Summary

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Published: February 17, 2017
doi:

Summary

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

Abstract

Transfeksiyon, bir hücre içine yabancı nükleik asitlerin ulaştırılması protein araştırmaları güçlü bir araçtır. Bu yöntem sayesinde, iyon kanalları elektrofizyolojik analizi, biyokimyasal karakterizasyonu, mutasyon çalışmaları ve hücresel süreçlerin üzerindeki etkileri yoluyla incelenebilir. Geçici nakiller protein gün birkaç saat içinde analiz için kullanılabilir hale geldiği basit bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem nispeten basit ve etkili bir zaman protokolü sunulur, ancak önemli bir bileşendir analizi için uygun olan fizyolojik ilgili bu seviyeleri ilgi konusu genin ekspresyonunu kalibre edilir. Bu amaçla, söz konusu genin ekspresyonunu kontrol etmek olanağı sunan bir çok farklı yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Birkaç kararlı hücre transfeksiyon protokolleri kalıcı bir tetrasiklin kontrollü transkripsiyonu düzenlenmesi altında cep genomuna ilgilenilen geni tanıtmak için bir yol sağlartional aktivasyonu. Bu tekniğin güvenilir ifade seviyelerini üretirken, ilgi her gen bir öldürme eğrisi kalibrasyonu, hücre kolonilerinin seçimi ve genel olarak daha fazla kaynak da dahil olmak üzere vasıflı iş bir kaç hafta gerektirir. Burada iyon kanalı analizinde gerekli kontrollü bir şekilde bir proteini ifade etmek için etkili bir yol olarak indüklenebilir bir sistemde geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V 1 (TRPV1) geninin geçici transfeksiyon kullanan bir protokol mevcut. Biz bu tekniği kullanarak, bir tek transfeksiyon ile veri toplama her türü için gerekli olan kontrollü kanal seviyeleri ile kalsiyum görüntüleme, tüm hücre ve tek kanallı analizi gerçekleştirmek mümkün olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu iyon kanalları yapı ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir kopyalanabilir bir teknik sağlamaktadır.

Introduction

Heterolog sistemleri ifade hücresel fonksiyonları 1 çok sayıda çalışma için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Onların düşük endojen protein profili, asgari bakım gereksinimleri, güvenilir büyüme ve yabancı DNA'yı almak ve ifade yeteneği, insan embriyonik böbrek (HEK293) ve biyolojik araştırmaların 2, 3 neredeyse temel Çin Hamster Yumurtalık (CHO) gibi hücre hatları yaptık. heterolog sistemler kullanılarak çalışma alanları zar proteinleri, hücre içi sinyal ve enzimatik aktivite içerir. Hücreye yabancı DNA'nın transfeksiyonu takiben, analiz, birçok farklı formları elektrofizyoloji, rasyometrik kalsiyum görüntüleme, western blot, vb 4, 5 de dahil olmak üzere, yapılabilmektedir.

heterolog sentezleme sistemleri için potansiyel uygulamalar geniş bir dizi için birçok differe nedeniylent reaktifler ve ürünleri bu hücreler ve nitelikleri 6 kullanmak için geliştirilmiştir. geçici veya kalıcı olarak eksojen proteini incelemek için hücre içine yabancı DNA'yı entegre DNA verme sistemleri, biyolojik araştırmalar için en popüler ve kullanışlı araçlarından biri haline gelmiştir. Daha özel olarak ise, bir hücre içine geçici olarak transfekte DNA, yaygın olarak nispeten daha az bir zaman ve malzeme gerektiren, basit ve yalındır işlem olarak kullanılır. Ayrıca, transfeksiyon geçmesi hücrelerin başarı oranı 7 yüksektir. Bu teknik, aynı şekilde yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir işaretleyici gen ile birlikte ve örneğin kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyoloji 5 gibi birçok farklı teknikleri için kullanılabilir zaman çok güvenilirdir. Ne yazık ki, olsa da, geçici konakçı hücreler içine DNA ifade etmeyen hücre başına ekspresyon seviyesi güvenilmez olduğunu en az, bazı önemli tuzaklar ile birlikte geliyor. plazmid DNA kopya sayısı u alınmışhücre başına p böylece bireysel deneyler arasındaki ifade çok 2 değişebilir, kontrol edilemez. Ya fizyolojik koşulları çoğaltmak için çalışıyoruz, ya da kesin veri toplama tekniklerini yaparken bu sorun önemli hale gelir.

Tek sağlanması ilgilenilen bir gen gibi bir tetrasiklin bastırıcı sentezleme sistemi gibi bir uyarımlı promotör, sıkı kontrol altında bir hücrenin genomu içine sokulabilir olan, kararlı transfeksiyon protokolleri tasarlanmıştır yukarıda bahsedilen komplikasyonların bir çözüm olarak, plazmidin kopyalama her bir hücrenin genomu içinde entegre olması ve yalnızca doksisiklinin varlığında, örneğin, transkripsiyon mekanizmasının indüksiyonundan sonra eksprese edilir. Bu tutarsızlık, protein sentezleme seviyeleri engeller çözer birlikte, bu yöntem, geçici transfeksiyonlar hızlı ve nispeten basit bir protokol uygun kaybeder. stabil bir hücre dizisi oluşturulması yüklenebileceğini en az bir kaç hafta sürerh bir protein ifadesini korumak ve vektör entegrasyonunu sağlamak ve ustaca seçin ve hücre kolonilerini büyümeye özel antibiyotik tarafından belirlenen bir öldürme eğrisini kalibre gerekir. Genel olarak bu alt başarı oranı 8 ile önemli ölçüde daha fazla zaman ve çaba gerektirir.

Burada, herhangi bir uyarılabilir hücre hattında ifade seviyelerini kontrol etmek için basit ve etkili bir şekilde sağlamak için popüler transfeksiyon seçeneklerinin her ikisi de güçlü üzerine çekiyor bir ara protokol tanıtmak. indüklenebilir bir tet sistemi hücreleri muhafaza ederken, geçici olarak homolog represör sistemi ile kombine bir vektör içine lige ilgi Gen, geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V 1 (TRPV1), transfekte. Bu şekilde, bir gen ifade etmek başlayan olmayan hücrelere dahil edilebilir. Sadece doksisiklin ilavesi ile gen protein İfade seviyelerini kalibre etmek bize izin verdiği ifade başlar yokFizyolojik koşullarda gözlenen teknik veya düzeylerine göre Ession. Bizim protokol, aynı zamanda, bir stabil şekilde eksprese eden hücre çizgisi üreten bağlantılı uzun komplikasyonlar önlenir. Biz kalsiyum görüntülemede TRPV1 aktivasyon değişen düzeylerde göstererek başlar un kaynaklı indüksiyon ve nasıl hücre içi kalsiyum seviyesinin yükselmesi ilişkilidir dört saat boyunca. Daha sonra indüksiyon süresinin artması ile artmaktadır akımını gösteren Patch kenetleme tekniğinin tüm hücre konfigürasyonunda protokolü çoğaltmak. Son olarak, tek kanallı elektrofizyoloji kayıtların örnekler sunmakta ve proteinin tek tek birimler göre hassas veri toplama ararken bu teknik kontrollü sentezlenmesi için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. böylece deneyler sağlamak ve mo arasındaki koşullarını kontrol etmek için bir yol sağlayarak, uzun hücre kültürü komplikasyonları kaçınırken bizim protokolü sayesinde, heterolog sistemlerde protein ifadesini kontrol etmek için uygun bir yol sunartekrarlanabilir sonuçlar yeniden.

Protocol

1. Vektör Baskılanabilir Site içine İlgi Gene bağlanması / TO gibi pcDNA5 / FRT / TO veya pcDNA4 olarak bir aşılanabilir vektör edinin. Siliko DNA analiz yazılımı 4 ile aynı zamanda seçilen vektörünün çok sayıda klonlama bölgesi yer almaktadır genin ortasında potansiyel olarak duyarlı restriksiyon siteleri için ilgi konusu geni analiz edin. Kullanma bindirici PCR teknikleri 4, (ilgili genin içinde bu…

Representative Results

Hızlı bir şekilde uyarılabilir ifade modeli oluşturmak için, biz tetrasiklin bastırıcı protein (TR) ifade eden HEK293 hücrelerine kullandı (örneğin, T-Rex-293) ve CMV promoter ve çoklu klonlama sitesi arasında tetrasiklin operatör dizileri (TETO) ihtiva vektörleri (örneğin, pcDNA4 / TO). TRex-293 hücreleri içine transfekte edilmiş zaman TR teto bağlanan gibi, pcDNA4 / TO daki genin ekspresyonu, bastırılır. orta doksisiklin eklenmesi, böylece t…

Discussion

Transfeksiyon ifade tutarlılığı ve istikrarı geliştirmek için birçok farklı varyasyonları ile protein ekspresyonu ve araştırma için yaygın olarak kullanılan bir protokoldür. Geçici transfeksiyon ayıraçları kolay, basit bir ilgi hücre ve protein transfeksiyon zaman gecede saat içinde analiz edilebilir protokolünü kullanmak için sunuyoruz. Analiz modu gibi elektrofizyoloji 2 tek kanallı kayıtları gibi protein ifadesi, tutarlı bir düzeyde gerektirir Ne yazık ki bu yakl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser (AP) İsrail Bilim Vakfı [Hibe 1721-1712, 1368-1312 ve 1444/16] tarafından desteklenmiştir. AP Brettler Merkezi ve David R. Bloom Center, Eczacılık Fakültesi, Kudüs İbrani Üniversitesi ile bağlanmıştır.

Materials

pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler Esco  n.a
Restriction Enzymes ThermoScientific Fisher ER0501
Agarose  Lonza 50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
NanoDrop 2000c ThermoScientific Fisher ND-2000C
T4 DNA Ligase ThermoScientific Fisher EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli ThermoScientific Fisher C404006 
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Bio A-301-5
Tryptone for microbiology Merck 6.19305E+13
Yeast Extract BD worldwide 212750
 SIF6000R Incubated Shaker LAB COMPANION 45H118

NucleoSpin®plasmid
Macherey Nagel 740588.25
MS 300V Power Supply Major Science MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System ThermoScientific Fisher B1A
T-REx™-293 cell line Invitrogen R710-07
DMEM (1X), liquid (high glucose) Gibco 41965-039
HindIII-HF® NEB R3104S
ApaI NEB R0114S
CutSmart® Buffer NEB B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector ThermoScientific Fisher V102520
Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin Gibco 10270106
HEPES Buffer Solution (1 M) Biological Industries 03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution Biological Industries 03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) Biological Industries 03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator ThermoScientific Fisher 51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet ThermoScientific Fisher 51025411
Blasticidine S hydrochloride Sigma-Aldrich 15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER Hausser Scientific 31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round Knittel Glass GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine Corning 354210
Water, Cell Culture Grade Biological Industries 03-055-1A
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-1G
Fura-2, AM ester Biotium BTM-50034
Pluronic® F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
µ-Slide 8 Well ibidi 80826
(E)-Capsaicin Tocris 462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope Olympus n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher Sutter Instruments n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera QImaging n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software Molecular Devices n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing Sutter Instruments B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma-Aldrich 276855
P1000 micropipette puller Sutter Instruments P-1000
MF-900 Microforge NARISHIGE n.a
ValveBank perfusion sysytem AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System Molecular Devices n.a
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices n.a
pCLAMP 10.6 Software Molecular Devices n.a
micromanipulator Sutter Instruments MP-225

References

  1. Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
  2. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  3. Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
  4. Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
  5. Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
  6. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  7. Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
  8. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
  13. Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).

Play Video

Cite This Article
Geron, M., Hazan, A., Priel, A. Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection. J. Vis. Exp. (120), e55370, doi:10.3791/55370 (2017).

View Video