Summary

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Abstract

Transfektion die Abgabe fremder Nukleinsäuren in eine Zelle, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der Proteinforschung. Durch dieses Verfahren können Ionenkanäle durch elektrophysiologische Analyse biochemische Charakterisierung, Mutationsstudien untersucht werden, und ihre Auswirkungen auf zelluläre Prozesse. Transienten Transfektionen bieten ein einfaches Protokoll, in dem das Protein für die Analyse innerhalb von wenigen Stunden bis Tagen verfügbar wird. Obwohl dieses Verfahren eine relativ einfache und zeitspar Protokoll stellt eine der kritischen Komponenten kalibriert wird, die Expression des Gens von Interesse zu physiologisch relevanten Niveaus oder Ebenen, die für die Analyse geeignet sind. viele verschiedene Ansätze zu diesem Zweck, die die Fähigkeit bieten, die Expression des Gens von Interesse zu steuern entstanden. Mehrere stabile Zelltransfektion Protokolle bieten eine Möglichkeit, um dauerhaft ein Gen von Interesse in das zelluläre Genom unter der Regulierung eines Tetracyclin-kontrollierten TRANSCRIP einführentionalen Aktivierung. Während diese Technik zuverlässig Expressionsniveaus erzeugt, erfordert jedes Gen von Interesse ein paar Wochen der Facharbeit einschließlich Kalibrierung eines Tötungskurve, die Auswahl der Zellkolonien und mehr Ressourcen insgesamt. Hier stellen wir ein Protokoll, das die transiente Transfektion des Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1) -Gens in einem induzierbaren System als eine effiziente Weise verwendet ein Protein, das in einer kontrollierten Weise zu exprimieren, die in Ionenkanalanalyse wesentlich ist. Wir zeigen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir Kalzium-Imaging, ganze Zelle, und Einkanal-Analyse mit gesteuerten Kanalpegel für jede Art der Datensammlung mit einem einzigen Transfektion erforderlich sind. Insgesamt stellt dies eine replizierbare Technik, die verwendet werden können Ionenkanäle Struktur und Funktion zu untersuchen.

Introduction

Heterolog Systeme exprimierenden ist eines der am häufigsten verwendeten Techniken 1 eine Vielzahl von Zellfunktionen zu untersuchen. Ihre geringe endogene Proteinprofil, minimale Wartungsanforderungen, zuverlässige Wachstum und die Fähigkeit zur Aufnahme und zum Ausdruck bringen Fremd – DNA haben Zelllinien wie menschliche embryonale Nieren (HEK293) und chinesischen Hamsters (CHO) hergestellt fast wesentlich für die biologische Forschung 2, 3. Forschungsbereiche mit heterologe Systeme umfassen Membranproteine, intrazelluläre Signal und enzymatische Aktivität. Nach der Transfektion von Fremd – DNA in die Zelle, kann viele verschiedene Formen der Analyse durchgeführt werden, einschließlich der Elektrophysiologie, ratiometrisch Calcium Imaging, Western Blot, etc. 4, 5.

Aufgrund der Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für die heterologe Expressionssysteme, viele different Reagenzien und Produkte wurden 6 dieser Zellen und ihre Qualitäten zu verwenden , entwickelt. DNA-Abgabesysteme, die vorübergehend oder dauerhaft von Fremd-DNA in die Zellen integrieren exogene Protein zu untersuchen hat für die biologische Forschung eine der beliebtesten und nützlichsten Werkzeuge geworden. Genauer gesagt transient in einer Zelle Transfizieren DNA wird als einfache, gerade nach vorne Prozess, der erfordert relativ wenig Zeit und Materialien verwendet. Darüber hinaus ist die Erfolgsrate der Zellen , die die Transfektion unterzogen 7 hoch. Diese Technik ist sehr zuverlässig , wenn sie mit einem Markergen , wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) kombiniert wird , und kann für viele verschiedene Techniken , wie Calcium Abbildungs- und Elektrophysiologie 5 verwendet werden. Doch leider kommt mit einigen großen Gefahren DNA in Wirtszellen transient exprimieren, nicht im geringsten, dass das Expressionsniveau pro Zelle unzuverlässig ist. Die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNA u gemachtp pro Zelle ist unkontrollierbar, so der Ausdruck zwischen den einzelnen Versuchen 2 stark variieren kann. Dieses Problem wird bedeutsam, wenn entweder versuchen, physiologischen Bedingungen zu replizieren, oder präzise Techniken der Datenerhebung durchführen.

Als Lösung für die erwähnt haben Komplikationen oben stabile Transfektion Protokolle entwickelt worden, bei dem ein Gen von Interesse in das Genom einer Zelle unter der strengen Kontrolle eines induzierbaren Promotors eingesetzt werden kann, wie beispielsweise einem Tetracyclin-Repressor-Expressionssystem, gewährleistet eine einzige Kopie des Plasmids integriert in das Genom von jeder Zelle und wird erst nach Induktion des Transkriptionsmechanismus, beispielsweise in Gegenwart von Doxycyclin ausgedrückt. Während dies die Hindernisse inkonsistenter Proteinexpressionsniveaus löst, verliert diese Methode, um die Bequemlichkeit der schnellen und relativ einfaches Protokoll von transienten Transfektionen. eine stabile Zelllinie zur Festlegung dauert wenigstens einige Wochen in which muss man eine Tötung Kurve gesetzt durch spezifische Antibiotika kalibrieren die Proteinexpression zu erhalten und die Integration des Vektors sicherzustellen und geschickt wählen und Zellkolonien wachsen. Insgesamt dauert dies deutlich mehr Zeit und Aufwand mit einer niedrigeren Erfolgsquote 8.

Hier stellen wir ein Zwischenprotokoll, das auf den Stärken der beiden bekannten Transfektion Optionen zieht eine einfache und effektive Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, um die Expressionsniveaus in jeder induzierbaren Zelllinie zu steuern. Während Zellen, die mit einem induzierbaren Tet-System beibehalten wird, transfizieren wir transient unsere Gen von Interesse, Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), in einen Vektor ligiert, der homolog mit dem Repressor-System zu kombinieren. Auf diese Weise kann das Gen in die Zellen eingeführt werden, ohne zu exprimieren beginnen. Nur mit der Zugabe von Doxycyclin beginnt das Gen zu exprimieren, uns erlaubt, die Mengen an Protein expr zu kalibrierenITZUNG nach der Technik oder in physiologischen Bedingungen beobachtet Ebenen. Unser Protokoll vermeidet auch langwierige Komplikationen im Zusammenhang mit einer stabil exprimierenden Zelllinie zu erzeugen. Wir beginnen mit den wechselnden Ebenen der TRPV1-Aktivierung in Kalzium-Imaging von nichtinduzierten über vier Stunden Induktion zeigt und wie der Anstieg der intrazellulären Kalziumspiegel korreliert. Wir dupliziert dann das Protokoll in der gesamten Zellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik, zeigt die zunehmende Strom mit der Zeit der Induktion erhöht wird. Schließlich präsentieren wir Beispiele für Einkanal Elektro Aufnahmen und zeigen, dass diese Technik für kontrollierte Expression besonders nützlich ist, wenn für eine genaue Datenerfassung auf Basis von einzelnen Einheiten des Proteins suchen. Durch unser Protokoll, bieten wir eine bequeme Möglichkeit, Protein-Expression in heterologen Systemen zu steuern, während lange Zellkultur Komplikationen vermieden werden, so dass ein Weg, um Bedingungen zwischen den Experimenten zu steuern und bieten mowieder reproduzierbare Ergebnisse.

Protocol

1. Ligieren des Gens von Interesse in die Reprimierbare Site of Vector Erhalten Sie induzierbaren Vektors wie pcDNA5 / FRT / TO oder pcDNA4 / TO. Analyse das Gen von Interesse für alle potentiell anfällig Restriktionsstellen in der Mitte des Gens, der auch in der multiplen Klonierungsstelle des ausgewählten Vektor 4 durch in silico DNA – Analyse – Software gezeigt werden. Unter Verwendung von Standard Überlappungs – PCR – Techniken 4,<…

Representative Results

Um schnell eine induzierbare Expression Modell zu erstellen, haben wir den Einsatz von HEK293 – Zellen , die Tetracyclin – Repressor – Protein (TR) exprimieren (zB T-Rex-293) und Vektoren , die Tetracyclin – Operatorsequenzen (TetO) zwischen dem CMV – Promotor und die multiple Klonierungsstelle enthalten (beispielsweise pcDNA4 / TO). Wenn transfizierte in TReX-293-Zellen wird die Expression des Gens von Interesse in pcDNA4 / TO drückt, als TR an tetO bindet. Hinzufüge…

Discussion

Transfection ist ein weit verbreitetes Protokoll für die Proteinexpression und Forschung, mit vielen verschiedenen Variationen Ausdruck Konsistenz und Stabilität zu verbessern. Transient Transfektionsreagentien bieten eine einfache, leicht zu verwendende Protokoll, wo die Zelle und Protein von Interesse innerhalb weniger Stunden analysiert werden können, um über Nacht aus der Zeit der Transfektion. Leider kann dieser Ansatz unberechenbar sein , wenn die Art der Analyse 2 ein einheitliches Niv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 und 1444/16] (AP). AP ist mit Brettler Center und David R. Bloom Center, School of Pharmacy, The Hebrew University of Jerusalem angeschlossen.

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
 SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118

NucleoSpin®plasmid
Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

References

  1. Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
  2. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  3. Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
  4. Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
  5. Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
  6. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  7. Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
  8. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
  13. Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).

Play Video

Cite This Article
Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

View Video