Summary
El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.
Abstract
La transfección, la entrega de ácidos nucleicos extraño en una célula, es una herramienta poderosa en la investigación de proteínas. A través de este método, los canales iónicos pueden ser investigados por medio del análisis electrofisiológico, caracterización bioquímica, los estudios mutacionales, y sus efectos sobre los procesos celulares. Las transfecciones transitorias ofrecen un protocolo simple en el que la proteína se convierte en disponible para el análisis dentro de unas pocas horas a días. Aunque este método presenta un protocolo eficiente relativamente sencillo y el tiempo, uno de los componentes críticos es calibrar la expresión del gen de interés a niveles fisiológicos relevantes o niveles que son adecuados para el análisis. Con este fin, han surgido muchos enfoques diferentes que ofrecen la capacidad de controlar la expresión del gen de interés. Varios protocolos de transfección de células estables proporcionan una manera de introducir de forma permanente un gen de interés en el genoma celular bajo la regulación de una trascripción controlado por tetraciclinala activación cional. Si bien esta técnica produce niveles de expresión fiables, cada gen de interés requiere de algunas semanas de trabajo cualificado incluyendo la calibración de una curva de muerte, selección de colonias de células, y en general más recursos. Aquí se presenta un protocolo que utiliza la transfección transitoria del gen 1 canal catiónico miembro potencial subfamilia V Transient Receptor (TRPV1) en un sistema inducible como un medio eficaz para expresar una proteína de una manera controlada que es esencial en el análisis del canal iónico. Se demuestra que el uso de esta técnica, que son capaces de realizar las imágenes de calcio, células enteras, y el análisis de un solo canal con niveles de los canales controlados requeridos para cada tipo de recolección de datos con una única transfección. En general, esto proporciona una técnica replicable que puede ser usado para estudiar la estructura y la función de los canales iónicos.
Introduction
Heteróloga expresa sistemas es una de las técnicas más utilizadas para el estudio de una multitud de funciones celulares 1. Su perfil bajo proteína endógena, los requisitos mínimos de mantenimiento, el crecimiento fiable, y la capacidad de captar y expresar ADN foráneo han hecho líneas celulares tales como embrionarias de riñón humano (HEK293) y de ovario de hámster chino (CHO) casi imprescindible para la investigación biológica 2, 3. Las áreas de investigación incluyen el uso de sistemas heterólogos proteínas de membrana, la señalización intracelular y la actividad enzimática. Después de la transfección de ADN extraño en la célula, muchas formas diferentes de análisis se pueden realizar, incluyendo electrofisiología, imágenes de calcio radiométrico, western blot, etc. 4, 5.
Debido a la amplia gama de posibles aplicaciones para los sistemas de expresión heteróloga, muchos diferereactivos y productos nt se han desarrollado para utilizar estas células y sus cualidades 6. Los sistemas de administración de ADN que se integran de forma transitoria o permanente de ADN extraño en células para estudiar la proteína exógena se ha convertido en una de las herramientas más populares y útiles para la investigación biológica. Más específicamente, transitoriamente la transfección de ADN en una célula se utiliza ampliamente como un proceso hacia delante simple, recta que requiere relativamente poco tiempo y materiales. Por otra parte, la tasa de éxito de las células que se someten a transfección es alta 7. Esta técnica es muy fiable cuando se combina con un gen marcador tal como la proteína fluorescente verde (GFP), y se puede utilizar para muchas técnicas diferentes, tales como imágenes de calcio y electrofisiología 5. Lamentablemente, sin embargo, que expresan transitoriamente el ADN en las células huésped viene con algunas de las dificultades principales, no en el menos que el nivel de expresión por célula no es fiable. El número de copias de ADN plásmido tomada up por célula es incontrolable, por lo tanto la expresión entre los experimentos individuales puede variar mucho 2. Este problema se vuelve significativo cuando sea tratando de reproducir las condiciones fisiológicas, o la realización de las técnicas de recolección de datos precisos.
Como una solución a las complicaciones mencionadas anteriormente, los protocolos de transfección estables han sido diseñados en el que un gen de interés se puede insertar en el genoma de una célula bajo el estricto control de un promotor inducible, tal como un sistema de expresión represor de la tetraciclina, asegurando una sola de copias del plásmido se integra en el genoma de cada célula y sólo se expresa después de la inducción del mecanismo de la transcripción, por ejemplo, en presencia de doxiciclina. Aunque esto resuelve los obstáculos de los niveles de expresión de proteínas inconsistentes, este método pierde la comodidad de protocolo rápido y relativamente simple de transfecciones transitorias. El establecimiento de una línea celular estable que lleva por lo menos un par de semanas en which hay que calibrar una curva de muerte establecido por antibióticos específicos para mantener la expresión de la proteína y asegurar la integración del vector y hábilmente seleccionar y hacer crecer las colonias de células. En general, esto toma mucho más tiempo y esfuerzo con una menor tasa de éxito 8.
A continuación, presentamos un protocolo intermedio que se basa en los puntos fuertes de las dos opciones de transfección populares para proporcionar una manera simple y eficaz para controlar los niveles de expresión en cualquier línea celular inducible. Mientras se mantiene células con un sistema de tet inducible, transitoriamente transfectar nuestro gen de interés, Transient Receptor canal catiónico miembro de la subfamilia V Potencial 1 (TRPV1), se ligó en un vector que se puede combinar de forma homóloga con el sistema de represor. De esta manera, el gen se puede introducir en las células sin empezar a expresar. Sólo con la adición de doxiciclina no el gen comienzan a expresar, lo que nos permite calibrar los niveles de proteína exprEssion según la técnica o niveles observados en condiciones fisiológicas. El protocolo también evita largas complicaciones asociadas con la generación de una línea celular que expresa de forma estable. Comenzamos mostrando los niveles cambiantes de la activación TRPV1 en imágenes de calcio desde un-inducida a través de cuatro horas de la inducción y la forma en que el aumento de los niveles de calcio intracelular se correlaciona. A continuación, duplicar el protocolo en toda la configuración de la celda de la técnica de patch clamp, que muestra la corriente aumenta con el tiempo de inducción en aumento. Por último, se presentan ejemplos de grabaciones de electrofisiología de un solo canal, y demostrar que esta técnica es especialmente útil para la expresión controlada en la búsqueda de la recopilación de datos precisos sobre la base de las unidades individuales de la proteína. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de controlar la expresión de proteínas en sistemas heterólogos, evitando las complicaciones de cultivo de células largas, proporcionando así una manera de controlar las condiciones entre los experimentos y proporcionar movolver a resultados reproducibles.
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Protocol
1. ligando el gen de interés en el Sitio reprimible de Vector
- Obtener un vector inducible, como pcDNA5 / FRT / A o pcDNA4 / A.
- Analizar el gen de interés para cualquier sitio de restricción potencialmente susceptibles en el medio del gen que también aparecen en el sitio de clonación múltiple del vector elegido por el software de análisis de ADN silico 4.
- Uso de superposición estándar técnicas de PCR 4, flanquean el gen de interés con dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción seleccionadas (que no se encuentran en el gen de interés), el primero inserta antes del codón de inicio, y el segundo después del codón de parada.
- Digerir tanto el vector e insertar con enzimas de restricción (seleccionados en el paso 1.2) a la temperatura de trabajo enzimas 'durante una hora, seguido de la adición de una unidad de fosfatasa de intestino de ternera (CIP) a la reacción vector solamente durante 30 minutos con el fin de evitar la auto ligación.
- Cargar el ADN digerido en un gel de agarosa al 1% y se separan los segmentos escindidos por electroforesis 9.
- El uso de la luz ultravioleta, se cortó con una cuchilla de las piezas de gel que contiene los segmentos deseados de vectores e insertar a ligar.
- Extraer los segmentos de ADN a partir de las piezas de gel de agarosa (utilizando kits comerciales disponibles de extracción de ADN) y medir su concentración final por espectrofotómetro a 260 nm.
- Ligar el gen de interés en el vector seleccionado inducible utilizando la enzima ligasa de T4 a temperatura ambiente durante 20 minutos. Con el fin de aumentar la probabilidad de que el inserto de ligación con el vector, utilizar una proporción de 3: 1 molar de la inserción: vector. Para el control, preparar una reacción de ligación que incluye sólo el vector.
- Para la transformación bacteriana, añadir 10 ng de vector solo y vector + gen en 50 l de E. coli competentes. Incubar el tubo en hielo durante 30 minutos seguido de 45 segundos de incubación a 42 ° C. Inmediatamente coloque de nuevoen hielo durante dos minutos y transferir las bacterias transformadas a 500 l de medio LB. Incubar durante una hora a 37 ° C con agitación a 220 rpm.
- Para la selección de bacterias transformadas con éxito, la placa 100 l de cada reacción (como se describe en 1.9) en una placa de agar LB preparado que contiene el antibiótico apropiado (por ejemplo, 100 g / ml de ampicilina cuando se utiliza pCDNA4 / TR).
- Permitir a crecer durante la noche a 37 ° C. Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante hasta dos semanas por firmemente envolviéndolos en película de parafina plástico.
- Levantar colonias individuales usando una punta de 10 l, y permitir a crecer durante la noche en 3 ml de LB + antibiótico medio a 37 ° C con agitación a 220 rpm. Las bacterias con ADN de interés pueden ser congeladas (-20 ° C) para el almacenamiento a corto plazo por centrifugación de la LB y bacterias a 11.000 xg y aspirar el sobrenadante. El almacenamiento a largo plazo requiere la congelación de las bacterias como la madre de glicerol a -80 ° C.
- Extraer el ADN through mini-prep y medir la concentración final por espectrofotómetro a 260 nm 5.
- Confirmar inserción exitosa del gen de interés mediante la secuenciación de la construcción purificada 4. Alternativamente, la digestión de diagnóstico de la construcción por las enzimas de restricción utilizando electroforesis para separar los segmentos de corte y evaluar su presencia y longitud también podría utilizarse para este fin 4.
2. El cultivo de líneas celulares que expresan TetR
- Obtener una línea de cultivo celular que alberga un plásmido represor Tet incorporado en su ADN genómico. En esto el protocolo será escrito utilizando células 293T de riñón embrionario humano (HEK-293T) que alberga el plásmido pcDNA6 / TR como un ejemplo.
- Sembrar las células en placa de cultivo de tejido de 100 mm con Eagles modificado de medio de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y HEPES 25 mM, pH 7,3 (en el presente documento: DMEM completo) e incubar O / N a 37 y# 176; C y 5% de CO2. Todo el trabajo con células debe realizarse en una campana biológica en condiciones estériles.
- A fin de mantener la expresión de gen represor Tet, aspirar el medio y sustituirlo por DMEM completo complementado con 5 mg / ml de blasticidina. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Una vez que las células alcanzan el 80 - 90% de confluencia, aspirar el medio y lavar suavemente las células dos veces con DPBS (sin calcio y magnesio) se calentó a 37 ° C.
- Con el fin de levantar suavemente las células sin causar daños mecánicos, Incubar el cultivo en DMEM que contiene 0,05% de tripsina se calentó a 37 ° C durante 1,5 min.
- Bloquear la acción de tripsina con un volumen igual de completo DMEM. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con el fin de levantar las células y transferirlas a un tubo estéril.
- Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y reemplazarlo con 1 ml de DMEM completo. Pipetear la solución con las células hacia arriba y abajo hasta que no segrupos de células se pueden ver. Contar y calcular el número de células utilizando un hemocitómetro.
- Semilla de 1 - 2 x 10 6 células en 100 mm placa de cultivo tisular que contiene 12 ml de DMEM completo con 5 mg / ml blasticidina. Dividir las células dos veces a la semana a medida que alcanzan 90% de confluencia.
3. transfección del plásmido de interés en células
- Utilizando el mismo método de división de celdas como se ha descrito anteriormente, las células de transferencia a los pocillos en una placa de 12 pocillos preparada con 0,9 ml completo DMEM, suficiente para que 50% de confluencia (~ 200.000 células) e incubar durante la noche a 37 ° C en un CO 2 incubadora.
- Preparar una mezcla de transfección con pcDNA4 / A que contiene el gen de interés, un plásmido inerte para llevar la cantidad total de ADN de 1 mg (si es necesario), 3 mu l de reactivo de transfección de lípidos y DMEM para hacer que el volumen final de 100 mL. La cantidad óptima de ADN de plásmido a utilizar varía ampliamente como diferentes proteínas expresan en diferente eficiencia. para elegidosexperimentos rophysiological, incluyen EGFP en el plásmido de expresión de mamífero en el cóctel de transfección con el fin de visualizar las células que se someten a transfección con éxito 4.
- Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 30 min.
- Transfectar células pipeteando la mezcla de transfección gota a gota sobre las células sembradas en la placa de 12 pocillos y la placa de roca vigorosamente para asegurar una dispersión homogénea de ADN y reactivo de transfección. Las células deben ser ~ 80% de confluencia en el momento de la transfección.
- Se incuban las células transfectadas O / N a 37 ° C y 5% de CO2.
- Confirmar que las células se transfectaron con éxito mediante la observación de la señal de fluorescencia de EGFP bajo la lámpara UV a la mañana siguiente si la realización de la electrofisiología.
4. Las células en placas sobre poli-D-lisina (PDL) Cubreobjetos / Wells
- Esterilizar 12 mm cubreobjetos por rociar con una solución de etanol isopropílico al 70%. Seco y colocar una sola coverslip en cada pocillo de una placa de 24 pocillos para el registro electrofisiológico.
- Pipetear una solución de 0,1 - solución de 0,2 mg / mL PDL en cada cubreobjetos o bien de una cámara de imágenes de calcio.
- Deje reposar durante 30 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Lavar con agua de calidad para el cultivo de células doblemente destilada (DDW) tres veces, aspirando entre cada lavado. Tras el lavado final, secar bien y dejar reposar a temperatura ambiente.
- Para electrofisiología, llenar cada pocillo que contiene un cubreobjetos recubierto PDL con 500 l DMEM completo se calentó a 37 ° C.
- Realizar el mismo método de dividir las células transfectadas como se describe anteriormente. Después de la resuspensión de las células después del tratamiento con tripsina y de bloqueo, la transferencia de 80 l de células (o aproximadamente 30.000 células) para el centro de cada cubreobjetos recubiertos PDL para la grabación de electrofisiología. Dejar reposar las células durante al menos 1,5 horas o incubar durante la noche a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Para la transferencia de calcio de formación de imágenes y la mancha 20 l de células (aproximadamente 20.000 células) para el centro de cada imagen de calcio recubierto PDL también. Dejar reposar las células durante al menos 30 minutos y se añaden 180 l DMEM completo a cada pocillo.
5. La inducción de la expresión génica
- Preparar una solución de doxiciclina de stock de 1 mg / ml en DDW de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga solución de reserva protegida de la luz a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas. Para el almacenamiento a largo plazo mantener la doxiciclina solución madre a -20 ° C.
- Preparar un nuevo máximo de 2 mg / ml (electrofisiología) o / ml (imágenes de calcio) solución de doxiciclina 3 g en DMEM completo y se caliente a 37 ° C.
- Para registros electrofisiológicos, de pipeta 500 l de 2 mg solución doxiciclina / ml a cada pocillo para hacer una concentración final de 1 mg / ml de doxiciclina. Para imágenes de calcio, añadir 100 l de solución de doxiciclina 3 mg / ml a cada pocillo para hacer una concentración final dela de 1 mg / ml de doxiciclina. Anotar la hora de la inducción.
- Incubar durante la cantidad de tiempo deseado para la inducción a 37 ° C y 5% de CO 2.
6. Calibración de la línea de tiempo de la expresión proteica
- Calibración de expresión de la proteína a través de imágenes de calcio 5, 10
- Preparar la solución de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 2,5 mM, 1,8 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, HEPES 20 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH) y se caliente a 37 ° C.
- Preparar concentraciones saturantes de agonista de canal en solución de Ringer. Debido a que la cantidad de agonista se diluye cuando se añade a las cámaras de formación de imágenes de calcio que contienen las células y la solución extracelular, el doble de la cantidad de la concentración final deseada de agonista. Esto también hace que la cantidad de solución del baño en cada pocillo crítico de controlar.
- Preparar una solución de no iónico F-127 20% W / V en DMSO. Calentar la solución a 40 ° C hasta que no iónico F-127 se disuelve. Almacenar la solución no iónico F-127 a temperatura ambiente y se caliente a 40 ° C antes de su uso. No iónico F-127 se utiliza para ayudar a dispersar (AM) ésteres de acetoximetilo de indicadores de iones fluorescentes tales como Fura-2 en soluciones acuosas.
- Aspirar medio y reemplazarlo con una solución de Fura-2AM de carga (solución de Ringer suplementado con 2 - 3 M Fura-2AM, 0,02 mg / mL no iónico F-127 y 10 mM de D-glucosa).
- Incubar durante 60 min a TA en la oscuridad.
- solución y lavar las células Aspirar Fura-2AM con solución de D-glucosa + 10 mM de Ringer para eliminar el tinte extracelular. Repita este paso dos veces.
- Deje la solución D-glucosa mM + 10 de 200 l Ringer en cada pocillo e incubar durante 30 min a TA en la oscuridad.
- Coloque la cámara en el escenario por encima de la pieza de la nariz microscopio y fijarlo con soporte.
- Encender la lámpara, la cámara y el microscopio y seleccione filtro de Fura-2 para detectar la emisión a 510 nm wavelength.
- Ajustar para obtener la ampliación deseada y centrarse células en el campo seleccionado.
- En la oscuridad, restar la luz de fondo y ajustar el tiempo de exposición.
- Conjunto de muestreo de imagen a la tasa de fluorescencia y grabar la respuesta deseada de Fura-2 células cargadas por excitándolas a 340 y 380 nm longitud de onda. La relación de 340/380 señales es un indicador de la concentración intracelular de Ca2 + y por lo tanto también para la actividad de TRPV1.
- Añadir capsaicina 2 M en solución de 200 l Ringer mediante pipeteo para crear una concentración de saturación final de 1 mM capsaicina con el fin de evaluar el nivel de expresión de TRPV1.
- Analizar la respuesta TRPV1 en función del tiempo de inducción y determinar protocolo para la proteína de interés.
- Ajuste de expresión de proteínas en sistemas heterólogos utilizando toda la configuración de la celda de la técnica de patch clamp 4, 11.
- preparar tque bañar solución de (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES, y 5 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES), ajustado a pH 7,4 con NaOH.
- Preparar concentraciones saturantes de agonista de canal en solución extracelular.
- Tire de los electrodos de vidrio con un diámetro interior (ID) de 1,10 mm y extinción de esmalte a una resistencia de 2 - 4 de mO.
- Preparar una solución de la pipeta de (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl 2, 1 EGTA y 10 HEPES ajustado a pH 7,2 con KOH. Se filtra la solución de la pipeta antes de su uso. Antes de cada experimento, una sola, pipeta de vidrio pulido al fuego se vuelve a cargar sumergiendo la punta de la pipeta en la solución durante al menos un minuto, y luego se llena usando la punta fundida y se estiró con una jeringa llena con la misma solución de la pipeta.
- Levante suavemente un único cubreobjetos PDL recubierto con las células cultivadas en placas desde el pozo a una placa petri de plástico 35 mm llena con aproximadamente 2 ml solución del baño a temperatura ambiente. Observar bajo un epmicroscopio i-fluorescente.
- Localizar una célula EGFP positivo, como se visualizaron con el microscopio de epifluorescencia, en el cubreobjetos preparado y moverse hacia el centro del campo visualizado.
- Coloque la pipeta llena hasta el soporte de pipeta de la micromanipulador, e inyectar una pequeña cantidad de presión positiva en el sistema para evitar la contaminación de la solución de la pipeta intracelular. Bajarlo hasta justo por encima de la GFP - célula positiva, la comprobación de la resistencia adecuada.
- A medida que la pipeta toque la célula, aplicar una pequeña cantidad de presión negativa con el fin de crear un sello GΩ entre la pipeta de vidrio y la membrana celular.
- Con un corto fuerte pulso de succión,, romper la membrana celular, lo que permite la pipeta entre en contacto con el contenido intracelular de la célula.
- Cambiar el modo de amplificador de células enteras, y baje la ganancia del filtro y la salida de Bessel en 1 - 5 kHz y 0.5α, respectivamente.
- Registrar la respuesta actual a la saturaciónconcentraciones de agonista de canal mediante el uso de rampas de tensión o brecha protocolo libre.
- Debido a la eficiencia de expresión cambian entre diferentes proteínas, repetir las grabaciones utilizando diferentes momentos de la longitud de inducción.
- Determinación del tiempo de inducción ideal para las grabaciones de canales individuales 4.
- Preparar una solución de (mM) 150 Na-gluconato, 15 NaCl, 5 EGTA, y 10 HEPES, ajustado a pH 7,4 con NaOH, como una solución de la pipeta. Para la solución del baño, utilizar la solución de la etapa 6.2.1.
- Repita el procedimiento de células enteras usando ID pipetas de vidrio de 0,86 mm-pulido fuego a una resistencia de 10 - 12 mO y establecer potencial de mantenimiento de -40 mV.
- Crear un sello en la membrana como se describe anteriormente y la ruptura de la membrana.
- Usando el micromanipulador, levante la pipeta con el parche de membrana fuera de la celda.
- Coloque el sistema de perfusión justo al lado de la pipeta que contiene el parche de membrana.
- Baja tque Bessel ganancia del filtro y la salida a 2 - 5 kHz y 10α, respectivamente.
- Perfundir concentraciones saturantes de agonista en el parche de la membrana, la evaluación de si el parche contiene uno o más canales de acuerdo con la respuesta.
- Analizar el número de parches de canal individuales registradas con éxito contra el tiempo de inducción se aplica a las células. Ajustar el tiempo de inducción de acuerdo con los resultados deseados.
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Representative Results
Para crear rápidamente un modelo de expresión inducible, hicimos uso de células HEK293 que expresan la proteína represora de tetraciclina (TR) (por ejemplo, T-Rex-293) y los vectores que contienen secuencias de operador de tetraciclina (TetO) entre el promotor CMV y el sitio de clonación múltiple (por ejemplo, pcDNA4 / TO). Cuando se transfectaron en células TREx-293, la expresión del gen de interés en pcDNA4 / TO se reprime, como TR se une a TetO. La adición de doxiciclina al medio impide la interacción TR-TetO, permitiendo así la expresión de la proteína transfectada. Para controlar la expresión de TRPV1 de rata (rTRPV1) primero insertamos gen de este canal en un pcDNA4 / A vector usando el protocolo descrito anteriormente. A continuación, las células T-Rex-293 se transfectaron con el rTRPV1- pcDNA4 / A plásmido de acuerdo con los pasos descritos en el punto 3 del protocolo. Después de la transfección, la expresión rTRPV1 se indujo por incubación de las células en presencia de doxiciclina (1 μg / ml) durante 1 - 4 h. Es importante destacar que, diferentes concentraciones de doxiciclina se pueden utilizar para lograr la tasa de expresión deseado. Se utilizaron los métodos de formación de imágenes electrofisiológicos y de calcio para evaluar el nivel de expresión rTRPV1 en cada punto de tiempo mediante la aplicación de su agonista, la capsaicina. Como se muestra en la Figura 1, el uso de imágenes de calcio de células vivas, el nivel de calcio intracelular después de la aplicación de capsaicina se incrementa gradualmente con tiempos de inducción más largos. La activación de las células no inducidas puede ser atribuible a una fuga basal en la actividad de TR, la sobreexpresión del plásmido, o tetraciclina residual en los componentes de las células de los medios. A continuación, se registraron las corrientes de las células usando la configuración de célula completa de la técnica de patch clamp aplicación de rampas de tensión entre -80 mV a +80 mV. La Figura 2 muestra que el aumento de amplitudes de corriente se obtienen con tiempos de inducción más largos. La saturación en la amplitud de corriente a las 4 h de inducción es consiste delnt con la saturación se ve en la respuesta de calcio (Figura 1). Por último, se analizaron los niveles de expresión rTRPV1 en la configuración exterior hacia fuera de la técnica de patch-clamp. Una de las principales dificultades en el estudio de los canales iónicos de estructura-función está llegando a niveles de expresión adecuados para el análisis de un solo canal. Sobre la base de la conductancia unitaria rTRPV1 publicado 4, se utilizó la amplitud de la corriente registrada para determinar el número de canales en el parche extirpado. Como se muestra en la Figura 3, el número de canales en el parche aumenta proporcionalmente al tiempo doxiciclina incubación. Después de una hora de inducción, que no fueron capaces de detectar cualquier actividad de los canales (0 de 8). Sin embargo, en ambos puntos de tiempo de dos y de tres horas se registró la actividad de un solo canal de las tasas de éxito similares. Es de destacar que, mientras que en dos horas la mayoría de los parches no respondieron, en tres horas la mayoría de los parches mostraron solo a multi-actividad -channel. Las posibilidades de grabación de múltiples canales después de tres horas de la inducción es alta, por lo que el tiempo óptimo de inducción para registrar la corriente de un solo canal es de entre dos a tres horas en las condiciones presentadas. En conjunto, estos resultados demuestran que la expresión de canales de iones puede ser estrechamente controlada y regulada después de la transfección transitoria usando este protocolo.
Figura 1. Respuesta de aumenta la activación de TRPV1 de acuerdo con Tiempo de inducción, como se visualiza a través de Imagen de calcio. (A) Imágenes de color Pseudo de T-Rex-293 células que expresan transitoriamente rTRPV1, antes ( "basal") y después de aplicar capsaicina (2 M). Las barras blancas representan 30 micras. La barra de escala indica los niveles de calcio intracelular. (B) cambia con el tiempo de los niveles de calcio intracelular en las células transfectadas T-Rex-293 tratadas como se muestraen A. Cada gráfico representa un promedio de 50 células sensibles a capsaicina. Tenga en cuenta los aumentos graduales en las respuestas a la capsaicina en relación con el tiempo de inducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. TRPV1 corriente aumenta como resultado del aumento de tiempo de inducción en la célula entera Patch Clamp Grabaciones. (A) grabaciones de células enteras de T-Rex-293 transfectadas transitoriamente con rTRPV1 a un potencial de mantenimiento de -40 mV. Las células fueron inducidas con doxiciclina (1 mg / ml) durante el tiempo indicado y luego se exponen a la capsaicina ( 'Cap'; barra roja; 1 M). Se muestra una traza representante de 6 - 11 grabaciones independientes. (B) Media / gráfico de dispersión de puntos que representa la amplitud de células enteras evocados como se muestra en A. Estadísticaal significación entre los grupos se determinó con ANOVA con comparaciones múltiples, donde *** representa p ≤0.001 y no ns- estadísticamente significativas (n = 6 - 11 células). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Tasa de éxito del canal TRPV1 solo parche en Grabaciones depende de Tiempo de inducción. (A) Tomas fuera de salida de T-Rex-293 transfectadas transitoriamente con rTRPV1 en una explotación potencial de 50 mV. Las células fueron inducidas con doxiciclina (1 mg / ml) durante el tiempo indicado y se expusieron a capsaicina ( 'Cap'; barra roja; 1 M). Se muestra una traza representante de 6 - 9 grabaciones independientes. (B) Media parcela / dispersión de punto que representa el número de canales en el parche como extirpadose muestra en A. La significación estadística entre los grupos se determinó con ANOVA con comparaciones múltiples, donde *** representa p ≤0.001 y no ns- estadísticamente significativas (n = 6 - 9 células). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La transfección es un protocolo ampliamente utilizado para la expresión de la proteína y la investigación, con muchas variaciones diferentes para mejorar la consistencia y la estabilidad de expresión. reactivos de transfección transitoria ofrecen un simple, fácil de usar protocolo donde la célula y proteína de interés pueden ser analizados en cuestión de horas hasta toda la noche desde el momento de la transfección. Por desgracia, este enfoque puede ser impredecible cuando el modo de análisis requiere un nivel consistente de la expresión de proteínas, como las grabaciones de canales individuales en la electrofisiología 2. Alternativamente, las líneas celulares estables en el marco del sistema de expresión que se puede reprimir la tetraciclina se han desarrollado para ofrecer una manera de controlar el nivel de expresión de la proteína de interés 12. Este enfoque proporciona expresión coherente de todas las células en un cultivo con la introducción de un suplemento de tetraciclina derivada, tales como doxiciclina. Si bien esto permite un control consistente y preciso de los niveles de proteína, tque el tiempo y el esfuerzo que va a establecer una línea celular estable que hace que sea un inconveniente y una desventaja cuando se estudia una amplia variedad de proteínas 8.
El protocolo que aquí se presenta ofrece una solución medio-de-la-carretera de los protocolos de transfección actuales ofrecidos. Por transfección transitoria de un gen bajo un promotor controlable en las células que poseen un represor de Tet, podemos conseguir la expresión controlable, evitando procedimientos largos y complicados. En este caso, hemos utilizado el TRPV1 canal catiónico no selectivo con imágenes de calcio y el análisis electrofisiológico. Se encontró que el tiempo de inducción ideal para la expresión controlada de esta proteína específica para el análisis de un solo canal fue de entre 2 - 3 h de incubación con 1 mg / ml de doxiciclina (Figuras 1 - 3). En una escala más amplia, esta técnica también se puede aplicar a cualquier proteína de interés. Este protocolo también ofrece una solución para controlar la expresión cuando un largama ge de diferentes proteínas o mutaciones en las secuencias de proteínas son de interés y la creación de una línea celular estable para cada variante es poco práctico. Es importante destacar que, mientras que los resultados aquí representan el tiempo óptimo y concentraciones aplicables para la expresión de TRPV1, cada gen tiene su individuo y el ritmo de traducción y el tráfico específico, por lo tanto las horas de calibración y de expresión de cada proteína difieren en gran medida 13.
Si bien esta técnica ofrece una solución conveniente para la expresión controlada, no es sin limitaciones. Sólo comercialmente disponibles líneas celulares que albergaban el sistema Tet se pueden utilizar con este sistema, que presenta un problema si estas líneas celulares particulares no son adecuados para el tipo de análisis que se va a realizar. Otro escollo comparación con las líneas transfectadas de manera estable es que no todas las células se someten a transfección, y por lo tanto no todas las células expresan la proteína de interés. En general, ofrecemos una manera conveniente de controlar la proteína EXpression en un sistema heterólogo que se puede aplicar a una amplia gama de la investigación biomédica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel [Subvenciones 1721/12, 1368/12, 1444/16 y] (AP). AP está afiliada con Brettler Center y David R. Bloom Center, Facultad de Farmacia, Universidad Hebrea de Jerusalén.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
| NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
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