Summary
異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。
Abstract
トランスフェクションは、細胞への外来核酸の送達は、タンパク質研究の強力なツールです。この方法によって、イオンチャネルは電気生理学的分析、生化学的特徴、突然変異研究、および細胞プロセスへの影響を介して調べることができます。一過性トランスフェクションは、タンパク質が、数時間から数日以内に、分析のために利用可能となるような単純なプロトコルを提供します。この方法は、比較的簡単かつ時間効率的なプロトコルを提示しているが、重要な要素の一つは、分析するのに適している生理学的に適切なレベルまたはレベルの関心対象の遺伝子の発現を較正します。この目的のために、関心対象の遺伝子の発現を制御する能力を提供する多くの異なるアプローチが出現しています。いくつかの安定な細胞トランスフェクションプロトコルは、恒久的に、テトラサイクリン制御transcripの制御下で細胞ゲノム中に目的の遺伝子を導入する方法を提供します的な活性化。この技術は信頼性の高い発現レベルを生成しているが、関心の各遺伝子は、殺害曲線のキャリブレーション、細胞コロニーの選択、および全体的なより多くのリソースを含む、熟練した作業の数週間が必要です。ここでは、イオンチャネルの解析に不可欠である制御された方法でタンパク質を発現するための効率的な方法として、誘導系に一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）遺伝子の一過性トランスフェクションを使用するプロトコルを提示します。我々は、この技術を用いて、我々は、単一のトランスフェクションでのデータ収集の種類ごとに必要な制御チャネルレベルでカルシウムイメージング、全細胞、および単一チャネル分析を実行することが可能であることを示しています。全体として、これは、イオンチャネルの構造と機能を研究するために使用することができる複製可能な技術を提供します。
Introduction
異種システムを発現する細胞機能1の多数を研究するために最も広く使用されている技術の一つです。それらの低い内因性のタンパク質プロフィール、最小限のメンテナンス要件、信頼性の高い成長、および外来DNAを取り込み、表現する能力は、ヒト胚性腎臓（HEK293）および生物学的研究2、3にほぼ不可欠なチャイニーズハムスター卵巣（CHO）などの細胞株を作りました。異種のシステムを用いた研究の分野は、膜タンパク質、細胞内シグナル伝達、酵素活性を含みます。細胞への外来DNAのトランスフェクションに続いて、分析の多くの異なる形態は、電気生理学、レシオメトリックカルシウムイメージング、ウェスタンブロット、 等 4、5を含む、実施することができます。
異種発現系のための潜在的なアプリケーションの広い配列に、多くのdiffereによる塩基試薬および生成物は、これらの細胞及びそれらの品質6を利用するために開発されています。一過性または恒久的に外因性タンパク質を研究するために、細胞に外来DNAを組み込み、DNAの送達システムは、生物学的研究のための最も人気のあると便利なツールの一つとなっています。具体的には、細胞内に一過性にトランスフェクトするDNAが広く、比較的少しの時間と材料を必要とする単純な、まっすぐ進むプロセスとして使用されています。さらに、トランスフェクションを受けた細胞の成功率は、7高いです。この技術は、緑色蛍光タンパク質（GFP）などのマーカー遺伝子と組み合わせたときに非常に信頼性があり、このようなカルシウムイメージングおよび電気生理学5のような多くの異なる技術のために使用することができます。しかし、残念ながら、一過性DNAを宿主細胞に発現していない細胞あたりの発現レベルの信頼性が低いこと以上に、いくつかの主要な落とし穴が付属しています。プラスミドDNAのコピー数は、Uをとっセル当たりのpは、このように個々の実験間での発現が大幅に2を変えることができ、制御不能です。いずれかの生理学的条件を再現しようとしている、または正確なデータ収集技術を実行すると、この問題が顕著になります。
上記の合併症を解決するように、安定なトランスフェクションプロトコルは、単一のを確実に、テトラサイクリンリプレッサーの発現系として、目的の遺伝子が誘導性プロモーターの厳格なコントロール下で細胞のゲノムに挿入することができるように設計されていますプラスミドのコピーは各細胞のゲノムに組み込まれ、ドキシサイクリンの存在下で、例えば、転写機構の誘導後にのみ発現されます。これは、一貫性のないタンパク質の発現レベルの障害を解決するが、この方法は、一過性トランスフェクションの迅速かつ比較的単純なプロトコルの利便性を失います。安定な細胞株を確立することはwhicで少なくとも数週間かかります時間1は、タンパク質の発現を維持し、ベクターの組み込みを確保し、巧みに選択して、細胞コロニーを成長させるために、特定の抗生物質によって設定された殺害曲線を校正しなければなりません。全体的にこれは、より低い成功率8と有意に多くの時間と労力を要します。
ここでは、任意の誘導性細胞株における発現レベルを制御するためのシンプルで効果的な方法を提供する人気のトランスフェクションのオプションの両方の強みを生かし、中間プロトコルを紹介します。誘導性のtetシステムで細胞を維持しながら、我々は、一過性相同リプレッサーシステムと組み合わせることができるベクターに連結関心の私達の遺伝子、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）を、トランスフェクション。この方法では、遺伝子が発現し始めずに細胞に導入することができます。唯一のドキシサイクリンを添加した遺伝子は、タンパク質exprのレベルを校正するために私たちにできるように、発現し始めるん生理学的条件下で観察された技術やレベルに応じてession。我々のプロトコルは、安定発現細胞株を生成するに関連付けられている長い合併症を回避することができます。私たちは、誘導および方法細胞内カルシウムレベルの上昇が相関の4時間を通じて非誘導からのカルシウムイメージングにおけるTRPV1の活性化の変化レベルを示すことから始めます。我々は次に、誘導時間の増加に伴って増加する電流を示し、パッチクランプ技術の全細胞構成でプロトコルを複製します。最後に、我々は、単一チャネルの電気生理学的記録の例を提示し、タンパク質の個々の単位に基づいて正確なデータ収集を探しているときに、この技術は、制御された発現のために特に有用であることを示しています。我々のプロトコルを介して、我々は、このように、実験の間に条件を制御し、MOを提供するための方法を提供し、長い細胞培養合併症を回避しながら、異種系におけるタンパク質の発現を制御するための便利な方法を提供します複製可能な結果を再度。
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Protocol
1.ベクターの抑制性サイトに目的の遺伝子を連結
- このようなpcDNA5 / FRT / TOまたはのpcDNA4 / TOなどの誘導性ベクターを取得します。
- また、 インシリコ DNA解析ソフト4によって選択されたベクターのマルチクローニングサイトで紹介されている遺伝子の途中で任意の潜在的影響を受けやすいの制限部位のために目的の遺伝子を分析します。
- 標準的なオーバーラップPCR法を用いて、4（目的の遺伝子に見出されていない）は、2つの選択された制限酵素認識部位を用いて目的の遺伝子に隣接する、開始コドンの前に挿入された第一、及び停止コドンの後に第二。
- ベクターの両方を消化し、自己を回避するためにわずか30分ベクトル反応に一単位ウシ腸ホスファターゼ（CIP）を加え、続いて1時間酵素」作業温度で（ステップ1.2で選択した）制限酵素でインサートライゲーション。
- 1％アガロースゲル上に消化されたDNAをロードし、電気泳動9によって切断されたセグメントを分離します。
- UV光を使用して、ブレードとベクトルの所望のセグメントを含むゲルの部分をカットし、ライゲートさせるべき挿入します。
- （市販のDNA抽出キットを用いて）アガロースゲル片からDNA断片を抽出し、260nmで分光光度計により、その最終濃度を測定します。
- 20分間室温でT4リガーゼ酵素を使用して、誘導性選択されたベクターに目的の遺伝子を連結。インサートのモル比1：ベクターの挿入は、ベクターと連結する確率を高めるために、3を使用します。制御のために、ベクターのみを含んでライゲーション反応を準備します。
- 細菌の形質転換のために、50μLのコンピテント大腸菌にベクター単独とベクトル+遺伝子の10 ngのを追加します。 42℃で45秒間インキュベートし、氷上で30分間チューブをインキュベートします。すぐに戻って置きます2分間氷上で500μLのLB培地に形質転換された細菌を移します。 220rpmで攪拌しながら37℃で1時間インキュベートします。
- 首尾よく形質転換された細菌の選択のために、適切な抗生物質を含む準備されたLB寒天プレート上に（1.9で説明したように）各反応のプレート100μL（ 例えば 、100μg/ mLのアンピシリンのpcDNA4 / TRを使用した場合）。
- 37℃で一晩成長させます。プレートをしっかりプラスチックパラフィンフィルムでそれらを包むことにより、最大2週間4℃で保存することができます。
- 10μLチップを用いて個々のコロニーを持ち上げ、そして220rpmで撹拌下、37℃で+抗生物質培地3mLのLB中で一晩成長させます。目的のDNAを持つ細菌は、11,000×gでLBや細菌を遠心分離し、上清を吸引することにより、短期記憶のために（-20℃）で凍結することができます。長期保存は-80℃でグリセロールストックとして細菌を凍結する必要があります。
- throu DNAを抽出GHミニプレップおよび260nmの5で分光光度計による最終濃度を測定。
- 精製された構造物4を配列決定することにより、目的の遺伝子の挿入が成功を確認してください。あるいは、カットセグメントを分離し、その存在と長さを評価するために電気泳動を使用して、制限酵素によって構築物の診断的消化は、この端部4に利用することができます。
TetRを表現2.培養細胞株
- 彼らのゲノムDNAに組み込まれたTetリプレッサープラスミドを細胞培養株を得ます。ここでプロトコルを例としてpcDNA6 / TRプラスミドをヒト胚性腎臓293T細胞（HEK-293T）を使用して書き込まれます。
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で100mmの組織培養プレート中の種子細胞を、10％FBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、および25mM HEPES、pHが7.3を補充した（本明細書中で完全DMEM）およびOをインキュベート37時/ N＃176; C、5％CO 2。細胞を用いたすべての作業は、滅菌条件下で、生物学的フード内で行われるべきです。
- 、Tetリプレッサー遺伝子の発現を維持培地を吸引および5μg/ mLのブラストサイジンを補充した完全DMEMでそれを置き換えるために。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 細胞は80達すると - 90％のコンフルエンシーに、培地を吸引し、穏やかに（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）DPBSで細胞を2回洗い、37℃に加温しました。
- 穏やかに機械的損傷を引き起こすことなく細胞を持ち上げるために、0.05％トリプシンを含有するDMEM中で培養物をインキュベート1.5分間、37℃に加温しました。
- 完全DMEMの等量トリプシン作用を遮断します。細胞を穏やかに持ち上げ、滅菌チューブにそれらを転送するために、上下にピペットと。
- 5分間、200×gで細胞を遠心。
- 上清を吸引し、1mLの完全DMEMと交換してください。ノーまで上下細胞で溶液をピペット細胞塊を見ることができます。カウントおよび血球計を用いて細胞数を算出します。
- 種子1 - 2×10 5 / mlのブラストサイジンを用いて12mLの完全DMEMを含む100mm組織培養皿で6細胞。彼らは90％の密集度に達するとして、週に2回、細胞を分割します。
3.の細胞に、目的のプラスミドをトランスフェクション
- 50％コンフルエント（〜200,000細胞）を作成し、CO 2で37℃で一晩インキュベートするために十分な、0.9 mLの完全DMEMで調製し、12ウェルプレート中のウェルに上記のように細胞を分割するのと同じ方法で、転送細胞を用いインキュベータ。
- pcDNA4でトランスフェクション混合物を準備/目的の遺伝子を含むことに、不活性プラスミドは最終容量100μLにする（必要な場合）を1μg、3μL脂質トランスフェクション試薬およびDMEMに全DNA量をもたらすために。異なるタンパク質は、異なる効率で発現させるように使用されるプラスミドDNAの最適量は、広く変化します。当選者のためのrophysiological実験は、成功したトランスフェクション4を受ける細胞を可視化するために、トランスフェクションカクテルで哺乳動物発現プラスミド中のEGFPが含まれます。
- 室温で30分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。
- 12ウェルプレートに播種した細胞上に滴下し、トランスフェクション混合物をピペッティングすることにより細胞をトランスフェクトし、DNAとトランスフェクション試薬の均一な分散を確実にするために激しく板岩。細胞は、トランスフェクション時〜80％コンフルエントであるべきです。
- 37℃でトランスフェクトした細胞O / Nをインキュベートし、5％のCO 2。
- 細胞が正常に電気を行う場合は、次の朝、UVランプの下でEGFPの蛍光シグナルを観察することによってトランスフェクションしたことを確認します。
ポリ-D-リジン（PDL）4.めっき細胞カバースリップ/ウェルズ
- 70％イソプロピルエタノール溶液でdousingによって12ミリメートルカバースリップを滅菌します。ドライと単一coverslを配置電気生理学的記録のための24ウェルプレートの各ウェルでip。
- カルシウムイメージング室の各カバースリップまたはウェルの上に0.2mg / mLのPDLソリューション - 0.1の溶液をピペットで。
- 5％CO 2インキュベーター内で37℃で30分間静置します。
- 各洗浄の間に吸引し、細胞培養グレードの二重蒸留水（DDW）で3回洗浄します。最後の洗浄の後、完全に乾燥し、室温で静置します。
- 電気生理学のために、37℃に加温し500μL完全DMEMとを含む各ウェルPDLコーティングしたカバーガラスを埋めます。
- 上記のようにトランスフェクトされた細胞を分割するのと同じ方法を実行します。トリプシン処理およびブロッキング後の細胞を再懸濁した後、電気生理学的記録のために各PDLコーティングしたカバースリップの中心部への転送細胞（または約30,000細胞）の80μL。細胞は、少なくとも1.5時間沈降または5％CO 2インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートすることを可能にします。
- 各ウェルPDLコーティングされたカルシウムイメージングの中心部への細胞のカルシウムイメージング転送とスポット20μL（約20,000細胞）のため。細胞は、少なくとも30分間沈降し、各ウェルに180μLのフルDMEMを追加することができます。
5.遺伝子発現を誘導します
- 製造者の指示に従ってDDW中1mg / mLのドキシサイクリンのストック溶液を調製します。 3週間まで4℃で光から保護原液を保管してください。長期保存のために-20℃でドキシサイクリン原液を保ちます。
- 完全DMEMで新鮮に2μg/ mLの（電気生理学）または3μgの/ mLの（カルシウムイメージング）ドキシサイクリン液を調製し、37℃に温めます。
- 電気生理学的記録、各ウェルへ/ mLのドキシサイクリン液を2μgのピペット500μL/ mlのドキシサイクリン最終濃度1μgをするの。カルシウムイメージングのために、最終的なconcentraを作るために各ウェルに3μgの/ mLのドキシサイクリン溶液100μLを追加1μg/ mLのドキシサイクリン化。誘導の時間を書き留めます。
- 37℃での誘導のための所望の時間インキュベートし、5％CO 2。
タンパク質発現の6キャリブレーションタイムライン
- カルシウムイメージング5、10を介してタンパク質発現のキャリブレーション
- リンゲル液（140mMの塩化ナトリウム、2.5のKCl、1.8mMのCaCl 2を、NaOHで7.4に調整した2mMの硫酸マグネシウム、20mMのHEPES、pH値）を準備し、37℃に温めます。
- リンゲル液中にチャネルアゴニストの飽和濃度を準備します。細胞と細胞外液を含有するカルシウムイメージングチャンバーに添加したときにアゴニストの量が希釈されるので、アゴニストの所望の最終濃度の量を倍増。これはまた、コントロールに各ウェル重要で浴溶液の量になります。
- D中の非イオン性F-127 20％W / Vの溶液を調製しますMSO。非イオン性F-127が溶解するまで40℃に溶液を加熱します。 RTで非イオン性F-127ソリューションを保存し、使用前に40℃に温めます。非イオン性F-127は、水溶液中で、このようなのFura-2のような蛍光イオン指示薬のアセトキシメチル（AM）エステルの分散を助けるために使用されます。
- 培地を吸引とのFura-2AMのローディング溶液（2を補充したリンゲル液 - 3μMのFura-2AM、0.02 mg / mlで非イオン性F-127及び10mM D-グルコース）と交換してください。
- 暗所で室温で60分間インキュベートします。
- 吸引除去のFura-2AM液および細胞外色素を除去するためにリンゲル+ 10mMのD-グルコース溶液で細胞を洗浄します。二回、この手順を繰り返します。
- 各ウェルに200μLのリンゲル+ 10mMのD-グルコース溶液を残し、暗所で室温で30分間インキュベートします。
- 顕微鏡のノーズピースの上にステージ上室を置き、ホルダーで固定します。
- ランプ、カメラや顕微鏡の電源をオンにし、510 nmのwavファイルでの発光を検出するためのFura-2フィルタを選択elength。
- 所望の倍率を調節し、選択したフィールド内のセルを集中。
- 闇の中で、背景光を減算し、露光時間を設定します。
- 所望の速度と340と380 nmの波長で励起し、それらによってフラ-2負荷細胞のレコード蛍光応答で画像のサンプリングを設定します。 340/380信号の比は、TRPV1活性のためにも、このように細胞内Ca 2+濃度とするための指標です。
- TRPV1の発現レベルを評価するために、1μMカプサイシンの最終飽和濃度を作成するために、ピペットで200μLのリンゲル液中に2μMカプサイシンを追加します。
- 誘導時間に応じTRPV1応答を分析し、目的のタンパク質のためのプロトコルを決定します。
- パッチクランプ法4、11の全細胞構成を使用して、異種系でタンパク質の発現を調節します。
- トンを準備彼は、NaOHでpH7.4に調整さ（mm）140のNaCl、2.3のKCl、2のMgSO 4、5 HEPES、5 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）の溶液を、風呂。
- 細胞外液中のチャネルアゴニストの飽和濃度の準備をします。
- 4MΩ - 2の抵抗に1.10ミリメートルと火ポリッシュの内径（ID）でガラス電極を引き出します。
- （MM）130のKCl、4のNaClのピペット溶液を調製し 、MgSO 4 2は、0.5のCaCl 2は 、1 EGTA、10 HEPESをKOHでpH 7.2に調整しました。使用前にピペット溶液をフィルタリングします。各実験の前に、単一、ファイアーポリッシュガラスピペットは戻って、少なくとも分間ピペット溶液にチップを浸漬することによって満たされ、その後、同じピペット溶液で満たされた注射器を用いて溶融延伸チップを用いて充填されています。
- ゆっくり室温で約2 mLの浴溶液で満たされた35ミリメートルのプラスチックシャーレによくから播種した細胞を持つ単一のPDLコートしたカバースリップを持ち上げます。 EPの下で観察しますI-蛍光顕微鏡。
- 落射蛍光顕微鏡で可視化されるように調製カバーガラス上で、EGFP陽性細胞を見つけて、可視化フィールドの中央に移動します。
- マイクロマニピュレータのピペットホルダーに充填されたピペットを取り付け、細胞内ピペット溶液の汚染を避けるために、システムに正圧の少量を注入します。ちょうどGFP上記にそれを下げる - 陽性細胞を、適切な抵抗値をチェックします。
- ピペットは、細胞に接触するように、ガラスピペットと細胞膜の間GΩシールを作成するために、負圧の少量を適用します。
- 吸引の短い、鋭いパルスで、ピペットは、細胞の細胞内内容物と接触することができ、細胞膜を破ります。
- それぞれ、5 kHzから0.5α - 全細胞にアンプモードを切り替えて、1にベッセルフィルタと出力ゲインを下げます。
- 飽和に対する電流応答を記録電圧ランプまたはギャップフリープロトコルを使用してチャネルアゴニストの濃度。
- 発現効率が異なるタンパク質の間で変化するため、異なる誘導の長さの時間を使って録音を繰り返します。
- 単一チャネル記録4のための理想的な誘導時間を決定します。
- ピペット溶液として、NaOHでpH7.4に調整し、（mM）の溶液を調製150のNa-グルコン酸、15のNaCl、5 EGTA、10 HEPES。浴溶液の場合は、ステップ6.2.1からの溶液を使用しています。
- ID 0.86ミリメートルのガラスピペットのファイアーポリッシュ10の抵抗に使用して繰り返して細胞全体の手順 - 12MΩを、-40 mVの電位を保持している設定。
- 前述したように、膜上にシールを作成し、膜を破裂。
- マイクロマニピュレーターを使用して、離れた細胞由来の膜パッチでピペットを持ち上げます。
- 膜パッチを含むピペットに直接次の灌流システムを配置します。
- より低いTそれぞれ、5 kHzから10α - 彼は2にフィルタと出力ゲインをベッセル。
- パッチが応答に応じて1つまたは複数のチャネルを含んでいる場合、評価、膜パッチ上にアゴニストの飽和濃度を灌流。
- 成功した細胞に適用される誘導時間に対して記録シングルチャネルパッチの数を分析します。所望の結果に応じた誘導時間を調整します。
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Representative Results
素早く誘導発現のモデルを作成するために、我々は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TR）を発現するHEK293細胞を使用した（ 例えば、T-REX-293）、およびCMVプロモーターおよびマルチクローニング部位との間のテトラサイクリンオペレーター配列（のtetO）を含有するベクター（ 例えば、のpcDNA4 / TO）。 TREX-293細胞にトランスフェクトした場合にTRがのtetOに結合するように、のpcDNA4 / TOにおける目的遺伝子の発現が抑制されます。培地にドキシサイクリンを添加すると、このようにしてトランスフェクトされたタンパク質の発現を可能にする、TR-のtetO相互作用を防止します。ラットTRPV1（rTRPV1）の発現を制御するためには、まず、上記のプロトコルを使用してベクトルに/のpcDNA4にこのチャネルの遺伝子を挿入しました。次に、T-REX-293細胞は、プロトコルの点3の手順に従って、プラスミドTO / rTRPV1-のpcDNA4をトランスフェクトしました。トランスフェクション後、rTRPV1発現は、1μ（ドキシサイクリンの存在下で細胞をインキュベートすることによって誘導されました4時間 - 1グラム/ mLで）。重要なことには、別のドキシサイクリン濃度は、所望の発現率を達成することができます。我々は、そのアゴニスト、カプサイシンを適用することにより、各時点でrTRPV1発現レベルを評価するために、電気生理学およびカルシウムイメージング法を用いました。生細胞のカルシウムイメージングを使用して、 図 1に示すように 、カプサイシン適用後の細胞内カルシウムレベルは、より長い誘導時間とともに徐々に増加します。非誘導細胞の活性化は、細胞の培地成分における基礎TR活性の漏れ、プラスミドの過剰発現、又は残留テトラサイクリンに起因する可能性があります。次に、mVの+80 -80 mVの間に電圧ランプを印加し、パッチクランプ技術の全細胞構成を使用して、細胞からの電流を記録しました。 図 2は、より高い電流振幅が長い誘導時間で得られることを示しています。 4時間の誘導での電流振幅の飽和がconsisteですNTカルシウム応答に見られる飽和を有する（ 図1）。最後に、我々は、パッチクランプ法の外アウト構成でrTRPV1発現レベルを分析しました。イオンチャネルの構造 - 機能の研究における主要な問題の一つは、単一チャネル分析のために適切な発現レベルに達しています。公開された単一のrTRPV1コンダクタンス4に基づいて、記録された電流振幅は、切除されたパッチのチャネルの数を決定しました。 図 3に示すように 、ドキシサイクリンのインキュベーション時間に比例してパッチ増加のチャネル数。誘導の1時間後、我々は（8から0）任意のチャネル活性を検出することができませんでした。しかし、両方の二次元および3時間の時点で、私たちは同じような成功率で、単一チャネル活性を記録しました。注目すべきは、2時間でほとんどのパッチは応答しませんでしたが、3時間でほとんどのパッチはシングル・ツー・マルチ - チャンネルの活性を示しました。誘導の3時間後に複数のチャネルを記録する可能性が高く、従って、単一のチャンネルからの電流を記録するための最適な誘導時間は、提示条件の下で2〜3時間の間です。一緒に、これらの結果は、イオンチャネルの発現が厳密に制御し、このプロトコルを使用して、一過性トランスフェクションの後に調節することができることを示しています。
TRPV1の活性化の図1.応答のカルシウムイメージングを通じて可視化されるように、誘導時間に応じて増加します。 （A）T-REX-293細胞を一過（ '基礎'）前とカプサイシン（2μM）適用後、rTRPV1を表現する擬似カラー画像を。白いバーは30μmで表します。スケールバーは、細胞内カルシウムレベルを示しています。 （B）に示すように処理されたトランスフェクトされたT-REX-293細胞における細胞内カルシウムレベルの経時変化A.で各グラフは、50カプサイシン感受性細胞の平均を表します。誘導時間との関係でカプサイシン応答の段階的増加に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. TRPV1全細胞パッチクランプ記録に誘導時間を増加させた結果としての電流が増加します。 （A）T-REX-293からの全細胞記録は、一過性に-40mVの保持電位でrTRPV1でトランスフェクトしました。細胞を、示された時間のために、ドキシサイクリン（1μg/ ml）で誘導され、その後、カプサイシン（ 'キャップ'; 1μM;赤いバー）に曝露しました。 11の独立した録音 - 6の代表的なトレースが示されています。 A.の統計に示されるように細胞全体の振幅を表す（B）の平均/分散ドットプロットが誘発しました群間の有意性は、アル*** P≤0.001を示し、有意な（ - 11細胞N = 6）統計的にないNS-多重比較を用いてANOVAにより決定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TRPV1レコーディングでシングルチャネルパッチの図3.成功率は、誘導時間に依存しています。 T-REX-293から（A）社外アウト録音を一時50 mVの保持電位でrTRPV1でトランスフェクトしました。細胞を、指示された時間のドキシサイクリン（1μg/ ml）で誘導し、カプサイシン（「キャップ」、1μM;赤色棒）に曝露しました。 9独立した録音 - 6の代表的なトレースが示されています。 （B）の平均切除したパッチなどのチャネル数を表す/スキャッタドットプロットグループ間のA.統計的有意に示す*** P≤0.001を表し、統計的に有意な（N = 6から9細胞）ではないNS-多重比較、とANOVAを用いて測定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
トランスフェクションは、発現の一貫性および安定性を改善するために多くの異なるバリエーションを有するタンパク質の発現研究のために広く使用されるプロトコルです。一過性トランスフェクション試薬が容易、簡単に目的の細胞およびタンパク質は、トランスフェクションの時点で一晩時間以内に分析することができるプロトコルを使用するように提供しています。分析のモードは、このような電気生理学2の単一チャネル記録として、タンパク質発現の一貫したレベルを必要とする場合残念ながら、このアプローチは、予測不可能なことができます。あるいは、テトラサイクリン抑制性発現系で安定細胞株は、対象12のタンパク質の発現レベルを制御する方法を提供するために開発されています。このアプローチは、ドキシサイクリンなどのテトラサイクリン由来のサプリメント、の導入により培養液中の全ての細胞の一貫性のある表現を提供します。これはタンパク質レベルの一貫性と正確な制御を可能にするが、トンタンパク質8の多種多様を研究する安定な細胞株を確立するに行く彼の時間と労力は、それが不便で不利になります。
ここで紹介するプロトコルが提供され、現在のトランスフェクションプロトコルへの中道のソリューションを提供しています。長々と複雑な手順を回避しながら、一過Tetリプレッサーを有する細胞内に制御可能なプロモーターの下で遺伝子をトランスフェクションすることにより、我々は、制御可能な発現を達成することができます。ここでは、カルシウムイメージングと電気生理学的解析と非選択的陽イオンチャネルTRPV1を使用しました。ドキシサイクリンを1μg/ mLの（ - 3図1）で3時間インキュベーション-私たちは、単一チャネル分析のためのこの特定のタンパク質の制御された発現のための理想的な誘導時間は2の間であることがわかりました。より広範な規模では、この技術は、目的の任意のタンパク質に適用することができます。このプロトコルはまた、ときにLAR発現を制御するソリューションを提供しています異なるタンパク質またはタンパク質配列における変異のGE範囲は関心のある各変異体のための安定な細胞株を作成することは非現実的です。重要なことは、しながら、ここでの結果は、このように各タンパク質のキャリブレーションおよび発現時間が大幅に13を異なります、各遺伝子は、その個人や特定の翻訳と人身売買のペースを持って、TRPV1の発現のために適用可能な最適な時間および濃度を表します。
この技術は、制御された発現に便利なソリューションを提供していますが、それは制限がないわけではありません。 Tetリシステムを保有するのみ市販の細胞株は、これらの特定の細胞系が実行される分析のタイプに適していない場合、問題を提示し、このシステムで使用することができます。安定にトランスフェクトされた株と比較して、別の落とし穴は、すべての細胞がトランスフェクションを受け、従って、全ての細胞が目的のタンパク質を発現することです。全体的に、我々は、タンパク質Eを制御するための便利な方法を提供しています生物医学研究の広い配列に適用することができ、異種システムでXPRESSION。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、イスラエル科学財団[助成1721年から1712年、1368年から1312年、および1444年から1416年]（APへの）によってサポートされていました。 APはBrettlerセンターとDavid R.ブルームセンター、薬局の学校、エルサレムのヘブライ大学と提携しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
| NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
