Summary

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

Изучение ионных каналов через гетерологично, выражающей системы стало основной техникой в ​​области биомедицинских исследований. В этой рукописи, мы представляем эффективный метод времени для достижения экспрессии канала жестко контролируемой ионной путем выполнения временной трансфекции под контролем индуцируемого промотора.

Abstract

Трансфекция, поставка зарубежных нуклеиновых кислот в клетку, является мощным инструментом в исследованиях белка. С помощью этого метода, ионные каналы могут быть исследованы через электрофизиологического анализа, биохимических характеристик, мутационных исследований, а также их влияние на клеточные процессы. Переходные трансфекцию предлагают простой протокол, в котором белок становится доступным для анализа в течение нескольких часов до нескольких дней. Хотя этот метод представляет относительно простой и эффективный протокол времени, одним из важнейших компонентов калибровки экспрессии представляющего интерес гена в физиологических соответствующих уровней или уровней, которые пригодны для анализа. С этой целью, множество различных подходов, которые предлагают возможность контролировать экспрессию представляющего интерес гена появились. Несколько устойчивых протоколов трансфекции клеток обеспечивают способ постоянно введения гена интереса в клеточный геном под регуляции тетрациклином контролируемой transcripной активации. Хотя этот метод производит надежные уровни экспрессии, каждый ген интерес требует нескольких недель квалифицированной работы, включая калибровку кривой убийства, выбор клеточных колоний, и в целом больше ресурсов. Здесь мы приводим протокол, который использует переходную трансфекцию потенциал катиона канала члена подсемейства V 1 (TRPV1) гена рецептора Переходный в индуцируемого системе как эффективный способ для экспрессии белка контролируемым способом, который имеет важное значение при анализе ионных каналов. Показано, что с помощью этой техники, мы способны выполнить визуализацию кальция, целых клеток, а также анализ одного канала с помощью контролируемых уровней каналов, необходимых для каждого типа сбора данных с одной трансфекции. В целом, это обеспечивает воспроизводимый метод, который может быть использован для изучения структуры и функции ионных каналов.

Introduction

Гетерологично экспрессирующих систем является одним из наиболее широко используемых методов для изучения множества клеточных функций 1. Их низкая эндогенный белковый профиль, минимальные требования к техническому обслуживанию, надежный рост, и способность принимать и экспрессии чужеродной ДНК сделали клеточные линии , такие как эмбриональной почки человека (HEK293) и яичника китайского хомячка (СНО) почти существенное значение для биологических исследований , 2, 3. Направления исследований с использованием систем гетерологичной включают мембранные белки, внутриклеточный сигнализацию и ферментативную активность. После трансфекции чужеродной ДНК в клетку, множество различных форм анализа могут быть выполнены, в том числе и электрофизиологических, логометрической визуализации кальция, вестерн – блоттинга и т.д. 4, 5.

Благодаря широкому спектру потенциальных приложений для гетерологичных систем экспрессии, многие differeнт реагенты и продукты были разработаны , чтобы использовать эти клетки и их свойства 6. Системы доставки ДНК, которая транзиторно или постоянно интегрируют чужеродной ДНК в клетки для изучения экзогенный белок стал одним из самых популярных и полезных инструментов для биологических исследований. Более конкретно, скоротечно трансфекцию ДНК в клетку широко используется в качестве простой, прямой процесс, который требует относительно мало времени и материалов. Кроме того, вероятность успеха клеток , которые подвергаются трансфекции высок 7. Этот метод очень надежным в сочетании с маркерным геном , такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), и может быть использован для множества различных методов , таких как изображения кальция и электрофизиологических 5. К сожалению, хотя, скоротечно экспрессии ДНК в клетки-хозяева приходит с некоторыми крупными ловушками, ни в малейшей степени, что уровень экспрессии в клетке является недостоверной. Число копий ДНК плазмиды взяты Uр на одну клетку неуправляема, таким образом , выражение между отдельными экспериментами может сильно различаться 2. Эта проблема становится существенной, когда либо пытается повторить физиологические условия, или при выполнении точных методов сбора данных.

В качестве решения осложнений, упомянутых выше, стабильные протоколы трансфекции были разработаны, в котором ген, представляющий интерес может быть вставлена ​​в геном клетки под жестким контролем индуцируемого промотора, такого как система экспрессии репрессор тетрациклина, что обеспечивает единый копия плазмиды интегрирует в геном каждой клетки и выражается только после индукции механизма транскрипции, например, в присутствии доксициклина. В то время как это решает препятствия непоследовательных уровней экспрессии белка, этот метод теряет удобство быстрой и относительно простой протокол переходных трансфекциях. Создание стабильной клеточной линии занимает по меньшей мере несколько недель в whicч необходимо откалибровать кривую убийства набор специфическими антибиотиками, чтобы поддерживать экспрессию белка и обеспечивают интеграцию вектора и умело выбирать и выращивать клеточные колонии. В целом , это занимает значительно больше времени и усилий с более низкой вероятностью успеха 8.

Здесь мы вводим промежуточный протокол, который опирается на сильные стороны обоих популярных вариантов трансфекции, чтобы обеспечить простой и эффективный способ контролировать уровни экспрессии в любой индуцируемого клеточной линии. Сохраняя клетки с индуцибельной системой ТЕТ мы скоротечно трансфекцию наш интерес ген, потенциальные катиона канала подсемейства V элемент 1 (TRPV1) Переходный рецепторной лигируют в вектор, который может гомологичной в сочетании с системой репрессора. Таким образом, ген может быть введен в клетки, не имеющие начала выражать. Только с добавлением доксициклин делает ген начинают выражать, что позволяет калибровать уровни белка выражession в соответствии с методикой, или уровней, наблюдаемое в физиологических условиях. Наш протокол также позволяет избежать длительных осложнений, связанных с формированием стабильно экспрессирующей клеточной линии. Мы начинаем показывать изменяющиеся уровни активации TRPV1 в визуализации кальция из ун-индуцированных через четыре часа индукции и, как повышение уровня внутриклеточного кальция коррелирует. Затем мы дублируем протокол в конфигурации всей ячейки техники патч зажима, показывающий увеличением тока с увеличением времени индукции. И, наконец, мы приводим примеры отдельных записей электрофизиологических канала, и показывают, что эта методика особенно полезна для контролируемого выражения при поиске точного сбора данных на основе отдельных единиц белка. С помощью нашего протокола, мы предлагаем удобный способ контролировать экспрессию белка в гетерологичных системах, избегая длительных осложнений культивирования клеток, обеспечивая тем самым способ контролировать условия между экспериментами и обеспечить моповторно воспроизводимые результаты.

Protocol

1. лигирования представляющего интерес гена в репрессируемый Сайт Vector Получить индуцируемый вектор, такой как pcDNA5 / FRT / TO или pcDNA4 / TO. Анализ интересующего гена для любых потенциально восприимчивых сайтов рестрикции в середине гена , который также представлен в сайт множестве…

Representative Results

Для того, чтобы быстро создать индуцируемый модель экспрессии, мы использовали клетки НЕК293 , которые выражают Тетрациклин белок – репрессор (TR) (например, T-REX-293) и векторы, содержащие последовательности оператора тетрациклина (Teto) между промотором CMV и сайт множест…

Discussion

Трансфекция широко используемый протокол для экспрессии белка и исследования, с множеством различных вариаций для улучшения консистенции и стабильности экспрессии. Переходные трансфекции реагенты предлагают простой, легкий в использовании протокол, в котором клетка и интерес белок…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Израильского научного фонда [гранты 1721/12, 1368/12 и 1444/16] (АП). AP является филиалом Brettler Центра и Дэвид Р. Блум центр, школа фармации, Еврейский университет в Иерусалиме.

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
 SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118

NucleoSpin®plasmid
Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

References

  1. Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
  2. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  3. Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
  4. Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
  5. Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
  6. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  7. Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
  8. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
  13. Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).

Play Video

Cite This Article
Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

View Video