Summary
Studiare canali ionici, attraverso un sistema di espressione eterologhi è diventata una tecnica di base nella ricerca biomedica. In questo manoscritto, presentiamo un metodo efficiente tempo per realizzare canali ionici strettamente controllato eseguendo trasfezione transiente sotto il controllo di un promotore inducibile.
Abstract
Trasfezione, la consegna di acidi nucleici estranei in una cella, è un potente strumento di ricerca proteine. Attraverso questo metodo, i canali ionici possono essere studiati attraverso l'analisi elettrofisiologiche, caratterizzazione biochimica, gli studi mutazionali, e loro effetti sui processi cellulari. trasfezioni transienti offrono un semplice protocollo in cui la proteina diventa disponibile per l'analisi entro poche ore o giorni. Anche se questo metodo presenta un protocollo efficiente relativamente semplice e tempo, uno dei componenti critici sta calibrando l'espressione del gene di interesse a livelli fisiologicamente importanti o livelli che sono adatti per l'analisi. A tal fine, molti approcci diversi che offrono la possibilità di controllare l'espressione del gene di interesse sono emersi. Diversi protocolli di trasfezione delle cellule stabili forniscono un modo per introdurre in modo permanente un gene di interesse nel genoma cellulare, ai sensi del regolamento di un transcrip tetraciclina controllatoattivazione zionale. Mentre questa tecnica produce livelli di espressione affidabili, ogni gene di interesse richiede alcune settimane di lavoro qualificato, fra cui tarature di una curva di uccisione, la selezione di colonie di cellule, e in generale più risorse. Qui vi presentiamo un protocollo che utilizza trasfezione transiente del potenziale canale cationico membro sottofamiglia V 1 gene Transient Receptor (TRPV1) in un sistema inducibile come un modo efficace per esprimere una proteina in un modo controllato, che è essenziale per l'analisi dei canali ionici. Abbiamo dimostrato che l'utilizzo di questa tecnica, siamo in grado di effettuare l'imaging di calcio, cellula intera, e l'analisi monocanale con livelli dei canali controllati richiesti per ogni tipo di raccolta dati con un unico trasfezione. Nel complesso, questo fornisce una tecnica replicabile che può essere utilizzato per studiare struttura e funzione canali ionici.
Introduction
Esprimendo eterologhi sistemi è una delle tecniche più utilizzate per studiare un gran numero di funzioni cellulari 1. Il loro profilo basso endogena di proteine, minima necessità di manutenzione, la crescita affidabile, e la capacità di intraprendere e di esprimere DNA estraneo hanno fatto linee cellulari quali embrionale umano Rene (HEK293) e ovaio di criceto cinese (CHO) quasi indispensabile per la ricerca biologica 2, 3. Le aree di ricerca che utilizza sistemi eterologhi includono proteine di membrana, di segnalazione intracellulare, e l'attività enzimatica. A seguito di trasfezione di DNA estraneo all'interno della cellula, molte diverse forme di analisi possono essere eseguite, tra cui elettrofisiologia, l'imaging del calcio raziometrico, Western Blot, ecc 4, 5.
A causa della vasta gamma di potenziali applicazioni per i sistemi di espressione eterologa, molti differereagenti e prodotti nt sono stati sviluppati per utilizzare queste cellule e le loro qualità 6. sistemi di consegna del DNA che si integrano in modo transitorio o permanente DNA estraneo nelle cellule per studiare proteina esogena è diventato uno degli strumenti più popolari e utili per la ricerca biologica. Più specificamente, transitoriamente trasfezione del DNA in una cellula è ampiamente usato come un semplice processo avanti, rettilineo che richiede relativamente poco tempo e materiali. Inoltre, il tasso di successo di cellule che subiscono trasfezione è alto 7. Questa tecnica è molto affidabile quando combinato con un gene marcatore come proteina fluorescente verde (GFP), e può essere utilizzato per diverse tecniche come l'imaging calcio e elettrofisiologia 5. Purtroppo, però, esprimono transitoriamente DNA nelle cellule ospiti viene fornito con alcune importanti insidie, non in meno che il livello di espressione per cellule è inaffidabile. Il numero di copie di DNA plasmidico taken up per cella è incontrollabile, quindi l'espressione tra i singoli esperimenti può variare notevolmente 2. Questo problema diventa significativo quando uno tenta di replicare le condizioni fisiologiche, o l'esecuzione di precise tecniche di raccolta dei dati.
Come soluzione a complicazioni menzionati sopra, i protocolli di trasfezione stabili sono stati progettati in cui un gene di interesse può essere inserito nel genoma di una cellula sotto stretto controllo di un promotore inducibile, ad esempio un sistema tetraciclina repressore espressione, assicurando una singola copia del plasmide integra nel genoma di ciascuna cella e viene espresso solo dopo l'induzione del meccanismo di trascrizione, per esempio, in presenza di doxiciclina. Mentre questo risolve gli ostacoli di livelli di espressione proteica incoerenti, questo metodo perde la comodità di protocollo rapido e relativamente semplice trasfezioni transitorie. Stabilire una linea cellulare stabile richiede almeno un paio di settimane in which si deve calibrare una curva di uccisione fissato antibiotici specifici per mantenere l'espressione proteica e garantire l'integrazione del vettore e abilmente selezionare e crescere colonie di cellule. Nel complesso questo richiede molto più tempo e fatica con un tasso di successo più bassa 8.
Qui, vi presentiamo un protocollo intermedio che si basa sui punti di forza di entrambe le opzioni di trasfezione popolari per fornire un modo semplice ed efficace per controllare i livelli di espressione in qualsiasi linea cellulare inducibile. Pur mantenendo le cellule con un sistema tet inducibile, abbiamo transitoriamente trasfezione nostro gene di interesse, Transient Receptor Potential canale cationico membro sottofamiglia V 1 (TRPV1), legatura in un vettore che può homologously coniugare con il sistema repressore. In questo modo, il gene può essere introdotto nelle cellule senza cominciando a esprimere. Solo con l'aggiunta di doxiciclina non gene comincia a esprimere, ci permette di calibrare i livelli di proteine exprESSIONE secondo la tecnica o livelli osservati in condizioni fisiologiche. Il nostro protocollo evita anche complicanze lunghe associati con la generazione di una linea cellulare che esprime stabilmente. Iniziamo mostrando i livelli mutevoli di attivazione TRPV1 nella diagnostica per immagini del calcio da un-indotta attraverso quattro ore di induzione e come l'aumento dei livelli intracellulari di calcio correlato. Abbiamo quindi duplicare il protocollo in tutta la configurazione della cella della tecnica del patch clamp, mostrando l'attuale aumento con il tempo di induzione crescente. Infine, vi presentiamo alcuni esempi di registrazioni elettrofisiologiche singoli canali, e dimostrare che questa tecnica è particolarmente utile per espressione controllata quando alla ricerca di raccolta di dati precisi sulla base di singole unità della proteina. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo comodo per controllare l'espressione della proteina in sistemi eterologhi, evitando lunghe complicazioni di coltura cellulare, fornendo così un modo per controllare le condizioni tra esperimenti e fornire mori risultati replicabili.
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Protocol
1. legatura il gene di interesse nella reprimibile sito del vettore
- Ottenere un vettore inducibile come pcDNA5 / FRT / TO o pcDNA4 / TO.
- Analizzare il gene di interesse per tutti i siti di restrizione potenzialmente sensibili nel mezzo del gene che sono anche presenti nel sito di clonaggio multiplo del vettore scelto dal DNA in silico software di analisi 4.
- Uso sovrapposizione PCR standard tecniche 4, fiancheggiano il gene di interesse con due siti di riconoscimento di enzimi di restrizione selezionati (che non si trovano nel gene di interesse), la prima inserita prima del codone di inizio, e il secondo dopo il codone di stop.
- Digest sia il vettore e inserire con enzimi di restrizione (scelti nel passo 1.2) a temperatura di lavoro enzimi "per un'ora, seguita da aggiunta di una unità intestino di vitello fosfatasi (CIP) alla reazione vettoriale solo per 30 minuti al fine di evitare auto- legatura.
- Caricare il DNA digerito su un gel di agarosio 1% e separare i segmenti scissi mediante elettroforesi 9.
- Usando la luce UV, tagliare con una lama i pezzi di gel contenenti i segmenti desiderati di vettore ed inserire per essere legata.
- Estrarre i segmenti di DNA dai pezzi di gel di agarosio (utilizzando i kit di estrazione del DNA disponibili commerciali) e misurare la loro concentrazione finale da spettrofotometro a 260 nm.
- Legare il gene di interesse nella inducibile vettoriale selezionato utilizzando T4 ligasi a temperatura ambiente per 20 minuti. Per aumentare la probabilità dell'inserto legatura con il vettore, utilizzare un rapporto 3: 1 molare dell'inserto: vettoriale. Per il controllo, preparare una reazione legatura che include solo il vettore.
- Per trasformazione batterica, aggiungere 10 ng del solo vettore e vettore + gene in 50 microlitri competente E. coli. Incubare la provetta in ghiaccio per 30 minuti seguiti da 45 secondi incubazione a 42 ° C. Porre immediatamente indietroin ghiaccio per due minuti e trasferire i batteri trasformati a 500 microlitri mezzo LB. Incubare per un'ora a 37 ° C sotto agitazione a 220 rpm.
- Per la selezione di batteri trasformati con successo, piastra 100 microlitri di ogni reazione (come descritto al punto 1.9) su una piastra di agar LB contenente preparato antibiotico adatto (per esempio, 100 mg / ml di ampicillina utilizzando pCDNA4 / TR).
- Lasciare a crescere durante la notte a 37 ° C. Piastre possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di due settimane avvolgendoli strettamente nel cinema di paraffina plastica.
- Sollevare colonie individuali utilizzando una punta di 10 microlitri, e permettere a crescere durante la notte in 3 ml di LB + mezzo antibiotico a 37 ° C sotto agitazione a 220 giri al minuto. Batteri con DNA di interesse possono essere congelati (-20 ° C) per la memorizzazione a breve termine mediante centrifugazione del LB ed i batteri a 11.000 xg ed aspirando il surnatante. conservazione a lungo termine richiede il congelamento dei batteri come scorte glicerolo a -80 ° C.
- Estrarre DNA throuGH mini-prep e misurare la concentrazione finale da spettrofotometro a 260 nm 5.
- Confermare l'inserimento di successo del gene di interesse dal sequenziamento del costrutto purificato 4. In alternativa, la digestione diagnostica del costrutto con enzimi di restrizione utilizzando elettroforesi per separare i segmenti tagliati e valutare la presenza e la lunghezza potrebbe anche essere utilizzato per questo scopo 4.
2. Le linee cellulari la coltura Esprimere TetR
- Ottenere una linea di coltura cellulare ospitare un plasmide Tet repressore incorporato nel loro DNA genomico. Qui il protocollo sarà scritto utilizzando embrionali cellule 293T renali umane (HEK-293T) ospitano pcDNA6 / TR plasmide come esempio.
- cellule seme in 100 millimetri piastra di coltura tissutale con Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina, 2 mm L-glutammina, e 25 mm HEPES, pH 7.3 (qui: DMEM completo) e incubare O / N a 37 &# 176; C e 5% di CO 2. Tutti i lavori con celle deve essere fatto in una cappa biologica in condizioni sterili.
- Al fine di mantenere l'espressione del gene repressore Tet, aspirare il terreno e sostituirlo con DMEM completo supplementato con 5 mg / mL blasticidin. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
- Una volta che le cellule raggiungere l'80 - 90% di confluenza, aspirare il terreno e lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS (senza calcio e magnesio) riscaldato a 37 ° C.
- Per sollevare delicatamente le cellule senza causare danni meccanici, incubare la coltura in DMEM contenente 0,05% tripsina riscaldato a 37 ° C per 1,5 min.
- Bloccare l'azione tripsina con un uguale volume di Full DMEM. Delicatamente pipetta su e giù per sollevare le cellule e trasferirli in una provetta sterile.
- Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e sostituirlo con 1 ml completa DMEM. Pipettare la soluzione con le cellule su e giù fino senzagrumi di cellule può essere visto. Conte e calcolare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Seed 1 - 2 x 10 6 cellule in 100 millimetri piatto di coltura tissutale contenente 12 ml completa DMEM con 5 mg / ml blasticidin. Dividere le celle di due volte a settimana mentre raggiungono il 90% di confluenza.
3. transfecting il plasmide di interesse in cellule
- Utilizzando lo stesso metodo di divisione delle celle come descritto sopra, le cellule di trasferimento di pozzetti in una piastra 12 pozzetti preparata con 0,9 mL Figura DMEM, sufficiente a rendere il 50% confluenti (~ 200.000 cellule) e incubare durante la notte a 37 ° C in CO 2 incubatrice.
- Preparare una miscela di trasfezione con pcDNA4 / TO contenente il gene di interesse, un plasmide inerte per portare la quantità totale di DNA a 1 mg (se necessario), 3 microlitri lipide transfection reagenti e DMEM per rendere il volume finale di 100 microlitri. La quantità ottimale di DNA plasmidico da utilizzare varia ampiamente da diverse proteine esprimono in diversa efficienza. per elettiesperimenti rophysiological, includono EGFP in mammiferi plasmide di espressione nel cocktail trasfezione in modo da visualizzare le cellule che subiscono con successo trasfezione 4.
- Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 30 min.
- Trasfezione le cellule pipettando la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle cellule piastrate in piastra 12 pozzetti e oscillare la piastra energicamente per assicurare una dispersione omogenea di DNA e il reagente di trasfezione. Le cellule devono essere ~ 80% confluenti al momento della transfezione.
- Incubare le cellule trasfettate O / N a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Verificare che le cellule sono state trasfettate con successo osservando il segnale di fluorescenza della EGFP sotto la lampada UV la mattina seguente se si esegue elettrofisiologia.
4. Cellule placcatura in poli-D-lisina (PDL) Copri / Wells
- Sterilizzare 12 mm coprioggetto da dousing con il 70% soluzione di etanolo isopropilico. Secco e posizionare un singolo coverslip in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per registrazione elettrofisiologica.
- Pipettare una soluzione di 0.1 - 0.2 mg / mL di soluzione PDL su ciascun vetrino o pozzetto di una camera di imaging calcio.
- Lasciar riposare per 30 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Lavare con acqua coltura cellulare grado bidistillata (DDW) tre volte, aspirando tra ogni lavaggio. Al termine del lavaggio finale, asciugare accuratamente e lasciar riposare a temperatura ambiente.
- Per elettrofisiologia, riempire ogni pozzetto contenente un vetrino rivestito PDL con 500 microlitri DMEM completa riscaldato a 37 ° C.
- Eseguire lo stesso metodo di suddividere le cellule trasfettate come descritto sopra. Dopo risospendere le cellule dopo il trattamento tripsina e blocco, trasferimento 80 ml di cellule (o circa 30.000 cellule) al centro di ogni coprioggetto rivestiti PDL per la registrazione elettrofisiologia. Consentono alle cellule di stabilirsi per almeno 1,5 ore o incubare una notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Per calcio transfer imaging e punto 20 ml di cellule (circa 20.000 cellule) al centro di ciascun calcium imaging rivestite PDL bene. Consentono alle cellule di stabilirsi per almeno 30 minuti e aggiungere 180 ml completo DMEM a ciascun pozzetto.
5. Indurre l'espressione genica
- Preparare una soluzione doxiciclina magazzino di 1 mg / ml in DDW secondo le istruzioni del produttore. Mantenere soluzione madre al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di 3 settimane. Per la conservazione a lungo termine mantenere doxiciclina soluzione di riserva a -20 ° C.
- Preparare una fresca 2 mg / ml (elettrofisiologia) o 3 mg / ml (Calcio Imaging) soluzione doxiciclina in Full DMEM e riscaldarlo a 37 ° C.
- Per le registrazioni elettrofisiologiche, pipetta 500 ml di 2 mg / ml soluzione doxiciclina a ciascun pozzetto per fare una concentrazione finale di 1 mg / ml doxiciclina. Per l'imaging di calcio, aggiungere 100 ml di 3 mg / ml soluzione doxiciclina a ciascun pozzetto per fare una concentrazione finalezione di 1 mg / ml doxiciclina. Annotare l'ora di induzione.
- Incubare per la quantità di tempo desiderato per l'induzione a 37 ° C e 5% CO 2.
6. Calibrazione Timeline di espressione della proteina
- Calibrare l'espressione della proteina attraverso Imaging di calcio 5, 10
- Preparare la soluzione di Ringer (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 20 mM HEPES, pH regolato a 7,4 con NaOH) e riscaldare a 37 ° C.
- Preparare saturando concentrazioni di agonista canale nella soluzione di Ringer. Poiché la quantità di agonista è diluito quando aggiunto alle camere di imaging di calcio contenenti le cellule e la soluzione extracellulare, raddoppiare la quantità di concentrazione finale desiderata agonisti. Questo rende anche la quantità di soluzione del bagno in ogni pozzetto critiche da controllare.
- Preparare una soluzione di non ionico F-127 20% W / V in DMSO. Riscaldare la soluzione a 40 ° C finché non ionico F-127 è disciolto. Conservare la soluzione non ionico F-127 a RT e riscaldarlo a 40 ° C prima dell'uso. Non ionico F-127 è usato per contribuire a disperdere acetossimetil (AM) esteri di indicatori fluorescenti ionici come Fura-2 in soluzioni acquose.
- Aspirare media e sostituirlo con soluzione Fura-02:00 loading (soluzione di Ringer supplementato con 2 - 3 mM Fura-02:00, 0,02 mg / mL non ionico F-127 e 10 mM D-glucosio).
- Incubare per 60 minuti a RT al buio.
- Aspirare Fura-2AM soluzione e lavare le cellule con + 10 soluzione D-glucosio mM di Ringer per rimuovere colorante extracellulare. Ripetere questa operazione due volte.
- Lascia + 10 soluzione D-glucosio mM di 200 microlitri di Ringer in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Mettere da camera sul palco sopra il nasello microscopio e fissarlo con supporto.
- Accendere la lampada, la macchina fotografica e microscopio e selezionare il filtro Fura-2 per rilevare emissione a 510 nm wavelength.
- Regolare per l'ingrandimento desiderato e mettere a fuoco le cellule nel campo selezionato.
- Nel buio, sottrarre la luce di sfondo e impostare il tempo di esposizione.
- Impostare il campionamento foto alla velocità e registrare la fluorescenza risposta desiderata di Fura-2 cellule caricate da loro emozionante a 340 e 380 nm lunghezza d'onda. Il rapporto di 340/380 segnali è un indicatore per la concentrazione intracellulare di Ca 2+ e quindi anche per l'attività di TRPV1.
- Aggiungere 2 mM capsaicina in soluzione di 200 microlitri Ringer pipettando per creare una concentrazione saturante finale di 1 mM capsaicina per valutare il livello di espressione di TRPV1.
- Analizzare risposta TRPV1 secondo tempo di induzione e determinare protocollo per la proteina di interesse.
- Regolazione espressione proteica in sistemi eterologhi usando l'intera configurazione della cella della tecnica patch clamp 4, 11.
- preparare tha bath soluzione di (mM) 140 NaCl, KCl 2,3, 2 MgSO 4, 5 HEPES e 5 2- (N-morfolino) acido etansolfonico (MES), portato a pH 7,4 con NaOH.
- Preparare saturando concentrazioni di agonista canale nella soluzione extracellulare.
- Tirare elettrodi di vetro con un diametro interno (ID) di 1,10 mm e fuoco smalto ad una resistenza di di 2 - 4 MW.
- Preparare una soluzione di pipetta (mM) 130 KCl, NaCl 4, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl 2, 1 EGTA e 10 HEPES a pH 7,2 con KOH. Filtrare la soluzione pipetta prima dell'uso. Prima di ogni esperimento, una sola, pipetta di vetro incendio lucidato è di nuovo riempito immergendo la punta nella soluzione pipetta per almeno un minuto, e poi riempito con punta fuso e allungato con una siringa riempita con la stessa soluzione pipetta.
- Sollevare delicatamente un singolo vetrino PDL rivestito con le cellule placcato dal pozzo di 35 mm piatto di plastica Petri riempite con circa 2 ml di soluzione del bagno a temperatura ambiente. Osservare sotto un EPmicroscopio i-fluorescenza.
- Individuare una cellula positiva EGFP, come visualizzato con il microscopio epifluorescente, sul vetrino preparato e spostarsi al centro del campo visualizzato.
- Fissare la pipetta riempito al titolare pipetta del micromanipolatore, e iniettare una piccola quantità di pressione positiva nel sistema per evitare la contaminazione della soluzione pipetta intracellulare. Abbassare è appena sopra la GFP - cell positivo, il controllo per una corretta resistenza.
- Come la pipetta tocca la cella, applicare una piccola quantità di pressione negativa per creare una tenuta GΩ tra la pipetta di vetro e la membrana cellulare.
- Con un breve e brusco impulso di aspirazione, rompere la membrana cellulare, permettendo la pipetta entri in contatto con il contenuto intracellulare della cella.
- Attivare la modalità di amplificatore a tutta la cella, e abbassare il filtro e uscita guadagno Bessel per 1-5 kHz e 0.5α, rispettivamente.
- Registrare la risposta attuale alla saturazioneLe concentrazioni di agonisti canale utilizzando rampe di tensione o di protocollo libero Gap.
- Perché l'efficienza di espressione cambiano tra le diverse proteine, ripetere le registrazioni con diversi tempi di lunghezza induzione.
- Determinazione tempo di induzione ideale per le registrazioni singolo canale 4.
- Preparare una soluzione di (mM) 150 Na-gluconato, 15 NaCl, 5 EGTA, e 10 HEPES, portato a pH 7,4 con NaOH, come soluzione pipetta. Per la soluzione del bagno, utilizzare la soluzione dal punto 6.2.1.
- Ripetere procedura di cellule intere usando ID pipette di vetro 0.86 mm Sfaccettate ad una resistenza di 10 - 12 MW e impostare potenziale tenendo a -40 mV.
- Creare un sigillo sulla membrana come descritto in precedenza e rottura della membrana.
- Utilizzando il micromanipolatore, sollevare la pipetta con il patch di membrana lontano dalla cella.
- Posizionare il sistema di perfusione direttamente accanto alla pipetta contenente la patch di membrana.
- Lower tegli Bessel filtro e uscita guadagno per 2-5 kHz e 10α, rispettivamente.
- Profumato saturando concentrazioni di agonista sul cerotto membrana valutare se il cerotto contiene uno o più canali in base alla risposta.
- Analizzare il numero di patch singoli canali registrati con successo contro il tempo di induzione applicata alle cellule. Regolare il tempo di induzione secondo i risultati desiderati.
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Representative Results
Per creare rapidamente un modello di espressione inducibile, abbiamo fatto uso di cellule HEK293 che esprimono tetraciclina repressore della proteina (TR) (ad esempio, T-Rex-293) e vettori che contengono sequenze di operatore tetraciclina (Teto) tra il promotore CMV e il sito di clonazione multiplo (ad esempio, pcDNA4 / TO). Quando trasfettata in TREX-293 cellule, l'espressione del gene di interesse in pcDNA4 / TO è repressa, come TR lega al teto. Aggiunta di doxiciclina al mezzo impedisce interazione TR-teto, permettendo così l'espressione della proteina transfettate. Per controllare l'espressione di topo TRPV1 (rTRPV1) in primo luogo abbiamo inseriti geni di questo canale in un pcDNA4 / a vettoriale utilizzando il protocollo sopra descritto. Avanti, T-Rex-293 cellule sono state trasfettate con il rTRPV1- pcDNA4 / TO plasmide secondo le fasi di cui al punto 3 del protocollo. Dopo trasfezione, espressione rTRPV1 stata indotta incubando le cellule in presenza di doxiciclina (1 μg / ml) per 1 - 4 h. È importante sottolineare che diverse concentrazioni di doxiciclina possono essere utilizzati per ottenere velocità di espressione desiderata. Abbiamo usato metodi di imaging elettrofisiologici e calcio per valutare il livello di espressione rTRPV1 ad ogni tempo, applicando la sua agonisti, la capsaicina. Come mostrato in figura 1, utilizzando l'imaging del calcio live-cell, livelli di calcio intracellulare dopo l'applicazione capsaicina aumenta gradualmente con tempi di induzione più lunghi. L'attivazione di cellule uninduced può essere attribuibile ad una perdita basale nell'attività TR, sovraespressione del plasmide o tetraciclina residuo nei componenti cellule multimediali. Successivamente, abbiamo registrato le correnti dalle cellule utilizzando la cellula intera configurazione della tecnica del patch clamp applicazione di rampe di tensione tra -80 mV a 80 mV. La Figura 2 mostra che le ampiezze di corrente superiori si ottengono con tempi di induzione più lunghi. La saturazione in ampiezza della corrente a 4 ore di induzione è Consistent con la saturazione visto nella risposta di calcio (Figura 1). Infine, abbiamo analizzato livelli di espressione rTRPV1 nella configurazione esterna-out della tecnica patch-clamp. Una delle maggiori difficoltà di studiare canale ionico struttura-funzione sta raggiungendo livelli di espressione adatti per l'analisi a singolo canale. Sulla base pubblicato unitaria rTRPV1 conduttanza 4, l'ampiezza della corrente registrata stata utilizzata per determinare il numero di canali nella patch asportato. Come mostrato in figura 3, il numero di canali nella patch aumenta proporzionalmente al tempo doxiciclina incubazione. Dopo un'ora di induzione, non siamo stati in grado di rilevare qualsiasi attività del canale (0 su 8). Tuttavia, in entrambi i punti di tempo di due o tre ore abbiamo registrato l'attività del canale singolo a percentuali di successo simili. Da segnalare, mentre in due ore la maggior parte delle patch non ha risposto, in tre ore la maggior parte delle patch mostrato single-to-multi-channel attività. Le possibilità di registrare più canali dopo tre ore di induzione è alta, così il tempo ottimale di induzione per registrare corrente da un singolo canale è tra due e tre ore nelle condizioni presentate. Insieme, questi risultati dimostrano che l'espressione dei canali ionici può essere strettamente controllata e regolata dopo trasfezione transiente utilizzando questo protocollo.
Figura 1. Risposta di TRPV1 aumenti di attivazione in base al tempo di induzione, come visualizzato attraverso Calcio Imaging. (A) le immagini pseudo-colore di T-Rex-293 cellule che esprimono transitoriamente rTRPV1, prima ( 'basale') e dopo capsaicina applicazione (2 micron). barre bianche rappresentano 30 micron. barra della scala indica i livelli di calcio intracellulare. (B) cambiamenti nel tempo dei livelli intracellulari di calcio in trasfettate T-REX-293 cellule trattate come mostratoin A. Ogni grafico rappresenta la media delle cellule sensibili 50 capsaicina. Notare i graduali aumenti risposte capsaicina in relazione al tempo di induzione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. TRPV1 corrente aumenta come conseguenza di aumentare il tempo di induzione in tutta la cella Bloccare Registrazioni patch. (A) le registrazioni Whole-cell da T-REX-293 trasfettate con rTRPV1 ad un potenziale di -40 mV tenuta. Le cellule sono state indotte con doxiciclina (1 mg / ml) per il tempo indicato e quindi esposti alla capsaicina ( 'Cap'; barra rossa; 1 micron). Viene mostrato una traccia rappresentante di 6 - 11 registrazioni indipendenti. (B) Media / scatter plot-punto che rappresenta l'ampiezza cellula intera evocata come mostrato in A. Statisticaal significatività tra i gruppi è stata determinata con ANOVA con confronti multipli, dove *** rappresenta p ≤0.001 e non NS statisticamente significativi (n = 6 - 11 celle). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Tasso di successo del singolo Channel Patch in TRPV1 registrazioni dipende dal tempo di induzione. (A) le registrazioni di fuori-out da T-REX-293 trasfettate con rTRPV1 ad un potenziale di 50 mV tenuta. Le cellule sono state indotte con doxiciclina (1 mg / ml) per il tempo indicato e sono stati esposti alla capsaicina ( 'Cap'; barra rossa; 1 micron). Viene mostrato una traccia rappresentante di 6 - 9 registrazioni indipendenti. (B) Media / scatter plot-punto che rappresenta il numero di canali nella patch asportato comemostrato in A. significatività statistica tra i gruppi è stata determinata con ANOVA con confronti multipli, dove *** rappresenta p ≤0.001 e non NS statisticamente significativi (n = 6 - 9 cellule). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Transfection è un protocollo ampiamente usato per l'espressione della proteina e di ricerca, con molte varianti per migliorare l'espressione di coerenza e stabilità. reagenti di trasfezione transiente offrono un semplice, facile da usare protocollo in cui la cellula e la proteina di interesse possono essere analizzati in poche ore a tutta la notte dal momento della trasfezione. Purtroppo questo approccio può essere imprevedibile se la modalità di analisi richiede un livello costante di espressione della proteina, quali le registrazioni di singolo canale in elettrofisiologia 2. Alternativamente, linee cellulari stabili sotto il sistema di espressione reprimibile tetraciclina sono stati sviluppati per offrire un modo per controllare il livello di espressione della proteina di interesse 12. Questo approccio fornisce espressione coerente di tutte le cellule in una coltura con l'introduzione di un integratore tetraciclina derivati, quali doxiciclina. Mentre questo consente un controllo costante e preciso dei livelli di proteine, tha il tempo e lo sforzo che va a stabilire una linea cellulare stabile lo rende scomodo e svantaggiosa quando si studia una vasta gamma di proteine 8.
Il protocollo presentato qui offre una soluzione middle-of-the-road per i protocolli di trasfezione attuali offerti. Con transitoriamente transfezione un gene sotto un promotore controllabile in cellule che possiedono un repressore Tet, siamo in grado di raggiungere l'espressione controllabile, evitando procedure lunghe e complicate. Qui, abbiamo usato il TRPV1 canale cationico non selettivo con l'imaging del calcio e l'analisi elettrofisiologia. Abbiamo trovato che il tempo di induzione ideale per l'espressione controllata di questa proteina specifica per l'analisi singolo canale era compreso tra 2 - 3 h di incubazione con 1 mg / ml di doxiciclina (figure 1 - 3). Su una scala più ampia, questa tecnica può essere applicata a qualsiasi proteina di interesse. Questo protocollo offre anche una soluzione di controllo dell'espressione quando una large gamma di diverse proteine o mutazioni in sequenze proteiche sono di interesse e la creazione di una linea cellulare stabile per ogni variante è impraticabile. È importante sottolineare che, mentre i risultati qui rappresentano il momento ottimale e le concentrazioni applicabili per l'espressione TRPV1, ogni gene ha la sua individuale e la traduzione e il traffico specifico ritmo, in tal modo i tempi di taratura e di espressione di ogni proteina sarà molto diverso 13.
Sebbene questa tecnica offre una comoda soluzione espressione controllata, non è senza limitazioni. Solo commercialmente linee cellulari disponibili ospitano il sistema Tet possono essere utilizzati con questo sistema, che presenta un problema se queste linee cellulari particolari non sono adatti per il tipo di analisi che deve essere eseguita. Un altro trabocchetto rispetto alle linee trasfettate stabilmente è che non tutte le cellule subiscono trasfezione, e quindi non tutte le cellule esprimono la proteina di interesse. Nel complesso, offriamo un modo comodo per controllare proteine eXpression in un sistema eterologo che può essere applicata a una vasta gamma di ricerca biomedica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12, 1444/16 e] (AP). AP è affiliata con Brettler Center e David R. Bloom Center, Facoltà di Farmacia, Università Ebraica di Gerusalemme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
| NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
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