrayer. För att redogöra för experimentell drift, är -kvantilen normalisering tillämpas av biologisk replikat, som producerar en enda gemensam spridning över alla replikat. -kvantilen Norm därefter plottas och tolkas genom beräkning av ensemble mätningar (t.ex. celler / ö, medelintensitet, procentenheter celler positivt för en etikett) eller direkt analys av encelliga distributioner.m / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Notch ligand Presentation förmedlar Lever gångar differentiering. (A) Fc-rekombinant Notch ligander Jagged-1 (JAG1) och Delta-like en (DLL1) uppvisade förbättrad retention och klustring när klädd med protein A / G. Skala bar är 50 pm. (B) Lever stamceller differentieras till galla kanalceller vid uppvisande med Notch-ligand. 4 ', är 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) en nukleär märkning, albumin (ALB) är en levercellmarkör, och osteopontin (OPN) är en gallgången cellmarkör. Skala bar är 150 pm. (C) Kvantifiering av den procentuella andelen celler positivt för OPN för Notch-ligander JAG1, DLL1, och Delta-like 4 (DLL4) på ECM-proteiner kollagen I, collagen III, kollagen IV, fibronektin och laminin. Students t -tests utfördes mot kontroll-IgG för varje klädd Notch-ligand inom varje ECM protein med P-värden anges för P <0,05 (*). (D) Imaging cytometry av ALB och OPN för celler på kollagen III presenteras med Notch-ligander JAG1, DLL1 och DLL4. Leverstamfäder utan Notch liganderna Dll1 och JAG1 (dvs shDll1 och shJag1) genererades med användning shRNA knockdown. Data i (C) presenteras som medelvärde ± sem Denna siffra har modifierats Kaylan et al. 34. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Matrix sammansättning och substrat Stelhet Coordinate Liver progenitor Differentiering. (A) Lever progenitor differentiering till gallgångsceller celler är beroende av både ECM sammansättning och substrat styvhet. DAPI är en nukleär märkning, ALB är en levercellmarkör, och OPN är en gallgången cellmarkör. (B) Kvantifiering av procentandelen av celler positiva för OPN på substrat av Youngs modul 30 kPa, 13 kPa, och 4 kPa för kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), och alla två-vägs kombinationer av dessa ECM-proteiner. (C) Cell dragkraft stress är beroende av både substrat styvhet och ECM sammansättning. (D) Kvantifiering av root-mean-square värden för dragspänning på substrat av Youngs modul 30 kPa och 4 kPa för kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), och alla tvåvägs kombinationer av de ECM-proteiner. I (B) och (D), samlades data presenteras som medelvärde ± SEM och Students t -testsutfördes mot 30 kPa för varje ECM kombination med P-värden anges för P <0,05 (*), P <0,01 (**) och P <0,001 (***). Skala barer är 50 pm. Denna siffra har modifierats Kourouklis et al. 35. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sektion Problem potentiella orsaker Lösning
1. Tillverkning av Polyacrylamide Substrate. Coverglass kan inte tas bort från hydrogel. Overpolymerization. Reducera polymerisationstiden till <10 minuter (4 W / m 2). Kontrollera att UV crosslinker utsignal ligger inom förväntat intervall.
Dålig polyakrylamid hydrogel polymerisation. Underpolymerization. Öka polymerisationstiden till> 10 minuter (4 W / m 2). Kontrollera att UV-tvärbindare produktionen är inom förväntade intervall.
Polyakrylamid hydrogeler är skadade efter avlägsnande av coverglass. Mjuka polyakrylamid hydrogeler är lätt att skada. Vi observerar minskar hydrogel tillverkning avkastning (~ 50%) för den mjukaste (dvs 4 kPa) hydrogeler i synnerhet. Hantera hydrogeler försiktigt och öka startnummer för att uppnå önskad avkastning.
2. Tillverkning av matriser. Dålig eller inkonsekvent plats morfologi. Inkonsekvent luftfuktare funktion. Kontrollera att luftfuktare och Rheometer en funktionell under varje upplaga och behålla 65% RH.
Stift fastnat i skrivhuvudet eller täppaged. Rengör skrivhuvudet för att möjliggöra fri stift rörelse. Rena stift noggrant före eller efter varje upplaga för att avlägsna aggregat från stiftkanaler.
3. Cell Culture och analys Execution. Cell lossnar eller död på matriser efter initial fastsättning. Overseeding och överdriven proliferation. Minska initial sådd densitet och tid. Använd "underhåll" eller "differentiering" media under array kultur för att minska celltillväxt.
Frisättning av toxiska akrylamidmonomer från hydrogel. Blöt hydrogeler i dH 2 O i minst 3 d för att medge diffusion / frisättning av akrylamidmonomer och minska celltoxicitet.
Celler inte fäster matriser. Underseeding. Öka initial sådd densitet och tid. Använda en mer starkt vidhäftande celltypen.
Dålig avsättning avmatris eller biomolekyl tillstånd. Rena stift av partiklar och aggregat, bekräfta utskriftsparametrar och utvärdera observation av fluorescerande markörer, t.ex. rodamin-konjugerat dextran.
Specificiteten för cell-matrix-interaktioner. Olika celltyper vidhäftar specifikt till vissa men inte andra ECM-proteiner. Testa flera olika ECM-proteiner med dina celler.
Suboptimal array lagring efter tillverkning. Vi rekommenderar lagring av fabricerade arrayer över natt vid 65% relativ fuktighet och rumstemperatur, delvis för att undvika fasändringar under frysning. Celladhesion är känslig för både fuktighet, temperatur och lagringstid; Se till att dessa parametrar är konsekventa / optimerad för dina experiment.
Avlossning av hydrogel från glassubstratet under cellodling. Dålig glid rengöring och silanisering. Byt arbetslösningar för glid rengöring ochsilanisering.
Overdehydrated hydrogel. Lämna inte hydrogeler uttorkande på en värmeplatta under längre tid än 15-30 minuter.
4. Analys av data. Hög variation mellan upprepade fläckar och diabilder. Variationen i array tillverkning. Kontrollera att stiften och skrivhuvudet är rena. Bekräfta luftfuktare funktion. Visualisera och kvantifiera plats och array kvalitet med fluorescerande markörer. Lagra matriser som rekommenderas ovan.

Tabell 1: Felsökning.

Discussion

I våra experiment har vi funnit att de vanligaste fel är relaterade till kvaliteten på fabricerade matriser och dåligt kännetecknas respons i det biologiska systemet av intresse. Vi hänvisar läsaren till tabell 1 för gemensamma felmoder i cellmicroarray experiment och tillhörande felsökningssteg. När det gäller kvaliteten på matriser i synnerhet, rekommenderar vi följande. Bekräfta den tekniska kvaliteten och robustheten hos grupperings program, parametrar och buffertar som använder fluorescerande molekyler såsom rodamin-konjugerat dextran. Rengör stift antingen före eller efter grupperings enligt tillverkarens anvisningar och ytterligare visuellt kontrollera att stiftkanaler är fria från smuts med ett ljusmikroskop. Bekräfta klädd biomolekyler lagring med hjälp av allmänna proteinfläckar eller immunmärkning. Notera att biomolekyler med en molekylvikt under 70 kDa ofta inte kvarhålls i hydrogelen 23, sup> 31. Validera klädd biomolekyler cell funktionalitet med hjälp av flera celltyper. Observera att endast vidhäftande celler är förenliga med arrayer; dessutom är vidhäftning till matriser beroende både cellspecifika egenskaper (t.ex. grin uttryck profil) och de valda ECM-proteiner.

På grund av begränsat utrymme, har vi inte lämnat en omfattande behandling av array design, layout och tillverkning här och hänvisar läsaren till tidigare verk 23, 25. Vi använder i allmänhet 100 spot subsystem (150 | j, m spot diameter, 450 | im centrum-till-centrumavstånd) sammansatta av 10-20 unika biomolekyl förhållanden (dvs 5-10 fläckar / skick). Antalet subsystemen i en matris varierar beroende på antalet biomolekyler förhållanden av intresse, som kan bekvämt skalas upp till 1280 på en 25 x 75 mm objektglas (~ 6.400 platser i 64 subsystem)xref "> 25, 31 Parametrarna ovan kommer att ytterligare variera beroende på mönsterstorleken av intresse;. stift kan generera mönster 75-450 um är lätt tillgängliga.

Array experiment bäst kompletteras med validering av höga poäng ordnade förhållanden av intresse med hjälp av andra kultur format, analys avläsning och biologiska modellsystem. Specifikt rekommenderar vi ytterligare validera effekterna av utvalda ordnade förhållanden med användning av bulk kulturer i samband med molekylärbiologiska standardtekniker (t.ex. QRT-PCR, immun) eller standard TFM. Genetisk manipulation (t.ex. knockdown eller överuttryck) av faktorn av intresse i en lämplig biologiskt modellsystem kan också användas för att bekräfta effekter som observerats i matriser. In vivo djurmodeller representerar ett annat sätt att validering och har nyligen använts, till exempel, för att bekräfta den centrala roll som galektin-3 och galektin-8 ilungcancer metastaserad nisch, som ursprungligen identifierades via cell microarray 31, 49.

Ett antal andra metoder har använts för att undersöka microenvironmental reglering av cellfunktioner, inklusive en mängd två-dimensionella mikrofabricerade system 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 och tredimensionella tekniska biomaterialsystem 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I jämförelse med andra metoder, de särskilda fördelarna med cellmicroarray plattform som beskrivs här består av: (1) genomströmning upp tillhundratals eller tusentals olika kombinationer av faktorer, som möjliggör analys av interaktionseffekter; (2) tillgänglig, automatiserad bildbehandling och analys; (3) integration av både biokemiska och biofysiska avläsning med kontrollerad presentation av ordnade faktorer; (4) förmåga att variera substratmaterialegenskaper; och (5) med hög halt encelliga analys av cellernas öde och funktion.

Sammanfattningsvis kombinationen av cellarrayer med TFM på substrat av avstämbara substrat styvhet möjliggör noggrann karakterisering av både biokemiska och biofysiska signaler. Som framgår här, är denna plattform generaliserbara och kan lätt appliceras på en mängd olika vidhäftande celltyper och vävnader sammanhang mot en bättre förståelse av kombi microenvironmental reglering av celldifferentiering och mechanotransduction.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner Austin Cyphersmith och Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic biologi, University of Illinois i Urbana-Champaign) för att få hjälp med mikroskopi och generöst tillmötesgående skärm och videoinspelning vid mikroskopi kärna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4433 Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solution Fisher Scientific SV30010
22 × 60 mm coverglasses Electron Microscopy Sciences 63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM) Sigma-Aldrich 440159 Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS) Sigma-Aldrich C3023
35 mm glass-bottom Petri dishes Cell E&G GBD00002-200 13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile USA Scientific 1823-8400
6-well polystyrene microplates Fisher Scientific 08-772-1B 35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
Acetone Sigma-Aldrich 179973
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tail EMD Millipore 08-115MI
Collagen III, human EMD Millipore CC054
Collagen IV, human EMD Millipore CC076
Crosslinker, 365 nm UVP CL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa ThermoFisher Scientific D1841 Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific (HyClone) SH3001302
Ethyl alcohol Decon Labs 2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED
Fc-recombinant DLL1, mouse R&D Systems 5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouse AdipoGen AG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, rat R&D Systems 599-JG-100
Fibronectin, human Sigma-Aldrich F2006
Fluorescent microscope, inverted Zeiss Axiovert 200M Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPI SouthernBiotech 0100-20
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 695092 CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Glycerol Sigma-Aldrich M6145
Irgacure 2959 BASF Corporation 55047962
Laminin, mouse EMD Millipore CC095
Methanol Sigma-Aldrich 179957
Microarray scanner GenePix 4000B Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
Microarrayer Digilab OmniGrid Micro Other microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mm Sigma-Aldrich CLS294775X25 ~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide) Sigma-Aldrich M7279 CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v Electron Microscopy Sciences RT15710 Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinant ThermoFisher Scientific 21186
Pyrex drying tray, 2,000 mL Fisher Scientific 15-242B
Rectangular 4-chambered culture dish Fisher Scientific (Nunc) 12-565-495 For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arraying ArrayIt SMP3 Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27, (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324, (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11, (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25, (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15, (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6, (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23, (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4, (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24, (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3, (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29, (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123, (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48, (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27, (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72, (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2, (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N. Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. Parekkadan, B., Yarmush, M. Artech House Publishers. Boston, MA. 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7, (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1, (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1, (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22, (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18, (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5, (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6, (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3, (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153, (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853, (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282, (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19, (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282, (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5, (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514, (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21, (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8, (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3, (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314, (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7, (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10, (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (48), 19632-19637 (2012).
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter