Summary
Studera jonkanaler genom ett heterologt uttrycka systemet har blivit en kärntekniken i biomedicinsk forskning. I detta manuskript, presenterar vi en tidseffektiv metod för att uppnå hårt kontrollerad jonkanalen expression genom att utföra transient transfektion under kontroll av en inducerbar promotor.
Abstract
Transfektion, leveransen av främmande nukleinsyror i en cell, är ett kraftfullt verktyg i proteinforskning. Genom denna metod kan jonkanaler undersökas genom elektrofysiologiska analys, biokemisk karakterisering, mutationsstudier, och deras effekter på cellulära processer. Transienta transfektioner erbjuda ett enkelt protokoll i vilka proteinet blir tillgänglig för analys inom några timmar till dagar. Även om denna metod uppvisar en relativt enkel och tids effektiva protokollet, är en av de kritiska komponenterna kalibrering av uttryck av genen av intresse för fysiologiska relevanta nivåer eller nivåer som är lämpliga för analys. För detta ändamål har många olika tillvägagångssätt som erbjuder förmågan att kontrollera uttrycket av den intressanta genen uppstått. Flera stabila cell transfektion protokoll ett sätt att permanent införa en gen av intresse i det cellulära genomet under reglering av en tetracyklin styrd transcriptionell aktivering. Även om denna teknik ger tillförlitliga uttrycksnivåer, varje gen av intresse kräver några veckors kvalificerat arbete, bland annat kalibrering av ett dödande kurva, val av cellkolonier, och totalt sett mer resurser. Här presenterar vi ett protokoll som använder övergående transfektion av Transient Receptor Potential ning kanal subfamily V medlem 1 (TRPV1) gen i ett inducerbara systemet som ett effektivt sätt att uttrycka ett protein på ett kontrollerat sätt som är viktigt i jonkanalen analys. Vi visar att användningen av denna teknik, har vi möjlighet att utföra kalcium avbildning, hela cellen, och en kanal analys med kontrollerade kanalnivåer som krävs för varje typ av datainsamling med en enda transfektion. Sammantaget ger detta en replikerbar teknik som kan användas för att studera jonkanaler struktur och funktion.
Introduction
Heterologt uttrycka system är ett av de mest använda tekniker för att studera en mängd cellulära funktioner 1. Deras låg endogen proteinprofil, minimala underhållsbehov, tillförlitlig tillväxt och förmåga att ta upp och uttrycka främmande DNA har gjort cellinjer såsom humana embryonala njur (HEK293) och kinesisk hamsterovarie (CHO) nästan nödvändig för biologisk forskning 2, 3. Forskningsområden med hjälp av heterologa system inkluderar membranproteiner, intracellulär signalering och enzymatisk aktivitet. Efter transfektion av främmande DNA in i cellen, kan utföras många olika former av analys, inklusive elektro, ratiometrisk kalcium avbildning, western blöt, etc. 4, 5.
På grund av det stora utbudet av potentiella tillämpningar för heterologa expressionssystem, många different reagens och produkter har utvecklats för att använda dessa celler och deras egenskaper 6. DNA leveranssystem som övergående eller permanent integrera främmande DNA in i celler för att studera exogena proteinet har blivit en av de mest populära och användbara verktyg för biologisk forskning. Mer specifikt är transient transfektion av DNA i en cell i stor utsträckning som en enkel, rättfram process som kräver relativt lite tid och material. Dessutom är andelen framgångsrika celler som genomgår transfektion hög 7. Denna teknik är mycket pålitlig när de kombineras med en markörgen, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), och kan användas för många olika tekniker, såsom kalcium avbildning och elektrofysiologi 5. Men tyvärr, transient uttrycka DNA i värdceller kommer med några stora fallgropar, inte minst att expressionsnivån per cell är opålitlig. Antalet kopior av plasmid-DNA tas up per cell är okontrollerbar, alltså uttryck mellan enskilda experiment kan variera kraftigt två. Denna fråga blir betydande när antingen försöker reproducera fysiologiska förhållanden, eller utföra exakta datainsamlingstekniker.
Som en lösning på de komplikationer som nämnts ovan, stabil transfektion protokoll har utformats i vilka en gen av intresse kan infogas i genomet hos en cell under strikt kontroll av en inducerbar promotor, såsom en tetracyklin-repressor-expressionssystem, vilket garanterar en enda kopia av plasmiden integreras i genomet i varje cell och uttrycks endast efter induktion av transkriptionsmekanismen, till exempel, i närvaro av doxycyklin. Även om detta löser hinder av inkonsekventa proteinuttrycksnivåer, förlorar denna metod att underlätta för snabbt och relativt enkelt protokoll för transienta transfektioner. Inrättande av en stabil cellinje tar minst ett par veckor i which måste man kalibrera en dödande kurvsats av särskilda antibiotika för att upprätthålla proteinuttryck och säkerställa integration av vektorn och skickligt välja och odla cellkolonier. Sammantaget tar betydligt mer tid och ansträngning med en lägre framgång 8.
Här presenterar vi en mellan protokoll som bygger på styrkan i både av de populära transfektion alternativ för att ge ett enkelt och effektivt sätt att kontrollera expressionsnivåer i alla inducerbara cellinje. Under upprätthållande av celler med en inducerbar tet-system, vi transient transfektera vår gen av intresse, Transient Receptor Potential katjon kanalunderfamiljen V medlem 1 (TRPV1), ligeras in i en vektor som homologt kan kombinera med den repressorsystemet. På detta sätt kan genen introduceras i cellerna utan börjar att uttrycka. Endast med tillsats av doxycyklin inte genen börjar uttrycka, vilket tillåter oss att kalibrera nivåerna av protein expression enligt tekniken eller nivåer som observerats i fysiologiska betingelser. Vår protokoll undviker också långa komplikationer i samband med att generera en stabilt uttryckande cellinje. Vi börjar med att visa de förändrade nivåer av TRPV1 aktivering på kalcium avbildning från un-inducerad genom fyra timmars induktion och hur ökningen av intracellulära kalciumnivåer korrelerar. Vi duplicera sedan protokollet i konfigurationen hela cellen i patch clamp-tekniken, visar ökande ström med ökande tid av induktion. Slutligen presenterar vi exempel på enkanaliga elektrofysiologiska inspelningar, och visar att denna teknik är speciellt användbar för kontrollerad expression när man letar efter insamling exakta uppgifter grundar sig på enskilda enheter av proteinet. Genom våra protokoll, erbjuder vi ett bekvämt sätt att kontrollera proteinuttryck i heterologa system samtidigt som man undviker långa cellodlings komplikationer, vilket ger ett sätt att kontrollera förhållanden mellan experiment och ge more repliker resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ligering Genen av intresse i den undertryck Site Vector
- Skaffa en inducerbar vektor såsom pcDNA5 / FRT / TILL eller pcDNA4 / TO.
- Analysera den intressanta genen för eventuella potentiellt mottagliga restriktionsställen i mitten av genen som också finns med i det multipla kloningsstället av den valda vektorn genom in silico DNA-analys programvara 4.
- Med användning av standard-överlappande PCR-tekniker 4, flankerar genen av intresse med två utvalda restriktionsenzym-igenkänningsställen (som inte finns i genen av intresse), den första införas före startkodonet, och den andra efter stoppkodonet.
- Smälta både vektorn och sätt med restriktionsenzymer (som väljs i steg 1,2) vid enzymer "arbetstemperatur under en timme, följt av tillsats av en enhet kalvintestinalt fosfatas (CIP) och vektorn reaktionen endast under 30 minuter i syfte att undvika själv- ligering.
- Ladda den digererade DNA på en 1% agarosgel och separera de kluvna segmenten genom elektrofores 9.
- Med hjälp av UV-ljus, skärs med ett blad bitar av gel som innehåller de önskade segmenten av vektor och infoga som skall ligeras.
- Extrahera DNA-segment från agarosgelen bitar (med kommersiellt tillgängliga DNA-extraktion kit) och mäta deras slutkoncentration av spektrofotometer vid 260 nm.
- Ligate genen av intresse i den inducerbara valda vektorn genom användning av T4 ligasenzym vid rumstemperatur under 20 minuter. För att öka sannolikheten av insatsen ligera med vektorn, använda en 3: 1 molärt förhållande av insatsen: vektorn. För kontroll, förbereda en ligeringsreaktion som bara innehåller vektorn.
- För bakteriell transformation, tillsätt 10 ng vektor ensam och vektor + gen i 50 mikroliter kompetenta E. coli. Inkubera röret på is under 30 minuter följt av 45 sekunder inkubation vid 42 ° C. Placera omedelbart tillbakapå is i två minuter och överföra de transformerade bakterier till 500 mikroliter LB-medium. Inkubera under en timme vid 37 ° C under omrörning vid 220 rpm.
- För selektion av framgångsrikt transformerade bakterierna, plattan 100 mikroliter av varje reaktion (som beskrivs i 1,9) på en preparerad LB-agarplatta innehållande det lämpliga antibiotikumet (t.ex., 100 mikrogram / ml ampicillin vid användning pCDNA4 / TR).
- Tillåta att växa över natten vid 37 ° C. Plattorna kan förvaras vid 4 ° C i upp till två veckor efter tätt linda dem i plast paraffin film.
- Lyfta individuella kolonier med användning av en 10 mikroliter spets, och tillåta att växa över natten i 3 ml LB + antibiotikum medium vid 37 ° C under omrörning vid 220 rpm. Bakterier med DNA av intresse kan frysas (-20 ° C) för korttidslagring genom centrifugering av LB och bakterier vid 11.000 xg och suga ut supernatanten. Långtidslagring kräver frysning av bakterierna som glycerolstam vid -80 ° C.
- Extrahera DNA through mini-prep och mät den slutliga koncentrationen av spektrofotometer vid 260 nm 5.
- Bekräfta framgångsrik insättning av genen av intresse genom att sekvensera det renade konstruktionen 4. Alternativt skulle diagnostisk klyvning av konstruktionen genom restriktionsenzymer med användning av elektrofores för att separera de avskurna segmenten och utvärdera deras närvaro och längd också användas för detta ändamål fyra.
2. Odling cellinjer som uttrycker TetR
- Skaffa en cellodlingslinje hyser en Tet-repressor plasmid införlivas deras genomiska DNA. Häri protokollet kommer att skrivas med mänskliga embryonala njur 293T-celler (HEK-293T) hyser pcDNA6 / TR plasmid som ett exempel.
- Utsädes celler i 100 mm vävnadsodlingsplatta med Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin, och 25 mM HEPES, pH 7,3 (häri: Fullständig DMEM) och inkubera O / N vid 37 &# 176; C och 5% CO2. Allt arbete med celler bör göras i ett biologiskt huva under sterila betingelser.
- För att bibehålla uttrycket av Tet-repressorgen, aspirera mediet och ersätta den med full DMEM kompletterat med 5 mikrogram / ml blasticidin. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
- När cellerna når 80-90% konfluens, aspirera mediet och försiktigt tvätta cellerna två gånger med DPBS (utan kalcium och magnesium) värmdes till 37 ° C.
- För att försiktigt lyfta cellerna utan att orsaka mekanisk skada, inkubera kulturen i DMEM innehållande 0,05% trypsin värmdes till 37 ° C under 1,5 min.
- Blockera trypsin action med en lika stor volym Full DMEM. pipett försiktigt upp och ned för att lyfta cellerna och överföra dem till ett sterilt rör.
- Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten och ersätta den med en ml Full DMEM. Pipettera lösningen med cellerna upp och ner tills ingencellklumpar kan ses. Räkna och beräkna antalet celler genom att använda en hemocytometer.
- Utsäde 1 - 2 x 10 6 celler i 100 mm vävnadsodlingsskål innehållande 12 ml Fullständig DMEM med 5 | ig / ml blasticidin. Split cellerna två gånger i veckan när de når 90% konfluens.
3. transfektera plasmiden av intresse i celler
- Med användning av samma metod för att dela upp celler såsom beskrivits ovan, överföringsceller till brunnar i en 12-brunnars platta framställd med 0,9 ml Fullständig DMEM, tillräckligt för att göra 50% konfluenta (~ 200000 celler) och inkubera över natten vid 37 ° C i en CO 2 inkubator.
- Förbered en transfektion blandning med pcDNA4 / TO innehåller genen av intresse, en inert plasmid att få den totala DNA uppgår till 1 mikrogram (vid behov), 3 il lipid transfektion reagens och DMEM att göra den slutliga volymen 100 mikroliter. Den optimala mängden av plasmid-DNA som skall användas varierar kraftigt som olika proteiner uttrycka i olika effektivitet. för utvaldarophysiological experiment inkluderar EGFP i däggdjurs expressionsplasmid i transfektion cocktail för att visualisera celler som framgångsrikt genomgår transfektion 4.
- Inkubera transfektion blandningen vid RT under 30 min.
- Transfektera cellerna genom pipettering transfektionsblandningen droppvis till de strukna cellerna i 12-brunnar och rock plattan kraftigt för att säkerställa en homogen dispersion av DNA och transfektion reagens. Celler bör vara ~ 80% konfluenta vid tidpunkten för transfektion.
- Inkubera de transfekterade cellerna O / N vid 37 ° C och 5% CO2.
- Kontrollera att cellerna framgångsrikt transfekterades genom att observera fluorescenssignalen av EGFP under UV-lampa följande morgon om utför elektrofysiologi.
4. utstrykning av celler på poly-D-lysin (PDL) Täckglas / Wells
- Sterilisera 12 mm täck genom dousing med 70% isopropyl etanollösning. Torr och placera en enda coverslip i varje brunn i en 24-brunnars platta för elektrofysiologiska inspelning.
- Pipett en lösning av 0,1-0,2 mg / ml PDL lösningen på varje täck eller brunn i en kalcium avbildning kammare.
- Låt stå i 30 min vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Tvätta med cellodlingsgrad dubbel destillerat vatten (DDW) tre gånger, aspire mellan varje tvätt. Efter den slutliga tvättningen, torka ordentligt och låt sitta vid RT.
- För elektrofysiologi, fylla varje brunn innehållande en PDL belagda täckglas med 500 mikroliter Fullständig DMEM värmdes till 37 ° C.
- Utföra samma förfarande för att dela upp de transfekterade cellerna såsom beskrivits ovan. Efter återsuspendering av celler efter trypsinbehandling och blockering, överföring 80 mikroliter av celler (eller cirka 30000 celler) till centrum av varje PDL belagda täckglas för elektrofysiologi inspelning. Låt cellerna sedimentera under minst 1,5 timmar eller inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- För kalciumöverföring avbildning och plats 20 mikroliter av celler (cirka 20.000 celler) till mitten av varje PDL belagda kalcium avbildning väl. Låt cellerna att nöja sig med åtminstone 30 minuter och tillsätt 180 mikroliter komplett DMEM till varje brunn.
5. Induktion Gene Expression
- Bered en doxycyklin förrådslösning av 1 mg / ml i DDW i enlighet med tillverkarens instruktioner. Håll stamlösning skyddas från ljus vid 4 ° C i upp till tre veckor. För långtidsförvaring hålla doxycyklin förrådslösning vid -20 ° C.
- Bered en färsk 2 mikrogram / ml (elektro) eller 3 mikrogram / ml (kalcium imaging) doxycyklin lösning i full DMEM och värm till 37 ° C.
- För elektrofysiologiska inspelningar, pipett 500 mikroliter av 2 mikrogram / ml doxycyklin lösning till varje brunn för att göra en slutlig koncentration av 1 mikrogram / ml doxycyklin. För kalcium avbildning, tillsätt 100 | il av 3 | ag / ml doxycyklin lösning till varje brunn för att göra en slutlig koncenning av 1 mikrogram / ml doxycyklin. Skriv ner timme induktion.
- Inkubera i den önskade mängden tid för induktion vid 37 ° C och 5% CO2.
6. Kalibrera Tidslinje av Protein Expression
- Kalibrera proteinuttryck genom Kalcium Imaging 5, 10
- Förbereda Ringers lösning (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2 mM MgSO 4, 20 mM HEPES, pH justerat till 7,4 med NaOH) och värm till 37 ° C.
- Förbered mättande koncentrationer av kanalagonist i Ringers lösning. Eftersom mängden agonist späds vid tillsats till de kalciumavbildningskamrarna innehållande cellerna och extracellulär lösning, dubbla beloppet av den önskade slutliga koncentrationen av agonist. Detta gör också mängden badlösningen i varje brunn kritiskt att kontrollera.
- Bered en lösning av nonjoniskt F-127 20% vikt / volym i DMSO. Värm lösningen till 40 ° C tills nonjoniskt F-127 är upplöst. Lagra den nonjoniska F-127 lösning vid RT och värm till 40 ° C före användning. Nonjoniskt F-127 används för att hjälpa dispergera acetoximetyl- (AM) estrar av fluorescerande jon indikatorer såsom Fura-2 i vattenlösningar.
- Aspirera medium och ersätta det med Fura-02:00 laddningslösning (Ringers lösning med tillsats av 2-3 | iM Fura-02:00, 0,02 mg / ml icke-jonisk F-127 och 10 mM D-glukos).
- Inkubera under 60 min vid RT i mörker.
- Aspirera Fura-2AM lösningen och tvätta celler med Ringers + 10 mM D-glukos-lösning för att avlägsna extracellulära färgämne. Upprepa detta steg två gånger.
- Lämna 200 mikroliter Ringers + 10 mM D-glukos-lösning i varje brunn och inkubera under 30 min vid RT i mörker.
- Placera kammaren på scenen ovanför mikroskop munstycke och säkra den med hållare.
- Slå på lampan, kamera och mikroskop och välj Fura-2 filter för att detektera emission vid 510 nm wavelength.
- Justera för önskad förstoring och fokusera celler i det markerade området.
- I mörker, subtrahera bakgrundsljus och ställa exponeringstiden.
- Ställ provtagning bild i önskad takt och spela in fluorescens respons Fura-2 laddade celler genom spännande dem vid 340 och 380 nm våglängd. Förhållandet 340/380 signaler är en indikator för intracellulära Ca2 + -koncentrationen och därmed även för TRPV1 aktivitet.
- Lägg 2 pM kapsaicin i 200 mikroliter Ringers lösning genom pipettering för att skapa en slutlig mättnadskoncentration av 1 | iM kapsaicin för att utvärdera uttrycksnivån för TRPV1.
- Analysera TRPV1 svar enligt induktionstiden och bestämma protokollet för proteinet av intresse.
- Justera proteinuttryck i heterologa system som använder konfiguration hela cellen i patch clamp teknik 4, 11.
- förbereda than bad lösning av (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES och 5 2- (N-morfolino) etansulfonsyra (MES), justerades till pH 7,4 med NaOH.
- Förbered mättande koncentrationer av kanalagonist i extracellulära lösning.
- Dra glaselektroder med en innerdiameter (ID) av 1,10 mm och brand polska till ett motstånd av 2-4 MQ.
- Bered en pipett lösning av (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl2, 1 EGTA och 10 HEPES justerades till pH 7,2 med KOH. Filtrera pipetten lösning före användning. Före varje experiment används en enda, brand-polerat glaspipett tillbaka fylls genom att sänka spetsen i pipetten lösningen under minst en minut, och sedan fyllas med användning smält och sträcks spets med en spruta fylld med samma pipett lösning.
- Lyft försiktigt en enda PDL belagda täckglas med de strukna cellerna från brunnen till en 35 mm plastpetriskål fylld med cirka 2 ml badlösning vid RT. Provet i en epi-fluorescensmikroskop.
- Leta upp en EGFP positiv cell, som visualiseras med epifluorescent mikroskop, på den förberedda täck och flyttas till mitten av det visualiserade området.
- Fästa den fyllda pipetten till pipetten innehavaren av mikromanipulator, och injicera en liten mängd av positivt tryck in i systemet för att undvika kontaminering av den intracellulära pipett lösning. Sänka den till precis ovanför GFP - positiv cell, kontroll för korrekt motstånd.
- Som pipetten vidrör cellen, applicera en liten mängd av negativt tryck för att skapa en GΩ tätning mellan glaspipett och cellmembranet.
- Med en kort, skarp puls av sugning, bryta cellmembranet, vilket gör att pipetten för att komma i kontakt med de intracellulära innehållet i cellen.
- Växla förstärkaren läget till hela cellen, och sänk Besselfiltrets och utgångsförstärkning till 1-5 kHz och 0.5α respektive.
- Spela in aktuellt gensvar på mättandekoncentrationer av kanalagonist med hjälp av spänningsramper eller gap fri protokoll.
- Eftersom uttryckseffektivitet växla mellan olika proteiner, upprepa inspelningar med olika induktions längd gånger.
- Fastställande perfekt induktionstiden för enkanaliga inspelningar 4.
- Bered en lösning av (mM) 150 Na-glukonat, 15 NaCl, 5 EGTA, och 10 HEPES, justerades till pH 7,4 med NaOH, såsom en pipett lösning. För badlösningen använda lösningen från steg 6.2.1.
- Upprepa hela cell proceduren med ID 0,86 mm glaspipetter brand poleras till ett motstånd på 10-12 MQ och ställa hållpotential på -40 mV.
- Skapa en tätning på membranet såsom beskrivits tidigare och spräcka membranet.
- Använda mikromanipulator, lyfter pipetten med membran patch bort från cellen.
- Positionera perfusionssystemet direkt intill pipetten innehållande membran plåstret.
- lägre than Besselfiltrets och utgångsförstärkning till 2-5 kHz och 10α, respektive.
- BEGJUTA mättande koncentrationer av agonist på membranet lapp, bedömning av om plåstret innehåller en eller flera kanaler i enlighet med svaret.
- Analysera antalet enkanaliga patchar framgångsrikt spelats mot induktionstiden tillämpas på celler. Justera induktionstiden i enlighet med de önskade resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att snabbt skapa en inducerbar uttryck modell, gjorde vi användning av HEK293-celler som uttrycker Tetracyklin repressor protein (TR) (t.ex. T-Rex-293) och vektorer som innehåller tetracyklin operatorsekvenser (Teto) mellan CMV-promotorn och det multipla kloningsstället (t.ex., pcDNA4 / TO). När den transfekteras in i TREX-293-celler, är uttrycket av genen av intresse i pcDNA4 / TO tryckt, såsom TR binder till TetO. Sätta doxycyklin till mediet förhindrar TR-TetO interaktion, vilket möjliggör uttryck av den transfekterade proteinet. Att kontrollera uttrycket av rått-TRPV1 (rTRPV1) vi först införde denna kanals gen i en pcDNA4 / TO vektor med användning av den ovan beskrivna protokollet. Därefter tillsattes t-rex-293-celler transfekterade med rTRPV1- pcDNA4 / plasmid enligt stegen i punkt 3 i protokollet. Efter transfektion fick rTRPV1 expression inducerades genom inkubering av cellerna i närvaro av doxycyklin (1 μg / ml) under 1-4 h. Viktigare, kan olika doxycyklinkoncentrationer användas för att uppnå önskad expressionshastigheten. Vi använde elektrofysiologiska och kalcium avbildningsmetoder för att utvärdera rTRPV1 expressionsnivån vid varje tidpunkt genom att tillämpa sin agonist, capsaicin. Som visas i figur 1, med hjälp av live-cell Kalcium Imaging är intracellulär kalciumnivå efter capsaicin ansökan ökade gradvis med längre induktions gånger. Aktivering av oinducerade celler kan tillskrivas en basal läcka i TR-aktivitet, överuttryck av plasmiden, eller kvarvarande tetracyklin i cellerna mediakomponenter. Därefter spelade vi strömmar från celler med hjälp av konfiguration hela celler av patch clamp teknik att applicera spänning ramper mellan -80 mV till 80 mV. Figur 2 visar att högre ström amplituder erhålles med längre induktionstider. Mättnaden i strömamplituden vid 4 h induktion är consistent med mättnads ses i kalciumsvar (Figur 1). Slutligen analyserade vi rTRPV1 expressionsnivåer i utanför-out konfigurationen av patch-clamp-tekniken. En av de stora svårigheterna med att studera jonkanal struktur-funktions når expressionsnivåer som är lämpliga för en enda kanal analys. Baserat på den publicerade enhetligt rTRPV1 konduktans 4, var den inspelade strömamplituden som används för att bestämma antalet kanaler i exciderade plåstret. Såsom visas i fig 3, antalet kanaler i plåstret ökar proportionellt mot det doxycyklin inkubationstiden. Efter en timmes induktion, kunde vi inte att upptäcka eventuella kanalaktiviteten (0 av 8). Men i båda två- och tre-timmars tidpunkter vi spelade enda kanal aktivitet i liknande framgångar. Notera, medan två timmar flesta fläckar inte svara i tre timmar flesta patchar visade enda till multi kanals aktivitet. Chanserna att spela in flera kanaler efter tre timmar av induktion är hög, vilket den optimala induktionstiden för att spela in ström från en enda kanal är mellan två till tre timmar under de presenterade betingelser. Tillsammans visar dessa resultat att uttryck av jonkanaler kan hårt kontrollerad och reglerad efter övergående transfektion med hjälp av detta protokoll.
Figur 1. Response av TRPV1 Aktivering ökar enligt Induktion tid, som visualiseras genom Kalcium Imaging. (A) Pseudo-färgade bilder av T-Rex-293-celler transient uttryck rTRPV1, före (Basal) och efter capsaicin (2 M) ansökan. Vita staplar representerar 30 pm. Skala bar indikerar nivåer av intracellulär kalcium. (B) ändras med tiden av intracellulära kalciumnivåer i transfekterade T-Rex-293 celler som behandlats som visasi A. Varje diagram representerar ett genomsnitt av 50 capsaicin känsliga celler. Notera stegökningar kapsaicin svar i förhållande till induktionstiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. TRPV1 strömmen ökar som en följd av den ökande Induktions Tid i helcell Patch Clamp Inspelningar. (A) Hela-cell inspelningar från T-Rex-293 transfekterades med rTRPV1 vid en hållpotential av -40 mV. Celler inducerades med doxycyklin (1 mikrogram / ml) under den angivna tiden och sedan utsatt för capsaicin (Cap ', 1 ^ M, röd stapel). Visas är en representativ spår av 6 - 11 oberoende inspelningar. (B) Medelvärde / scatter-punktdiagram som representerar den helcell-amplitud evoked såsom visas i A. Statistical signifikans mellan grupper bestämdes med ANOVA med multipla jämförelser, där *** betecknar p ≤0.001 och NS inte statistiskt signifikanta (n = 6 - 11 celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. framgång på Single Channel Patch i TRPV1 Recordings är beroende av induktion tid. (A) Utanför ut inspelningar från T-Rex-293 transfekterades med rTRPV1 vid en hållpotential av 50 mV. Celler inducerades med doxycyklin (1 mikrogram / ml) under den angivna tiden och utsattes för capsaicin (Cap ', 1 ^ M, röd stapel). Visas är en representativ spår av 6 - 9 oberoende inspelningar. (B) Medelvärde / scatter-punktdiagram som representerar antalet kanaler i utskurna lapp somvisas i A. Statistisk signifikans mellan grupper bestämdes med ANOVA med multipla jämförelser, där *** betecknar p ≤0.001 och NS inte statistiskt signifikanta (n = 6 - 9-celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfektion är en allmänt använd protokoll för proteinuttryck och forskning, med många olika varianter för att förbättra uttryck konsistens och stabilitet. Transienta transfektionsreagens erbjuda en enkel, lätt att använda protokoll där cellen och proteinet av intresse kan analyseras inom några timmar till över natten från tiden för transfektion. Tyvärr detta tillvägagångssätt kan vara oförutsägbar när läget av analys kräver en jämn proteinuttryck, såsom enkanaliga inspelningar i elektrofysiologi 2. Alternativt har stabila cellinjer under tetracyklin undertryckexpressionssystem har utvecklats för att erbjuda ett sätt att kontrollera expressionsnivån av proteinet av intresse 12. Detta tillvägagångssätt ger konsekvent uttryck av alla celler i en kultur med införandet av en tetracyklin härledd supplement, såsom doxycyklin. Även om detta ger en konsekvent och exakt styrning av proteinnivåer, than tid och ansträngning som går in att upprätta en stabil cellinje gör det besvärligt och ofördelaktigt när man studerar en mängd olika proteiner 8.
Protokollet presenteras här erbjuder en mitten-of-the-road lösning på de nuvarande transfektion protokoll som erbjuds. Genom transient transfektion av en gen enligt en kontrollerbar promotor i celler som har en Tet-repressor, kan vi uppnå kontrollerbar uttryck och samtidigt undvika långdragna och komplicerade förfaranden. Här använde vi den icke-selektiva katjon kanal TRPV1 med kalcium avbildning och elektrofysiologi analys. Vi fann att den ideala induktionstid för reglerad expression av detta specifika protein för enstaka kanal analysen var mellan 2-3 h inkubation med 1 ^ g / ml doxycyklin (figurerna 1 - 3). I ett bredare perspektiv, kan denna teknik också tillämpas på alla protein av intresse. Detta protokoll erbjuder också en lösning för att styra uttryck när en large rad olika proteiner eller mutationer i proteinsekvenser är av intresse och skapa en stabil cellinje för varje variant är opraktiskt. Viktigt, medan resultaten här representerar den optimala tiden och tillämpliga koncentrationer för TRPV1 uttryck, har varje gen sin individuella och specifika översättning och handel takt, alltså kalibrerings och uttrycks gånger för varje protein kommer att skilja sig avsevärt 13.
Även om denna teknik erbjuder en bekväm lösning på kontrollerad expression, är det inte utan begränsningar. Enda kommersiellt tillgängliga cellinjer som härbärgerar Tet-systemet kan användas med detta system, som presenterar ett problem om dessa särskilda cellinjer är olämpliga för den typ av analys som skall utföras. En annan fallgrop jämfört med stabilt transfekterade linjer är att inte alla celler undergår transfektion, och således inte alla celler uttrycker proteinet av intresse. Sammantaget erbjuder vi ett bekvämt sätt att kontrollera protein eXpression i ett heterologt system som kan tillämpas på ett brett spektrum av biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 och 1444/16] (AP). AP är anknutet till Brettler Center och David R. Bloom Center, School of Pharmacy, Hebrew University i Jerusalem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
| NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
