Summary
Een protocol voor de bepaling van de relatieve anti-apoptotic activiteit van een anti-TNFα mAb een neutralisatie-mechanisme met WEHI 164 cellen wordt hier gepresenteerd. Dit protocol is handig voor het vergelijken van de sterkte van de neutralisatie van verschillende moleculen met dezelfde biologische functionaliteit.
Abstract
Dit protocol geeft de meting van de apoptotic activiteit neutralisatie van TNFα in een fibroblast mobiele muismodel (WEHI 164) met behulp van een anti-TNFα mAb. Bovendien, kan dit protocol worden gebruikt om te evalueren van de andere anti-TNFα-moleculen, zoals fusie-eiwitten. De cellulaire model hier werkzaam is gevoelig voor TNFα-gemedieerde apoptosis wanneer een extra stress-factor wordt geïnduceerd in cel kweekomstandigheden (bijvoorbeeld serum ontbering). Deze procedure is een voorbeeld van hoe uit te voeren van deze analytische assay, markeren de belangrijkste verrichtingen in verband met de bereiding van de monsters, cel verdunning apoptose inductie en spectrofotometrische metingen die essentieel zijn voor het waarborgen van de succesvolle resultaten. Dit protocol blijkt de best presterende voorwaarden met betrekking tot apoptose inductie en efficiënte signaal opnemen, leidt tot lage onzekerheid waarden.
Introduction
Biologische potentie is de kwantitatieve meting van biologische activiteit, gebaseerd op de getest productkenmerken die zijn gekoppeld aan de relevante biologische eigenschappen, terwijl de hoeveelheid (uitgedrukt in de massa) is een fysisch-chemische maatregel van het eiwitgehalte. Potentie vermoeidheidstests zorgen samen met andere analytische methodologieën, worden uitgevoerd als onderdeel van de conformiteit van het product, stabiliteit en vergelijkbaarheid studies. In deze zin, worden potentie metingen gebruikt om aan te tonen dat product partijen voldoen aan de kritische kwaliteitsattributen (CQAs) of aanvaardingscriteria tijdens alle fasen van de klinische proeven en na goedkeuring van de markt.
Apoptosis is geprogrammeerde celdood, natuurlijk voorkomende wanneer cellen zijn besmet met een virus, of wanneer de cellen worden benadrukt door een milieu factor dat compromissen cellulaire levensvatbaarheid en functie1,2. O.a. behoort apoptosis remming, of biologische neutralisatie, tot de hoofdzakelijk bekende therapeutische mechanismen van mAbs, met name bij de behandeling van chronische ziekten, zoals immuun-gemedieerde inflammatoire aandoeningen. Anti-TNFα moleculen oefenen hun therapeutische eigenschappen door het blokkeren van de interactie van Tumornecrosefactor alfa (TNFα) met de p55 en p75 cel oppervlakte receptoren3, waardoor signaal trajecten die uiteindelijk zal tot cellulaire apoptosis leiden.
TNFα kunnen produceren ontsteking in sommige chronische ziekten4. TNFα is het onecht uitgescheiden in de extracellulaire milieu door macrofagen, die schildwachten van het aangeboren immuunsysteem en de voornaamste actoren in dit soort ziekte5. Als een gemeenschappelijke weg wordt TNFα deregulering geassocieerd met de pathogenese van deze ziekten. Zonder controle en onder constante inductie en cel stress induceert TNFα cel dood en weefsel degeneratie, uiteindelijk leidde tot reumatoïde artritis, ziekte van Crohn en andere pathologische profielen6.
TNF-antagonisten die blokkeren van de interactie tussen TNF en haar receptoren zijn steeds gebruikt als een effectieve therapie te verminderen symptomatology en belemmeren de voortgang van deze ziekten. Tegenwoordig, worden anti-TNFα geneesmiddelen veel gebruikt om te controleren de systemische concentratie van deze cytokine, waardoor verdere ontaarding van betrokken weefsels. In dit opzicht is het noodzakelijk die bieden een reproduceerbaar en robuuste bioassay om te beschrijven het specifiek vermogen van een drug om haar biologische effect te bereiken.
In dit protocol, kritische stappen-vastgesteld tijdens de ontwikkeling van een neutralisatie assay-voor het succesvol meten van de biologische werkzaamheid worden gemarkeerd, met een bijzondere nadruk op de vaardigheden die nodig zijn voor het uitvoeren van de bio-analysemethode. Deze bio-analytische methode informatie nuttig vergelijkbaarheid tussen de verschillende batches instellen of anti-TNFα geneesmiddelen in vergelijking met een klinisch geteste referentiestof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de Media en de oplossingen
- bereiden het kweekmedium: RPMI-1640 met 10% FBS, pH 7.4.
- Voorbereiden assay kweekmedium: RPMI-1640 zonder fenol rood maar met 1% FBS, pH 7.4.
- Bereiden cell wassen oplossing: DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing met 0,02% EDTA, pH 7.4.
- Bereid mobiele-detachement oplossing: 0,125% trypsine met 1 mM EDTA.
- Ontdooien 100 mL van een 0,25% oplossing van trypsine-EDTA en overdracht aan een steriele kolf van 500 mL.
- Mix met 100 mL van cel wassen oplossing en afzien van 15 mL aliquots in 15 mL steriele buizen. Winkel op-70 tot-80 ° C tot gebruik.
- Filteren van deze oplossingen door middel van een membraan van 0.22-µm en warm tot 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan het gebruiken.
- Bereiden apoptosis-inductie stockoplossing TNFα oplossing bij 3.3 µg/mL.
- Los 20 µg TNFα met 500 µL van filter-gesteriliseerd water in de primaire verpakking en meng tot volledige ontbinding.
- Breng kwantitatief over in een steriele tube van 15 mL en voeg 5,5 mL DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing tot deze buis. Meng voorzichtig met behulp van een vortex-mixer.
- Aliquot de oplossing in 70 µL porties. Afzien van elk aliquot in 0,5 mL slangen en winkel op -80 ° C.
- Bereid apoptose inductie-oplossing: TNFα oplossing bij 40 ng/mL.
- Een aliquoot gedeelte van de apoptose inductie stockoplossing, broeden in een waterbad op 25 ˚C voor 10 min. ontdooien
- De apoptose inductie-stockoplossing tot 40 ng/mL verdund door 61 µL van 3.3 µg/mL TNFα oplossing toe te voegen aan 4.939 mL assay voedingsbodem in een steriele tube van 15 mL.
- Mix door vortex-mixer voor 10 s; deze oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid.
- De oplossing tot 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan gebruik in th eneutralization assay opwarmen.
- Bereid de substraat oplossing: caspase-3/7 Glo oplossing 7 , 8.
- Ontdooien de caspase-bufferoplossing (caspase-3/7 Glo buffer) 12 h vóór gebruik.
- Laat de caspase-bufferoplossing en het substraat (caspase-3/7 Glo substraat) afzonderlijk op 25 ± 5 ° C gedurende 30 minuten vóór het mengen zitten.
- Overbrengen in 10 mL van de bufferoplossing caspase de substraat flacon en meng door inversie.
- Houden bij 25 ± 5 ° C, licht-beschermd tot gebruik.
Opmerking: De oplossing stabiel gedurende 6 uur op kamertemperatuur is.
2. Cel Culturing en Counting
- cel ontdooien en de eerste subcultuur.
- Één flacon met WEHI 164 cellen 9 verwijderen uit een diepvriezer op-80 ˚C en hen overbrengen in een ijsbad.
- Pipetteer omhoog en omlaag met 1 mL voorverwarmde kweekmedium totdat de bevroren cellen volledig ontdooien.
- Afzien van 9 mL voorverwarmde kweekmedium op een steriele tube van 15 mL.
- Breng de celsuspensie in de 15 mL steriele buis en meng voorzichtig vijfmaal door inversie.
- Centrifugeren van de celsuspensie bij 125 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en gedesag van de cel-pellet.
- Voeg 5 mL gestolde voedingsbodem aan de buis. Meng totdat de cellen zijn volledig geresuspendeerde.
- Voor het tellen van de cel, overbrengen 50 µL van de celsuspensie een 500 µL microtube en meng met 50 µL van 0,4% trypan blauw. Cellen tellen en aan te passen aan 0,5 x 10 6 cellen/mL. Stap 2.2, zie hieronder.
- 13 mL voorverwarmde kweekmedium aan een 75 mL maatkolf voor de cultuur van de cel toevoegen.
- Genoeg volume schorsing cel uit stap 2.1.6 na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO 2 te bereiken van 0,5 x 10 6 cellen/mL in de cel cultuur kolf afzien.
- Cel tellen.
Opmerking: Zie referentie 10.- Met behulp van de oplossing van stap 2.1.6, 0,05 mL naar een hemocytometer en bepalen van de celdichtheid onder een microscoop met trypan blauwe uitsluiting.
- Kwantificeren van het totale aantal cellen en levensvatbare cellen.
- Aanpassen de schorsingen van de cel naar 0,5 x 10 6 cellen/mL.
Vergelijking 1
V kweekmedium (mL) =
V kweekmedium (mL) = (5 mL - V celsuspensie)
V kweekmedium (mL) = de gecorrigeerde hoeveelheid WEHI 164 cel schorsing
NVC = aantal levensvatbare WEHI 164 cellen/mL
V kweekmedium (mL) = Assay kweekmedium volume toegevoegd aan de celsuspensie tot 0,5 x 10 6 cellen/mL
0,5 x 10 6 = dichtheid van de cel van de Target
- Cel detachement en de tweede en derde subcultuur.
Opmerking: Een vacuümsysteem kan worden gebruikt om de oplossingen van de kolven. Wegwerp of glas steriele pipetten kunnen worden gebruikt. Als de pipet een klomp katoen heeft aan de top, het moet worden verwijderd voordat gebruik.- Het kweekmedium verwijderen uit de celcultuur T-kolf met behulp van een steriele 1 mL-pipet en een vacuüm.
- Afzien 5 mL van cel wash oplossing in de cultuur T-kolf, meng zachtjes, en negeren de oplossing. Herhaal deze stap tweemaal.
Opmerking: De volledige verwijdering van de voedingsbodem is van cruciaal belang is voor efficiënte mobiele-detachement. - Voeg toe 15 mL cell detachement oplossing aan de T-kolf en laat het staan voor 3 min in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Controleert u of het ontbreken van de gekoppelde cellen in de binnenwand van de kolf onder de Microscoop. De cellen verwijderen uit de cultuur T-kolf met behulp van steriele Pipetteer 20 mL en breng ze in een steriele buis van 50 mL.
- Centrifugeren van de celsuspensie bij 125 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet met een andere 5 mL gestolde voedingsbodem.
- Cellen tellen en voeg voldoende kweekmedium te bereiken van de gewenste cel concentratie volgens vergelijking 1.
- Toevoegen van deze suspensie aan een 72 cm 2 T-kolf en na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Subcultuur assay de cellen minstens twee keer voordat u ze gebruikt in de neutralisatie. Herhaal de stappen 2.3.1-2.3.8 voor de komende twee dagen.
- Assay celsuspensie.
- Selecteer een WEHI 164 subcultuur die heeft van ten minste drie passen. Zie stap 2.1.
- Loskoppelen en de cellen volgens stap 2.2 en 2.3 van dit protocol tellen.
- De celsuspensie volgens vergelijking 1 naar 0,5 x 10 6 cellen/mL verdund.
- Gebruiken deze cellulaire schorsing voor de neutralisatie assay. Meng alle cel schorsingen door vortex mixer vóór gebruik.
3. Antilichaam voorbereiding en verdunningen
- kwantificatie van de mAbs.
- Bepalen de concentratie van de referentiestof controlemonster en analytische monster door UV-absorptie bij 280 nm met behulp van hun massale extinctie coëfficiënt (1.39) 11.
Opmerking: Oorspronkelijke concentraties kon drug productetiketten worden onttrokken. Echter, dit moet worden geverifieerd door UV-absorptie.
- Bepalen de concentratie van de referentiestof controlemonster en analytische monster door UV-absorptie bij 280 nm met behulp van hun massale extinctie coëfficiënt (1.39) 11.
- mAb verdunningen.
- Dilute alle monsters onafhankelijk in drievoud, met DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing in 2 mL slangen, tot 2 mg/mL. Bevestig deze concentratie door UV-absorptie in drievoud, met behulp van DPBS Mg - en Ca-vrije oplossing als de blanco.
- Vermeng de voorraad eiwitten oplossingen voor 5 s met behulp van een vortex-mixer.
- Verdund 100 µL van elke 2 mg/mL mAb oplossing met 0,9 mL gestolde voedingsbodem assay.
- Mix voor 5 s door vortex-mixer.
Opmerking: Deze oplossingen hebben een concentratie van 200 µg/mL. Verdunningen moeten worden uitgevoerd voor elke drievoud. - Verdun 10 & #181; L van elke 200 µg/mL mAb oplossing met 0.99 mL gestolde voedingsbodem assay. Mix voor 5 s met behulp van een vortex-mixer. Deze oplossingen hebben een concentratie van 2 µg/mL. Seriële verdunningen voor elk drievoud uitvoeren voordat u ze gebruikt in de neutralisatie assay.
- Maken van anti-TNFα mAb verdunningen in drie onafhankelijke microplates. Maak een kopie van elke onafhankelijke drievoud en afzien hen in één microplate, zoals aangegeven in tabel 1. Verwijst naar stof < tabel fo:keep-together.within-pagina = "1" fo:keep-met-next.within-pagina = "always" fo:text-align = "center" >
plaat 1 plaat 2 plaat 3 Wells monster Wells monster Wells monster B2:B11 referentiestof B2:B11 controlemonster B2:B11 analysemonster C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 analysemonster D2:D11 referentiestof D2:D11 controlemonster E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 controlemonster F2:F11 analysemonster F2:F11 referentiestof G2:G11 G2:G11 G2:G11 - Uitvoeren mAb verdunningen van elke referentie, proef, of controle, zoals weergegeven in tabel 2.
Opmerking: De anti-TNFα mAb concentraties in deze tabel worden beschreven zijn niet de eindconcentraties in de bepaling van de neutralisatie.
T kunnen 2: Anti-TNFα mAb verdunningen. Seriële verdunningen van het anti-TNFα mAbs zijn aangetoond in deze tabel. Eindconcentraties beschreven in deze tabel zijn niet de concentraties in de assay, waar anti-TNFα mAbs waren verdund met een factor 3 (mAb verdunning + kweekmedium cellen schorsing). Lijnen vetgedrukt vertegenwoordigen verdunningen uit lijnen 3, 5, 7, 9 en 10; niet-vette lijnen geven de verdunning van de lijnen 3, 4 en 6. Deze seriële verdunningen worden gedaan net voor het uitvoeren van de bepaling van de neutralisatie. Moet worden gezorgd om te mengen door pipetteren op en neer drie keer vóór de verstrekking van de verdunningen.Plaat kolom Volume van Assay kweekmedium (μL) Volume van referentiestof, analytische monster of besturingselement Monster (uL) concentratie in de Assay plaat (ng/mL) 2 0 230 2000 3 150 150 van lijn 2 1000 4 75 75 van lijn 3 500 5 100 50 van lijn 3 333 6 75 75 van lijn 4 < td > 2507 75 75 van lijn 5 166 8 75 75 van lijn 6 125 9 75 75 fro m line 7 83 10 75 75 van lijn 9 41 11 150 75 van lijn 10 13 - Houden van de platen op 25 ± 5 ° C tot gebruik.
4. Neutralisatie Assay met WEHI 164 cellen
- Mix door alle celopmaak schorsingen (0.5 x 10 6 cellen/mL) vóór de verstrekking bij elke stap van dit protocol vortexing.
Opmerking: In deze sectie, warm elke oplossing van 37 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik. - Breng 50 µL van de celsuspensie aan elk van de 60 putten van de microplates, de overgang van kolom 2 tot en met 11 en lijn B naar G.
- Breng 50 µL van mAb verwijzing, monster en controle verdunningen in microplates. Volg het patroon afgebeeld in Figuur 1.
- Toevoegen 50 µL van de apoptose inductie oplossing aan elk putje. De cellen van de
- de cellulaire besturingselementen gebruiken van 50 µL van WEHI 164, afgeleverd in drie putten. Elk putje brengen een eindvolume van 150 µL met assay kweekmedium.
- Gebruiken een besturingselement van de cytotoxiciteit van een mengsel van 50 µL van WEHI 164 cellen plus 50 µL van apoptose inductie oplossing. Elk putje brengen een eindvolume van 150 µL met assay kweekmedium.
- Voor de TNFα controle, gebruik van 50 µL van de apoptose inductie oplossing en breng het naar 150 µL met het kweekmedium assay.
- Gebruikt bij de blancobepaling, 150 µL van het kweekmedium assay alleen.
- Vul de resterende putten met 150 µL cultuurmedium plaat verdamping effecten te vermijden. Herhaal stap
- 4.1.1-4.1.9 twee keer in de twee andere microplates.
Opmerking: De eindconcentraties van mAb in de microplate zijn: 0.666, 0.333, 0.167 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 en 0,004 µg/mL. - Laden de monsters in microplates, zoals aangegeven in Figuur 1.
Figuur 1: vervreemding van monsters in de platen assay. B1 naar G11 zijn goed coördinaten in de microplates en beschrijven van de posities waar de steekproef verdunningen worden geplaatst. Ontbrekende coördinaten zijn putten gevuld met besturingselementen en assay kweekmedium (A1-A12 en H1-H12). Deze willekeurige distributie van monsters (forward en reverse verdunningen in de microplates) helpt bij het elimineren van vertekening in de resultaten als gevolg van de verdamping van medium of andere variabelen. Het is best dat elke microplate wordt gedaan door een analist op een moment. R:, S: referentiemonster, CS: controlemonster, Dil: verdunning. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. - Incubeer de drie platen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 16 ± 2 h.
- Laat het caspase-3/7 Glo reagens staan op 25 ± 5 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik.
- Voeg 100 µL van dit reagens aan alle putjes, met inbegrip van de monsters en besturingselementen.
- Schudden van de platen met behulp van een microplate vortex-mixer voor 3 min op 25 ± 5 ° C onmiddellijk na de verstrekking in de putjes.
- Incubeer de platen voor 2,5 ± 0.5 h op 25 ± 5 ° C, beschermd tegen licht.
- Invoegen de microplates in de luminometer het volgende gedeelte en vul.
5. Analyse van de resultaten
- met behulp van een software voor de detectie van luminescentie, selecteer de luminescentie modus en eindpunt functie.
- Selecteer een 96-Wells duidelijk-bodem plaat en zijn 80 interne wells, met uitzondering van de kolommen 1 en 12.
- Selecteer een tijd van de integratie van 1.250 ms en 10 s voor het mengen van de microplate vóór lezing.
- Selecteer de putjes waar referentiestof, analytische stof en controlemonster zal worden geplaatst en identificeren met hun bijbehorende concentraties.
- Lees de monsters geplaatst in de microplates met de luminometer.
- Gebruiken een vierde parameter vergelijking voor de analyses van resultaten. Grafiek van een dosis-responscurve, zoals afgebeeld in Figuur 2.
Figuur 2: dosis-responscurve. Anti-TNFα mAb concentratie versus luminescentie (de levensvatbaarheid van de cellen) is afgebeeld. Een vierde parameter vergelijking met een beschrijving van de anti-TNFα-bescherming van mAbs werd gebruikt als een model. EC50 is de concentratie van mAb die de hoeveelheid TNFα waardoor de dood van de cel van de 50% in elke assay neutraliseren kunt, wordt geïllustreerd in de grafiek als de verandering in de helling. Bars beschrijven de standaarddeviatie van luminescentie voor elke concentratie mAb. x staat voor anti-TNFα Ab concentratie en wordt afgebeeld als een logaritmische functie in ng/mL, terwijl y vertegenwoordigt de luminescentie reactie in willekeurige luminescentie eenheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Opmerking: In de vierde parameter vergelijking, C is de effectieve concentratie (EC50) 50. Deze waarde wordt gebruikt voor het vergelijken van de referentiestof, analytische monster en controlemonster met behulp van de functie effector. - Voor de berekening van de relatieve potencies, repareren van de ijkstof tot 100% en berekenen van de potencies van het monster en dienovereenkomstig controleren.
Opmerking: Deze waarden zijn afgebeeld in Figuur 3.
Figuur 3: wiskundige vergelijking gebruikt voor de berekening van de EC50s en de bijbehorende waarden. EC50-waarden, of C de parameters, hebben hun onzekerheid afgebeeld als de standaardfout. Een vergelijking van EC50s tussen de resultaten van het monster en de referentie van relatieve sterkte wordt ook afgebeeld. Het betrouwbaarheidsinterval wordt berekend met een α = 0,05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grafiek van de dosis-respons (met besturingselementen)
Figuur 1 vertegenwoordigt het antwoord van de luminescentie versus mAb concentratie. Deze sigmoïdale functie illustreert caspase-3 en 7 release in het kweekmedium assay als gevolg van lysis van de cel. Celdood wordt versterkt door serum honger plus TNFα signalering van inductie. Daarom is het anti-TNFα molecuul (mAb) communiceert met de cytokine, remmen (door sterische hinder) de interactie met de TNF cel receptor. Dit zorgt ervoor dat de overleving van de cel bij hogere concentraties van mAb.
De besturingselementen die zijn gebruikt in de methode waren: cellen met test medium, cellen plus TNFα plus assay kweekmedium cultuur en cultuur mediumalone assay. Cellen alleen met assay kweekmedium onder FBS honger ondergaan niet aan apoptosis, dus het ontwikkelen van luminescentie. Cellen die zijn blootgesteld aan TNFα alleen maar gecultiveerd met het kweekmedium overleefde bovendien inderdaad.
Een ander belangrijk besturingselement is het kweekmedium assay alleen. Hiermee helpt met het begrip van de moleculaire interferentie met betrekking tot het medium, specifiek eiwitten die het caspase-substraat verteren kan, geven dus een vals-positieve verlichte signaal. De EC50 en de relatieve sterkte resultaten zijn afgebeeld in tabel 3.
| Monster | EC50 | Relatieve sterkte (%) | Betrouwbaarheidsinterval (%) | RDS (%) |
| Referentiestof | 241,5 | 100 | -- | -- |
| 243.6 | ||||
| 234,2 | ||||
| Analysemonster | 225,2 | 99,7 | 86.0-115.1 | 8.5 |
| 240.3 | ||||
| 258.8 | ||||
| Controlemonster | 230,5 | 97,1 | 86,5-108,7 | 6,9 |
| 264 | ||||
| 248.4 |
Tabel 3: resultaten van de relatieve sterkte. Het analysemonster wordt vergeleken met een steekproef van de bekende potentie, beschreven in de tabel als referentie, met een vaste 100% sterkte. De relatie wordt berekend met de EC50-waarde van elk monster. Het interval wordt berekend bij een betrouwbaarheid van 95% (α = 0,05). RSD: relatieve standaardafwijking.
Tabel 3 toont de relatieve sterkte, in procenten, tussen een verwijzing mAb en een monster onder onderzoek. Vergelijkbaarheid wordt aangenomen binnen een bereik van 80-120% van de referentie. Echter, soms de verwijzing heeft grote variabiliteit tussen partijen; het bereik van aanvaarding kan daarom veranderen. Vandaar, is het gewenst referentie partijen binnen een korte termijn van de productie, aanscherping van de fysisch-chemische eigenschappen en aanvaarding interval te selecteren.
Deze tabel toont dat de verwijzing een werkzaamheid van 100%, heeft terwijl het analytische monster een werkzaamheid van 99,7 heeft %. Dit resultaat betekent dat het vermogen van de neutralisatie TNFα door het monster vergelijkbaar met die van de verwijzing is. Verwacht wordt dat aan de overexpressie van het cytokine gerelateerde ziekten kunnen worden gecontroleerd door deze mAbs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze karakterisering helpt te bepalen een priori het biologisch gedrag van een molecuul onder ontwikkeling voordat dure en tijdrovende klinische proeven zijn uitgevoerd. Het is ook nuttig voor de-charges-release van het product van een goedgekeurde drug. Het is vermeldenswaard dat deze testen nuttig zijn om te bepalen of een molecule een voldoende biologisch effect met betrekking tot het werkingsmechanisme heeft. De bio-analytische methode gepresenteerd in deze tutorial is uitermate belangrijk om de vergelijking van verschillende anti-TNFα moleculen. Ondanks de gemeenschappelijke fysisch-chemische methode kan deze methode bepalen, door middel van biologische middelen, de sterkte en de werkzaamheid van een geneesmiddel als een kenmerk van de kwaliteit, de volledige en volledige betekenis van de effector functies waarbij wordt aangetoond.
Algemeen, kunnen cel apoptosis klantgerichtheid TNFα een uitdagende taak voor onderzoekers uit te voeren. Oplossen van problemen kan worden uitgevoerd via de karakterisatie van de bank van de cel die wordt gebruikt op een dagelijkse basis voor het standaardiseren van deze biologische methode. Een voorbeeld is de variabiliteit van de respons cel binnen een bepaalde termijn met betrekking tot cellijn veroudering12. Dit probleem wordt geëlimineerd met behulp van een bank van de master cel bevroren bij-80 ° C. De bank van de cel werken moet groot genoeg zijn om de eisen van een DOE-studie uitgevoerd door R dekken & D of een periode van één jaar voor gebruik in het laboratorium voor kwaliteitscontrole. Ook kan deze reactietijd worden vastgesteld met behulp van temperatuur-gestabiliseerde oplossingen voordat u deze toevoegt aan cellen bij elke stap tijdens dit protocol. Ten minste drie keer moeten worden uitgevoerd voordat een neutralisatie-bepaling uitgevoerd en het beperken van de tijdsduur die cellen worden gekweekt in continue cultuur als gevolg van de aanpassing en de bevolking dynamics12,13.
TNFα molecuul beschermd moet worden tegen bevriezen-ontdooien cycli, zoals de potentie van dit eiwit is aanzienlijk ondermijnd als niet gestabiliseerd. Formuleringen aangehaald elders14 cytokine voorbereiding worden voorgesteld wanneer de gereconstitueerde cytokine worden opgeslagen, zoals de concentratie van TNFα cruciaal voor succes van het protocol is. Responsiviteit van een cel aan een cytokine is afhankelijk van het aantal receptoren per cel. De optimale concentratie TNFα is daarom, afhankelijk van de cel lijn en dichtheid15,16. We TNFα verdund tot een eindconcentratie van 13,3 ng/mL en de celdichtheid met behulp van een curve naast 25.000 cellen/waterput aangepast. Daarom moet de celdichtheid worden gecontroleerd voor elke TNFα-concentratie.
Camacho-Villegas et al. meldt een TNFα-eindconcentratie van 1,25 ng/mL; deze groep maakt ook gebruik van actinomycin D als een stress cel factor9,17,18. We in plaats daarvan veranderd de FBS van 10% naar 1% uit kweekmedium naar assay medium, geeft een sterke stress-signaal voor het opwekken van apoptosis in WEHI 164 cellen met TNFα alleen, het elimineren van een andere variabele uit het protocol. Andere groepen melden met behulp van MTT de levensvatbaarheid van de cellen. Methoden met behulp van een luminescentie substraat gevoelig voor caspase-37, in plaats van de spectrofotometrische methode waar de UV-Vis extinctie stoffen aanwezig in het kweekmedium of de cellen zelf (bijvoorbeeld fenol rood geabsorbeerd zijn door cellen), kan interfereren met het signaal. Dus, de gevoeligheid van de test werd verhoogd met behulp van deze Ac-DEVD-pNA-luminescentreactant, zoals de aanwezigheid van luminescente stoffen (achtergrond) in het kweekmedium wordt niet verwacht.
Een beperking van deze methode is dat het alleen kan worden toegepast op TNFα-gevoelige cellen; andere cellen lijnen moeten worden getest en de concentratie van cytokine aangepast voor een geoptimaliseerde cellulaire respons. Bovendien, het absolute antwoord kan niet worden gemeten, zoals we zijn niet met behulp van een primaire cellijn of een in vivo test; in plaats daarvan, orthogonale isothermische titratie calorimetrie (ITC) experimenten worden voorgesteld voor de aanpassing van de eerste methode. Informatie van ITC is nuttig voor TNFα affiniteit met een nieuwe molecule in ontwikkeling en voor het opgeven van de oorspronkelijke voorwaarden in de biologische methode.
Deze methode is handig voor het testen van nieuwe moleculen als onderzoekers een referentiestof hebben voor het verkrijgen van een basale relatieve reactie; Dus, de evaluatie van een bio-beter of een moleculaire antwoord met betrekking tot de bescherming van de cel wordt aanbevolen. Het kan worden toegepast op andere anti-TNFα-eiwitten. Het is bijvoorbeeld van toepassing op de beoordeling van de relatieve biologische potentie van Etanercept, Infliximab, Certolizumab of Golimumab19. Alle deze anti-TNFα-moleculen hebben echter verschillende affiniteiten voor de cytokine; Daarom moeten hun concentraties individueel worden aangepast. Een ander voordeel van deze methode is de korte periode tussen de opening van experimenten en het bereiken van resultaten, waardoor het gemakkelijk is om uit te voeren en goedkoop vergeleken met diermodellen. Verder, deze methode meet interactie van de mAb met een volledig actieve TNFα-molecuul, suggereren dat de mAb de TNFα trimeer is herkennen en dat de moleculen niet waren gewijzigd tijdens de opslag of laboratorium manipulatie. Aan de andere kant, is een puur fysisch-chemische test resultaat nog steeds dubieus. Interactie tussen TNFα en een met behulp van een conventionele ELISA mAb kunnen bijvoorbeeld een artefact met betrekking tot structurele veranderingen als gevolg van cytokine chemische immobilisatie; Dus, de affiniteit kan worden aangetast en de metingen aangetast. Bovendien, tijdens ITC analyses, verdunning oplossingen kunnen wijzigen de structuur van TNFα of de mAb, dus remmen TNFα trimeer vorming, mAb interactie of artefactuele epitoop generatie. Het gebruik van primaire cellen lijnen in deze methode kan worden geëist; bescherming tegen TNFα kan toch interessante resultaten, het nabootsen van in vivo reacties geven.
We ontwierpen deze methode eenvoudig te volgen en reproduceerbaar. Zoals luminescentie kan niet worden gemaskeerd door fenol rood of anderestoffen extinctie UV-Vis, kan bijna elke kweekmedium toevoegingsmiddel worden gebruikt voor de teelt van cellen. Deze wijziging aids onderzoekers in de studie van veeleisende cellijnen, met een reactie van de volledige detectie voor levensvatbaarheid na cytokine behandeling. Ten minste drie passages van de cel en de cel dichtheid aanpassingen moeten plaatsvinden voordat de neutralisatie-test wordt uitgevoerd. Ook stabiliseren de cytokine en de concentratie ervan, zowel als opwarming van de aarde en zo de CO2 -concentratie in de kweekmedium en oplossingen zijn kritische stappen voor assay succes. Globaal, dit artikel bevat de stappen nodig om te neutraliseren TNFα cytokine met een mAb met behulp van een in vitro biologische test te vergelijken een referentiepunt en een steekproef onder ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de nationale Raad voor wetenschap en technologie (CONACYT), Mexico verlenen PEI CONACYT 2015 220333, zonder deelname van het ontwerp van de studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | -- |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | -- | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
