Summary

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Published: February 17, 2017
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Summary

異種発現しているシステムを介してイオンチャネルを研究することは、生物医学研究の中核技術となっています。本稿では、誘導性プロモーターの制御下で、一過性トランスフェクションを行うことにより厳密に制御イオンチャネルの発現を達成するために、時間効率的な方法を提示します。

Abstract

トランスフェクションは、細胞への外来核酸の送達は、タンパク質研究の強力なツールです。この方法によって、イオンチャネルは電気生理学的分析、生化学的特徴、突然変異研究、および細胞プロセスへの影響を介して調べることができます。一過性トランスフェクションは、タンパク質が、数時間から数日以内に、分析のために利用可能となるような単純なプロトコルを提供します。この方法は、比較的簡単かつ時間効率的なプロトコルを提示しているが、重要な要素の一つは、分析するのに適している生理学的に適切なレベルまたはレベルの関心対象の遺伝子の発現を較正します。この目的のために、関心対象の遺伝子の発現を制御する能力を提供する多くの異なるアプローチが出現しています。いくつかの安定な細胞トランスフェクションプロトコルは、恒久的に、テトラサイクリン制御transcripの制御下で細胞ゲノム中に目的の遺伝子を導入する方法を提供します的な活性化。この技術は信頼性の高い発現レベルを生成しているが、関心の各遺伝子は、殺害曲線のキャリブレーション、細胞コロニーの選択、および全体的なより多くのリソースを含む、熟練した作業の数週間が必要です。ここでは、イオンチャネルの解析に不可欠である制御された方法でタンパク質を発現するための効率的な方法として、誘導系に一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1(TRPV1)遺伝子の一過性トランスフェクションを使用するプロトコルを提示します。我々は、この技術を用いて、我々は、単一のトランスフェクションでのデータ収集の種類ごとに必要な制御チャネルレベルでカルシウムイメージング、全細胞、および単一チャネル分析を実行することが可能であることを示しています。全体として、これは、イオンチャネルの構造と機能を研究するために使用することができる複製可能な技術を提供します。

Introduction

異種システムを発現する細胞機能1の多数を研究するために最も広く使用されている技術の一つです。それらの低い内因性のタンパク質プロフィール、最小限のメンテナンス要件、信頼性の高い成長、および外来DNAを取り込み、表現する能力は、ヒト胚性腎臓(HEK293)および生物学的研究2、3にほぼ不可欠なチャイニーズハムスター卵巣(CHO)などの細胞株を作りました。異種のシステムを用いた研究の分野は、膜タンパク質、細胞内シグナル伝達、酵素活性を含みます。細胞への外来DNAのトランスフェクションに続いて、分析の多くの異なる形態は、電気生理学、レシオメトリックカルシウムイメージング、ウェスタンブロット、 4、5含む、実施することができます。

異種発現系のための潜在的なアプリケーションの広い配列に、多くのdiffereによる塩基試薬および生成物は、これらの細胞及びそれらの品質6を利用するために開発されています。一過性または恒久的に外因性タンパク質を研究するために、細胞に外来DNAを組み込み、DNAの送達システムは、生物学的研究のための最も人気のあると便利なツールの一つとなっています。具体的には、細胞内に一過性にトランスフェクトするDNAが広く、比較的少しの時間と材料を必要とする単純な、まっすぐ進むプロセスとして使用されています。さらに、トランスフェクションを受けた細胞の成功率は、7高いです。この技術は、緑色蛍光タンパク質(GFP)などのマーカー遺伝子と組み合わせたときに非常に信頼性があり、このようなカルシウムイメージングおよび電気生理学5のような多くの異なる技術のために使用することができます。しかし、残念ながら、一過性DNAを宿主細胞に発現していない細胞あたりの発現レベルの信頼性が低いこと以上に、いくつかの主要な落とし穴が付属しています。プラスミドDNAのコピー数は、Uをとっセル当たりのpは、このように個々の実験間での発現が大幅に2を変えることができ、制御不能です。いずれかの生理学的条件を再現しようとしている、または正確なデータ収集技術を実行すると、この問題が顕著になります。

上記の合併症を解決するように、安定なトランスフェクションプロトコルは、単一のを確実に、テトラサイクリンリプレッサーの発現系として、目的の遺伝子が誘導性プロモーターの厳格なコントロール下で細胞のゲノムに挿入することができるように設計されていますプラスミドのコピーは各細胞のゲノムに組み込まれ、ドキシサイクリンの存在下で、例えば、転写機構の誘導後にのみ発現されます。これは、一貫性のないタンパク質の発現レベルの障害を解決するが、この方法は、一過性トランスフェクションの迅速かつ比較的単純なプロトコルの利便性を失います。安定な細胞株を確立することはwhicで少なくとも数週間かかります時間1は、タンパク質の発現を維持し、ベクターの組み込みを確保し、巧みに選択して、細胞コロニーを成長させるために、特定の抗生物質によって設定された殺害曲線を校正しなければなりません。全体的にこれは、より低い成功率8と有意に多くの時間と労力を要します。

ここでは、任意の誘導性細胞株における発現レベルを制御するためのシンプルで効果的な方法を提供する人気のトランスフェクションのオプションの両方の強みを生かし、中間プロトコルを紹介します。誘導性のtetシステムで細胞を維持しながら、我々は、一過性相同リプレッサーシステムと組み合わせることができるベクターに連結関心の私達の遺伝子、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1(TRPV1)を、トランスフェクション。この方法では、遺伝子が発現し始めずに細胞に導入することができます。唯一のドキシサイクリンを添加した遺伝子は、タンパク質exprのレベルを校正するために私たちにできるように、発現し始めるん生理学的条件下で観察された技術やレベルに応じてession。我々のプロトコルは、安定発現細胞株を生成するに関連付けられている長い合併症を回避することができます。私たちは、誘導および方法細胞内カルシウムレベルの上昇が相関の4時間を通じて非誘導からのカルシウムイメージングにおけるTRPV1の活性化の変化レベルを示すことから始めます。我々は次に、誘導時間の増加に伴って増加する電流を示し、パッチクランプ技術の全細胞構成でプロトコルを複製します。最後に、我々は、単一チャネルの電気生理学的記録の例を提示し、タンパク質の個々の単位に基づいて正確なデータ収集を探しているときに、この技術は、制御された発現のために特に有用であることを示しています。我々のプロトコルを介して、我々は、このように、実験の間に条件を制御し、MOを提供するための方法を提供し、長い細胞培養合併症を回避しながら、異種系におけるタンパク質の発現を制御するための便利な方法を提供します複製可能な結果を​​再度。

Protocol

1.ベクターの抑制性サイトに目的の遺伝子を連結このようなpcDNA5 / FRT / TOまたはのpcDNA4 / TOなどの誘導性ベクターを取得します。 また、 インシリコ DNA解析ソフト4によって選択されたベクターのマルチクローニングサイトで紹介されている遺伝子の途中で任意の潜在的影響を受けやすいの制限部位のために目的の遺伝子を分析します。 標準…

Representative Results

素早く誘導発現のモデルを作成するために、我々は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TR)を発現するHEK293細胞を使用した( 例えば、T-REX-293)、およびCMVプロモーターおよびマルチクローニング部位との間のテトラサイクリンオペレーター配列(のtetO)を含有するベクター( 例えば、のpcDNA4 / TO)。 TREX-293細胞にトランスフェクトした場合に…

Discussion

トランスフェクションは、発現の一貫性および安定性を改善するために多くの異なるバリエーションを有するタンパク質の発現研究のために広く使用されるプロトコルです。一過性トランスフェクション試薬が容易、簡単に目的の細胞およびタンパク質は、トランスフェクションの時点で一晩時間以内に分析することができるプロトコルを使用するように提供しています。分析のモードは、?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、イスラエル科学財団[助成1721年から1712年、1368年から1312年、および1444年から1416年](APへの)によってサポートされていました。 APはBrettlerセンターとDavid R.ブルームセンター、薬局の学校、エルサレムのヘブライ大学と提携しています。

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
 SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118

NucleoSpin®plasmid
Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

References

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Cite This Article
Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

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