Summary
Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.
Abstract
Transfectie, de afgifte van vreemde nucleïnezuren in een cel, is een krachtig instrument eiwitonderzoek. Via deze methode kan ionkanalen worden onderzocht door middel van elektrofysiologische analyse, biochemische karakterisering, mutatie-studies, en hun effecten op cellulaire processen. Transiënte transfecties bieden een eenvoudige protocol waarin het eiwit beschikbaar voor analyse binnen enkele uren tot dagen. Hoewel deze methode geeft een relatief eenvoudig en tijdbesparend protocol, een van de belangrijkste componenten kalibreren van de expressie van het gen van belang fysiologisch relevante niveaus of niveaus die geschikt zijn voor analyse. Hiervoor verschillende benaderingen die het vermogen om de expressie van het gen van belang onder controle kunnen ontstaan. Verschillende stabiele celtransfectie protocollen bieden een manier om een gen van belang vast te introduceren in het cellulaire genoom onder de regulatie van een door tetracycline gecontroleerde transcriptionele activering. Hoewel deze techniek levert betrouwbare expressie levels, elk gen van belang vereist een paar weken van geschoold werk met inbegrip van de ijking van een moord curve, de selectie van de cel kolonies, en de algehele meer middelen. Hier presenteren we een protocol dat transiënte transfectie van de Transient Receptor Potential kationenkanaal subfamilie V lid 1 (TRPV1) gen gebruikt in een induceerbaar systeem als een efficiënte manier om een eiwit in een gecontroleerde wijze die essentieel ionkanaal tot expressie analyse. We tonen aan dat het gebruik van deze techniek kunnen wij calcium imaging, volledige cellen en enkelkanaals analyses uit te voeren met gecontroleerde kanaalniveaus voor elke type informatieverzameling bij een transfectie. Kortom, dit levert een repliceerbare techniek die kan worden gebruikt om ionkanalen structuur en functie te bestuderen.
Introduction
Heteroloog tot expressie systemen is een van de meest gebruikte technieken om een veelheid aan cellulaire functies 1 bestuderen. Hun lage endogene eiwit profiel, minimale onderhoud, betrouwbare groei, en het vermogen om op te nemen en uit te drukken vreemd DNA hebben cellijnen zoals humane embryonale nier (HEK293) en Chinese hamster ovarium (CHO) bijna essentieel voor biologisch onderzoek 2, 3 gemaakt. Gebieden van onderzoek met behulp van heterologe systemen omvatten membraaneiwitten, intracellulaire signalering en enzymatische activiteit. Na transfectie van vreemd DNA in de cel, kan veel verschillende vormen van analyse worden uitgevoerd, waaronder elektrofysiologie, calcium ratiometrische imaging, western blot, etc. 4, 5.
Vanwege het brede scala aan mogelijke toepassingen voor heterologe expressie systemen, veel different reagentia en producten zijn ontwikkeld om deze cellen en hun kwaliteiten 6 gebruiken. DNA levering systemen die kortstondig of permanent vreemd DNA te integreren in de cellen om exogeen eiwit studeren is uitgegroeid tot een van de meest populaire en handige tools voor het biologisch onderzoek. Meer specifiek wordt tijdelijk transfecteren van DNA in een cel op grote schaal gebruikt als een eenvoudige, eenvoudig proces dat relatief weinig tijd en materiaal vergt. Bovendien, het slagingspercentage van cellen die transfectie ondergaan hoog is 7. Deze techniek is zeer betrouwbaar in combinatie met een merkergen zoals groen fluorescent eiwit (GFP), en kan worden gebruikt voor veel verschillende technieken zoals calcium imaging en elektrofysiologie 5. Helaas echter tijdelijk expressie brengen van DNA in gastheercellen geleverd met een aantal valkuilen, niet in het minst het expressieniveau per cel is onbetrouwbaar. Het aantal kopieën van het plasmide-DNA genomen up per cel oncontroleerbaar, waardoor de uitdrukking tussen afzonderlijke experimenten kan sterk variëren 2. Deze kwestie wordt significant wanneer ofwel een poging om fysiologische omstandigheden te repliceren, of het uitvoeren van nauwkeurige dataverzamelingstechnieken.
Als oplossing voor de bovengenoemde stabiele transfectie protocollen ontworpen zijn complicaties waarin een gen van interesse in het genoom van een cel onder strenge controle van een induceerbare promoter, kan worden ingebracht, zoals een tetracycline repressor expressiesysteem, waardoor een kopie van de plasmide geïntegreerd in het genoom van elke cel en wordt alleen tot expressie gebracht na inductie van de transcriptie mechanisme, bijvoorbeeld in aanwezigheid van doxycycline. Hoewel dit lost de obstakels van inconsistente eiwit expressie levels, deze methode verliest het gemak van een snelle en relatief eenvoudig protocol van voorbijgaande transfecties. De oprichting van een stabiele cellijn duurt minstens een paar weken in whicfoon moet doden kromme specifieke antibiotica ingesteld op de eiwitexpressie stand te houden en integratie van de vector uitstekend selecteren en groeien celkolonies kalibreren. Over het algemeen neemt dit aanzienlijk meer tijd en moeite met een lagere slagingspercentage 8.
Hier introduceren we een tussenliggende protocol dat is gebaseerd op de sterke punten van beide van de populaire transfectie opties om een eenvoudige en effectieve manier om uitdrukking te beheersen in elke induceerbare cellijn te verschaffen. Met behoud van cellen met tet induceerbare systeem, we tijdelijk transfecteren onze gen van belang, Transient Receptor Potential kationenkanaal subfamilie V lid 1 (TRPV1), geligeerd in een vector die homoloog kan combineren met de repressor systeem. Op deze wijze kan het gen in de cellen worden ingevoerd zonder beginnen te drukken. Alleen met de toevoeging van doxycycline heeft het gen begint te drukken, zodat we het eiwitgehalte expr kalibrerensessieschijven volgens de techniek of niveaus waargenomen bij fysiologische omstandigheden. Ons protocol vermijdt ook langdurige complicaties in verband met het genereren van een stabiel tot expressie cellijn. We beginnen met het tonen van de veranderende niveaus van TRPV1 activering in calcium beeldvorming van-un geïnduceerd door middel van vier uur van de inductie en hoe de stijging in de intracellulaire calcium niveaus correleert. Vervolgens hebben we dupliceren het protocol in de gehele cel configuratie van de patch clamp techniek, met de toenemende stroom met toenemende tijd van inductie. Tenslotte, laten we voorbeelden van enkel kanaal elektrofysiologie opnamen en tonen dat deze techniek is bijzonder bruikbaar voor gecontroleerde expressie bij het zoeken naar exacte gegevensverzameling op basis van individuele eenheden van het eiwit. Door middel van ons protocol, bieden wij een handige manier om eiwit expressie in heterologe systemen aan te sturen terwijl het vermijden van langdurige celkweek complicaties, aldus een manier om de omstandigheden tussen de experimenten en bieden mo controleopnieuw reproduceerbare resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ligeren van het gen van belang in de onderdrukbare Site van Vector
- Het verkrijgen van een induceerbare vector, zoals pcDNA5 / FRT / TO of pcDNA4 / TO.
- Analyseer het gen van belang voor alle potentieel gevoelige restrictieplaatsen in het midden van het gen die ook zijn opgenomen in de meervoudige kloneringsplaats van de vector gekozen door in silico DNA analysesoftware 4.
- Onder toepassing van standaard PCR-technieken overlap 4, flankeren het gen van interesse met twee geselecteerde restrictie-enzym herkenningsplaatsen (die niet zijn gevonden in het gen van belang), de eerste ingevoegd vóór het startcodon en de tweede na het stopcodon.
- Digest zowel de vector en plaats met restrictie-enzymen (gekozen in stap 1,2) bij bedrijfstemperatuur enzymen 'gedurende een uur, gevolgd door toevoeging van een eenheid kalfsingewanden fosfatase (CIP) om de vector reactie slechts 30 minuten om zelf te voorkomen ligatie.
- Laad het geknipte DNA op een 1% agarosegel gescheiden en het gesplitste segmenten door elektroforese 9.
- Met UV licht, gesneden met een mes de stukken gel die de gewenste segmenten van de vector en de insert te ligeren.
- Extraheer de DNA-segmenten uit de agarosegel stukken (met in de handel verkrijgbare DNA-extractie kits) en meet de eindconcentratie van spectrofotometer bij 260 nm.
- Ligeren het gen van belang in de induceerbare geselecteerde vector met T4 ligase enzym bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Om de waarschijnlijkheid van het inzetstuk ligeren met de vector verhogen, een 3: 1 molaire verhouding van insertie: vector. Voor controle stelt een ligatiereactie die alleen de vector bevat.
- Voor bacteriële transformatie, voeg 10 ng vector alleen en vector + gen in 50 pl competente E. coli. Incubeer de buizen op ijs gedurende 30 minuten, gevolgd door 45 seconden incubatie bij 42 ° C. Onmiddellijk plaats terugop ijs gedurende twee minuten en breng de getransformeerde bacteriën op 500 pi LB-medium. Incubeer gedurende één uur bij 37 ° C onder roeren bij 220 rpm.
- Voor selectie van succesvol getransformeerde bacteriën, plaat 100 ul van elke reactie (zoals beschreven in 1.9) op een geprepareerde LB agar plaat die het geschikte antibioticum (bijvoorbeeld 100 ug / ml ampicilline bij gebruik pCDNA4 / TR).
- Laat overnacht groeien bij 37 ° C. Platen kunnen gedurende twee weken worden bewaard bij 4 ° C door ze strak verpakken in plastic folie paraffine.
- Til individuele kolonies met een 10 pi tip, en laat een nacht groeien in 3 ml LB + antibioticum-medium bij 37 ° C onder roeren bij 220 rpm. Bacteriën DNA van belang kan worden ingevroren (-20 ° C) voor korte termijn opslag door centrifugeren van de LB en bacteriën bij 11.000 xg en het supernatant afzuigen. Langdurige opslag moet bevriezen van de bacteriën glycerol voorraden bij -80 ° C.
- Extract DNA through mini-prep en meet de uiteindelijke concentratie spectrofotometer bij 260 nm 5.
- Bevestig succesvolle insertie van gen van belang door sequentiebepaling van het gezuiverde construct 4. Als alternatief zou diagnostische digestie van het construct met behulp van restrictie-enzymen elektroforese om de gesneden segmenten scheiden en hun aanwezigheid te evalueren en de lengte ook worden gebruikt voor dit doel 4.
2. Het kweken van cellijnen die TetR
- Het verkrijgen van een celcultuur lijn herbergt een Tet-repressor plasmide opgenomen in hun genoom DNA. Hierin zal het protocol worden geschreven Humane embryonale nier 293T-cellen (HEK-293T) herbergt pcDNA6 / TR plasmide als voorbeeld.
- Zaadcellen in 100 mm weefselkweekplaat met Dulbecco's Gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine, 2 mM L-glutamine en 25 mM HEPES, pH 7,3 (hierna: Volledige DMEM) en incubeer O / N op 37 &# 176, C en 5% CO2. Alle werkzaamheden met cellen moet gebeuren in een biologisch kap onder steriele omstandigheden.
- Om de expressie van Tet-repressor gen te handhaven, zuig het medium en vervangen volledige DMEM aangevuld met 5 ug / ml blasticidine. Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Zodra cellen bereikt 80-90% confluentie, zuig het medium en voorzichtig was de cellen tweemaal met DPBS (zonder calcium en magnesium) verwarmd tot 37 ° C.
- Om de cellen til zonder dat mechanische schade, incubeer de kweek in DMEM met 0,05% trypsine verwarmd tot 37 ° C gedurende 1,5 min.
- Blokkeer de trypsine actie met een gelijk volume van volledige DMEM. Voorzichtig pipet op en neer om de cellen optillen en overbrengen naar een steriele buis.
- Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant en te vervangen door 1 ml Volledige DMEM. Pipetteer de oplossing met de cellen op en neer tot er geencelklonten zichtbaar. Tellen en het berekenen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Seed 1-2 x 10 6 cellen in 100 mm weefselkweekplaat met 12 ml volledige DMEM met 5 ug / ml blasticidine. Splits de cellen twee keer per week als ze 90% confluentie bereiken.
3. transfecteren van het plasmide in cellen interessante
- Volgens dezelfde methode splitsen cellen zoals hierboven beschreven, overdracht cellen aan putjes in een 12-wells plaat bereid met 0,9 ml volledige DMEM, voldoende om 50% confluent (~ 200.000 cellen) te maken en incubeer overnacht bij 37 ° C in een CO 2 incubator.
- Bereid een transfectie mengsel met pcDNA4 / TO die het gen van belang kan een inert plasmide de totale hoeveelheid DNA 1 ug (indien nodig), 3 pl lipide transfectiereagens en DMEM brengen het eindvolume 100 ul maken. De optimale hoeveelheid plasmide-DNA voor gebruik varieert sterk als verschillende eiwitten tot expressie brengen in verschillende efficiëntie. voor electrophysiological experimenten omvatten EGFP in zoogdierlijke expressieplasmide in de transfectie cocktail om cellen die met succes 4 transfectie ondergaan visualiseren.
- Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Transfecteren cellen door pipetteren het transfectiemengsel druppelsgewijs op de geplateerde cellen in 12-well plaat en de plaat schommelen krachtig tot een homogene dispersie van DNA en transfectiereagens waarborgen. De cellen moeten ~ 80% confluent op het moment van transfectie.
- Incubeer de getransfecteerde cellen O / N bij 37 ° C en 5% CO2.
- Controleer of de cellen met succes werden getransfecteerd door het observeren van het fluorescentiesignaal van EGFP onder een UV-lamp de volgende ochtend als het uitvoeren van elektrofysiologie.
4. Plating Cellen op Poly-D-lysine (PDL) Coverslips / Wells
- Steriliseren 12 mm dekglaasjes door dousing met 70% isopropyl ethanol-oplossing. Droog en plaats een enkel coverslip in elk putje van een 24-wells plaat voor elektrofysiologische opname.
- Pipetteer een oplossing van 0,1-0,2 mg / ml PDL oplossing op elk dekglaasje of putje van een calcium imaging kamer.
- Laat zitten 30 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Wassen met celkweekniveau dubbel gedestilleerd water (DDW) drie keer, opzuigen tussen elke wasbeurt. Na de laatste maal wassen, drogen en laat zitten bij RT.
- Voor electrofysiologie Vul elk putje een PDL dekglaasje bedekt met 500 pl DMEM Volledige verwarmd tot 37 ° C.
- Voer dezelfde methode van het splitsen van de getransfecteerde cellen zoals hierboven beschreven. Na resuspenderen van de cellen na trypsine behandeling en blokkeren, overdracht 80 ul cellen (of ongeveer 30.000 cellen) naar het midden van elke PDL gecoat dekglaasje voor elektrofysiologie opname. Sta cellen bezinken gedurende ten minste 1,5 uur of overnacht incuberen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Voor calcium imaging overdracht en spot 20 pl cellen (ongeveer 20.000 cellen) naar het midden van elke PDL bedekte calcium imaging goed. Laat cellen om zich te vestigen voor ten minste 30 minuten en voeg 180 ul volledige DMEM aan elk putje.
5. Het induceren van genexpressie
- Bereid een doxycycline voorraadoplossing van 1 mg / mL in DDW volgens de instructies van de fabrikant. Houd voorraad oplossing beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken. Voor de lange termijn opslag te houden doxycycline voorraad oplossing bij -20 ° C.
- Reiniging een nieuwe 2 ug / ml (elektrofysiologie) of 3 ug / ml (calcium imaging) doxycycline oplossing volledige DMEM en verwarm tot 37 ° C.
- Voor elektrofysiologische opnames pipet en 500 ul van 2 ug / ml doxycycline oplossing in elk tot een eindconcentratie van 1 ug / ml doxycycline maken. Calcium imaging, voeg 100 ul van 3 ug / ml doxycycline aan elke well om een uiteindelijke concentraties tetie van 1 ug / ml doxycycline. Noteer het uur van inductie.
- Incubeer gedurende de gewenste tijdsduur voor inductie bij 37 ° C en 5% CO2.
6. kalibreren Chronologie van Protein Expression
- Kalibreren van eiwit expressie door middel Calcium Imaging 5, 10
- Bereid Ringer-oplossing (140 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 2 mM MgSO 4, 20 mM HEPES, pH ingesteld op 7,4 met NaOH) en verwarm tot 37 ° C.
- Bereid verzadigende concentraties van het kanaal agonist in Ringer's oplossing. Omdat de hoeveelheid agonist wordt verdund bij toevoeging aan calcium imaging kamertjes met de cellen en extracellulaire oplossing, dubbel zoveel de gewenste eindconcentratie van agonist. Dit maakt ook de hoeveelheid badoplossing in elk putje kritisch controleren.
- Bereid een oplossing van niet-ionische F-127 20% W / V DMSO. Verwarm de oplossing tot 40 ° C tot niet-ionische F-127 wordt opgelost. Bewaar de niet-ionische F-127 oplossing bij kamertemperatuur en verwarm tot 40 ° C voor gebruik. Niet-ionische F-127 wordt gebruikt om dispergeren acetoxymethyl (AM) esters van fluorescente ion indicatoren zoals Fura-2 in waterige oplossingen.
- Aspireren medium en vervangen door Fura-02:00 beladingsoplossing (Ringer's oplossing aangevuld met 2-3 uM Fura-02:00, 0,02 mg / ml niet-ionische F-127 en 10 mM D-glucose).
- Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig Fura-02:00 oplossing en was cellen met Ringer's + 10 mM D-glucose oplossing voor extracellulaire kleurstof te verwijderen. Herhaal deze stap twee keer.
- 200 pl reactie Ringer + 10 mM D-glucose-oplossing in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Plaats de kamer op het podium boven de microscoop neusstuk en zet hem vast met houder.
- Zet de lamp, camera en microscoop en selecteer Fura-2 filter om emissie te detecteren bij 510 nm wavelength.
- Stel de gewenste vergroting en focus cellen in het geselecteerde gebied.
- In het donker, aftrekken achtergrond licht en stel belichtingstijd.
- Stel foto bemonstering op de gewenste snelheid en opnemen fluorescentie respons van Fura-2 geladen cellen door spannende hen bij 340 en 380 nm golflengte. De verhouding van 340/380 signalen is een indicator voor intracellulaire Ca2 + concentratie en dus ook voor TRPV1 activiteit.
- Voeg 2 uM capsaïcine in oplossing 200 pl Ringer door pipetteren tot een uiteindelijke verzadigende concentratie van 1 uM capsaïcine creëren om het expressieniveau van TRPV1 evalueren.
- Analyseer TRPV1 reactie volgens inductietijd en bepaalt protocol voor het eiwit van belang.
- Aanpassing eiwit expressie in heterologe systemen met de gehele cel configuratie van de patch klemtechniek 4, 11.
- Bereid tHij bad oplossing van (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES en 5 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES), pH 7,4 met NaOH.
- Bereid verzadigende concentraties kanaal agonist in extracellulaire oplossing.
- Trek glazen elektroden met een binnendiameter (ID) van 1,10 mm en brand-polish een weerstand van 2-4 MQ.
- Bereid een pipet oplossing van (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO4, 0,5 CaCl2, 1 EGTA en 10 HEPES pH 7,2 met KOH. Filtreer de pipet oplossing vóór gebruik. Vóór elk experiment wordt een enkele, brand-gepolijst glas pipet terug opgevuld door dompelen de tip in de pipet oplossing voor minstens een minuut, en vervolgens gevuld met behulp van gesmolten en uitgerekt tip met een injectiespuit gevuld met dezelfde pipet oplossing.
- Til één PDL gecoat dekglaasje met de vergulde cellen uit de put om een 35 mm plastic petrischaal gevuld met ongeveer 2 ml bad oplossing bij RT. Observeren onder een epi-fluorescentiemicroscoop.
- Lokaliseer een EGFP positieve cellen, zoals gevisualiseerd met de epifluorescerende microscoop, op het voorbereide dekglaasje en naar het midden van het veld gevisualiseerd.
- Bevestig de gevulde pipet om de pipet houder van de micromanipulator en injecteert een kleine hoeveelheid positieve druk in het systeem om verontreiniging van de intracellulaire pipet oplossing voorkomen. Verlagen tot net boven de GFP - positieve cel, het controleren voor een goede weerstand.
- Aangezien de pipet de cel raakt, een kleine hoeveelheid van onderdruk om een GQ afdichting tussen de glazen pipet en celmembraan creëren.
- Met een korte, scherpe puls afzuigapparaat, breken de celmembraan, waardoor de pipet in contact met de intracellulaire inhoud van de cel komen.
- Schakel de versterker modus om hele cellen, en laat de Bessel-filter en de output gain tot 1-5 kHz en 0.5α, respectievelijk.
- Neem de huidige reactie op de verzadigendeconcentraties van het kanaal agonist met behulp van spanning ramps of gap gratis protocol.
- Omdat expressie efficiëntie wisselen tussen verschillende eiwitten, herhaalt u de opnamen met behulp van verschillende inductie lengte maal.
- Het bepalen van ideaal inductie tijd voor single channel opnamen 4.
- Bereid een oplossing van (mM) 150 Na-gluconaat, 15 NaCl, 5 EGTA en 10 HEPES, pH 7,4 met NaOH als pipetoplossing. Voor het bad oplossing, gebruik maken van de oplossing van stap 6.2.1.
- Herhaal gehele cel procedure met behulp van ID 0,86 mm glas pipetten brand-gepolijst tot een weerstand van 10-12 MQ en stel houdt potentieel tot -40 mV.
- Maak een zegel op het membraan zoals eerder beschreven en scheuren van het membraan.
- Met de micromanipulator, til de pipet met de membraanplaat weg van de cel.
- Plaats de perfusie-systeem direct naast de pipet met het membraan patch.
- lagere thij Bessel-filter en de output gain tot 2-5 kHz en 10α, respectievelijk.
- Perfuseren verzadigende concentraties van agonist op de membraanplaat, gaan of de pleister volgens de respons één of meer kanalen.
- Analyseer het aantal single channel pleisters met succes opgenomen tegen de inductie tijd toegepast op de cellen. Stel de inductietijd volgens de gewenste resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om snel een induceerbare expressie model te maken, is gebruikgemaakt van HEK293 cellen die tetracycline repressor eiwit (TR) tot expressie (bijvoorbeeld T-Rex-293) en vectoren die tetracycline operatorsequenties (TetO) tussen de CMV-promoter en de meervoudige kloneringsplaats bevat (bv pcDNA4 / TO). Wanneer getransfecteerd in TRex-293-cellen, wordt de expressie van het gen van interesse in pcDNA4 / TO onderdrukt, zoals TR bindt aan TetO. doxycycline toevoeging aan het medium voorkomt TR-TetO interactie, waardoor de expressie van het getransfecteerde eiwit. Om de expressie van rat TRPV1 (rTRPV1) beheersen we eerst ingebrachte gen's uit dit kanaal in een pcDNA4 / naar vector met behulp van de hierboven beschreven protocol. Vervolgens werden de T-Rex-293 cellen die met de rTRPV1- pcDNA4 / plasmide volgens de stappen in punt 3 van het protocol. Na transfectie werd rTRPV1 expressie geïnduceerd door de cellen te incuberen in aanwezigheid van doxycycline (1 μg / ml) gedurende 1-4 uur. Belangrijk kunnen verschillende concentraties doxycycline worden gebruikt om gewenste expressiesnelheid bereiken. We gebruikten elektrofysiologische en calcium imaging methoden rTRPV1 expressieniveau op elk tijdstip evalueren gedragingen door zijn agonist, capsaïcine. Zoals getoond in figuur 1, waarbij levende cellen calcium imaging wordt intracellulair calciumgehalte na capsaicine toepassing geleidelijk toe met langere inductietijden. Activering van geïnduceerde cellen kunnen worden toegeschreven aan een basaal lek in de TR activiteit overexpressie van het plasmide of residuele tetracycline in de cellen media componenten. Vervolgens namen we stromen van cellen met behulp van de whole-cell configuratie van de patch clamp techniek toe te passen spanning hellingen tussen -80 mV tot +80 mV. Figuur 2 toont dat hogere stroom amplitudes verkregen met langere inductietijden. De verzadiging in de huidige amplitude bij 4 uur inductie consistent de verzadiging waargenomen bij calciumreactie (figuur 1). Tot slot, analyseerden we rTRPV1 expressie niveaus in de outside-out configuratie van de patch-clamp-techniek. Een van de belangrijkste problemen bij het bestuderen van ionkanalen structuur-functie wordt bereikt expressieniveaus geschikt voor één kanaal analyse. Gebaseerd op de gepubliceerde unitaire rTRPV1 geleiding 4, werd het opgenomen stroomamplitude gebruikt om het aantal kanalen in het uitgesneden patch bepalen. Zoals getoond in figuur 3, het aantal kanalen in de pleister neemt evenredig met de doxycycline incubatietijd. Na een uur van inductie, waren we niet in staat om een kanaal te detecteren (0 van de 8). Echter, in zowel twee- en drie-uur tijdstippen noteerden we enkel kanaal activiteit in gelijke slagingspercentages. Van de nota, terwijl in de twee uur de meeste plekken niet reageerden, in drie uur de meeste plekken vertoonde single-to-multi-kanaals activiteit. De kans opnemen meerdere kanalen na drie uren inductie hoog, waardoor de optimale inductietijd stroom opnemen van een enkel kanaal is tussen 02:58 uur onder de omstandigheden weergegeven. Tezamen tonen deze resultaten dat expressie van ionenkanalen nauwkeurig kunnen worden gecontroleerd en gereguleerd na transiënte transfectie met dit protocol.
Figuur 1. Reactie van TRPV1 Activering Verhoogt volgens Inductie Time, zoals gevisualiseerd door middel van Calcium Imaging. (A) Pseudo-gekleurde beelden van T-Rex-293-cellen die tijdelijk uitdrukken rTRPV1, vóór ( 'basale') en na capsaïcine (2 pm) applicatie. Witte balken vertegenwoordigen 30 urn. Schaal balk geeft niveaus van intracellulaire calcium. (B) verandert met de tijd van de intracellulaire calcium niveaus in getransfecteerde T-REX-293 cellen behandeld zoals aangegevenin A. Elke grafiek geeft een gemiddelde van 50 capsaïcine gevoelige cellen. Let op de stapsgewijze verhogingen van capsaïcine responsen in relatie tot inductietijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. TRPV1 Huidige toeneemt als gevolg van toenemende Induction Time in Whole Cell Patch Clamp Recordings. (A) Whole-cell opnames van T-REX-293 tijdelijk met rTRPV1 op een bedrijf potentieel van -40 mV. De cellen werden geïnduceerd met doxycycline (1 ug / ml) gedurende de aangegeven tijd en daarna blootgesteld aan capsaicine ( 'Cap; 1 uM; rode balk). Getoond wordt een vertegenwoordiger spoor van 6-11 onafhankelijke opnames. (B) Mean / scatter-dot plot die de hele cellen amplitude evoked zoals getoond in A. Statistiekal significantie tussen groepen werd bepaald met ANOVA met meerdere vergelijkingen, waarbij *** p ≤0.001 vertegenwoordigt en NS niet statistisch significant (n = 6-11 cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. slagingspercentage van Single Channel Patch in TRPV1 Recordings is afhankelijk van de Inductie Time. (A) Buiten-out opnames van T-Rex-293 tijdelijk met rTRPV1 op een bedrijf potentieel van 50 mV. De cellen werden geïnduceerd met doxycycline (1 ug / ml) gedurende de aangegeven tijd en werden blootgesteld aan capsaicine ( 'Cap; 1 uM; rode balk). Getoond wordt een representatief spoor van 6-9 onafhankelijke opnames. (B) Mean / scatter-dot plot die het aantal kanalen in de uitgesneden patchgetoond in A. statistische significantie tussen de groepen werd bepaald met ANOVA met meerdere vergelijkingen, waarbij *** p ≤0.001 vertegenwoordigt en NS niet statistisch significant (n = 6-9 cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfectie is een veel gebruikte protocol voor eiwitexpressie en onderzoek met veel verschillende variaties expressie consistentie en stabiliteit. Transiënte transfectie reagentia bieden een eenvoudige, makkelijk te protocol waarbij de cel en eiwit van belang in uren gedurende een nacht kan worden geanalyseerd vanaf het moment van transfectie gebruikt. Helaas is deze aanpak kan onvoorspelbaar zijn als de wijze van analyse een consistent niveau van eiwit expressie, zoals de single channel opnamen in elektrofysiologie 2 vereist. Als alternatief zijn stabiele cellijnen onder tetracycline onderdrukbare expressiesysteem ontwikkeld om een manier om het expressieniveau van het gewenste eiwit 12 controle bieden. Deze benadering consistent expressie van alle cellen in een kweek met de introductie van een tetracycline afgeleide supplement, zoals doxycycline. Hoewel dit zorgt voor consistente en nauwkeurige controle van eiwitniveaus, thij tijd en moeite die in naar de oprichting van een stabiele cellijn maakt het lastig en nadelig wanneer het bestuderen van een breed scala aan eiwitten 8.
Het protocol hier gepresenteerde biedt een middle-of-the-road oplossing voor de huidige transfectieprotocollen aangeboden. Door transiënte transfectie van een gen onder een regelbare promotor in cellen bezitten een Tet-repressor, kunnen we expressie regelbaar realiseren zonder langdurige en ingewikkelde procedures. Hier gebruikten we de niet-selectieve kationenkanaal TRPV1 met calcium beeldvorming en elektrofysiologische analyse. We vonden dat het ideale inductietijd voor de gecontroleerde expressie van deze specifieke eiwit eenkanaals analyse was tussen 2-3 uur incubatie met 1 ug / ml doxycycline (figuur 1 - 3). Op grotere schaal, kan deze techniek ook worden toegepast op elk eiwit van interesse. Dit protocol biedt een oplossing voor het regelen expressie wanneer een large waaier van verschillende eiwitten of mutaties in eiwitsequenties van belang zijn en het creëren van een stabiele cellijn voor elke variant is onpraktisch. Belangrijk is, terwijl de resultaten hier de optimale tijd en de van toepassing zijnde concentraties voor TRPV1 uitdrukking te vertegenwoordigen, elk gen heeft zijn individuele en specifieke vertaal- en mensenhandel tempo, waardoor de kalibratie en expressie tijden van elk eiwit zal sterk 13 verschillen.
Hoewel deze techniek biedt een praktische oplossing voor gecontroleerde expressie is niet zonder beperkingen. Enige commercieel beschikbare cellijnen die het op Tet systeem kan worden gebruikt bij dit systeem, hetgeen een probleem geeft als deze specifieke cellijnen zijn ongeschikt voor de soort analyse dat uitgevoerd moet worden. Andere valkuil opzichte stabiel getransfecteerde lijnen is dat niet alle cellen ondergaan transfectie, en dus niet alle cellen brengen het eiwit van interesse. Over het algemeen, bieden wij een handige manier om eiwit e controlexpression in een heteroloog systeem dat kan worden toegepast op een breed scala van biomedisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation [Grants 1721-1712, 1368-1312 en 1444-1416] (AP). AP is aangesloten bij Brettler Center en David R. Bloom Center, School of Pharmacy, de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
| NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
