Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Определение относительной силы из анти-ФНО моноклональных антител (МАБ), Neutralizing ФНО, с помощью метода Биоаналитические In Vitro

Published: September 16, 2017 doi: 10.3791/55376
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Research and Development, Probiomed, 2Bioprocess Research and Development Unit, Instituto Politecnico Nacional

Summary

Здесь представлены протокол для определения относительной анти apoptotic активности анти TNFα МАБ, с помощью механизма нейтрализации с WEHI 164 клеток. Этот протокол полезно для сравнения нейтрализации прочности различных молекул с той же биологической функциональности.

Abstract

Этот протокол показывает измерение нейтрализации деятельности apoptotic TNFα мыши модели клетки фибробластов (WEHI 164) с помощью анти TNFα МАБ. Кроме того этот протокол может использоваться для оценки других анти TNFα молекул, таких как синтез белков. Сотовая модель, работающих здесь чувствителен к TNFα-опосредованной апоптоза, когда дополнительный стресс-фактор индуцируется в условиях культуры клеток (например, лишение сыворотки). Эта процедура является примером того, как выполнить этот аналитический assay, подчеркнув основные операции, относящиеся к пробоподготовки, клетки разрежения, индукции апоптоза и спектрофотометрические измерения, которые имеют решающее значение для обеспечения успешных результатов. Этот протокол показывает лучшее исполнение условий, касающихся индукции апоптоза и эффективный сигнал записи, что приводит к низкой неопределенности значений.

Introduction

Биологическая потенции является количественная мера биологической активности на основе атрибутов Оксиметрический анализ продукта, которые связаны с соответствующими биологическими свойствами, тогда как количество (выраженное в массе) — физико-химические измерения содержания белка. Потенция испытания, наряду с другой аналитической методологии, выполняются как часть соответствия продукции, стабильности и сопоставимости исследований. В этом смысле потенции измерения используются для демонстрации продукта пакеты удовлетворения критических качества атрибутов (CQAs) или критерии приемки на всех этапах клинических испытаний и после утверждения рынка.

Apoptosis запрограммированная смерть клетки, естественно происходит когда клетки заражены вирусом или когда клетки подчеркнули экологической фактор что компромиссы клеточной жизнеспособности и функция1,2. Среди прочего ингибирование апоптоза, или биологического обезвреживания, является одним из главным образом известные терапевтические механизмы mAbs, особенно в лечении хронических заболеваний, таких как воспалительные заболевания иммунной системы. Анти-TNFα молекул прилагать свои лечебные свойства, блокируя взаимодействие фактора некроза опухоли альфа (TNFα) с p55 и Р75 клеток поверхности рецепторы3, таким образом предотвращая пути сигнала, которые в итоге привести к сотовой апоптоз.

TNFα могут производить воспаления в некоторых хронических заболеваний4. Ложный TNFα выделяется во внеклеточных среды макрофагами, которые являются часовых иммунной системы и основных субъектов в такого рода заболевания5. Как общий путь TNFα дерегулирование ассоциируется с патогенез этих болезней. Без контроля и под постоянным индукции и клетки стресс TNFα индуцирует смерти и тканей дегенерация клетки, в конечном счете приводит к ревматоидный артрит, болезнь Крона и другие патологические профили6.

Антагонисты ФНО, которые блокируют взаимодействие между ФНО и его рецепторов все чаще используются в качестве эффективной терапии для снижения симптоматики и препятствовать прогрессирование этих заболеваний. В настоящее время анти TNFα наркотиков продукты широко используются для управления системного концентрация этого цитокина, таким образом предотвращая дальнейшее дегенерацию связанные тканей. В этом смысле обеспечивая воспроизводимость и надежные биопроб для описания конкретных способность препарата для достижения его биологического эффекта является императивом.

В этом протоколе, критические шаги определены в ходе разработки нейтрализации пробирного-для успешного измерения биологических потенции выделяются, с особым упором на развитие навыков, необходимых для выполнения био аналитического метода. Этот био аналитический метод обеспечивает полезные сопоставимости информации между различными партиями или анти TNFα лекарственных средств по сравнению с клинически проверенных ссылка вещество.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. подготовка средств массовой информации и решения

  1. подготовить питательной среды: RPMI 1640 с 10% FBS, рН 7,4.
  2. Подготовка анализа питательной среды: RPMI 1640 без фенола красного, но с 1% FBS, рН 7,4.
  3. Подготовка клетки промывочный раствор: DPBS мг и Ca бесплатно раствор с 0,02% ЭДТА, рН 7,4.
  4. Подготовить мобильный отряд решение: 0,125% трипсина с 1 мм ЭДТА.
    1. Оттепель 100 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА и передачи стерильный флакон 500 мл.
    2. Смесь с 100 мл ячейки промывочный раствор и отказаться от 15 мл аликвоты в 15 мл стерильные пробирки. Магазин на -70-80 ° c до использования.
    3. Фильтр эти решения через мембрану 0,22 мкм и тепло до 37 ° C для по крайней мере 30 минут до использования.
  5. Подготовить индукции апоптоза запасов раствор TNFα на 3,3 мкг/мл.
    1. Растворяют 20 мкг TNFα с 500 мкл фильтр стерилизации воды в его первичного контейнера и перемешать до полного растворения.
    2. Передача в 15 мл стерильной пробирке и добавьте 5,5 мл раствора DPBS мг и Ca бесплатно эту трубку. Перемешать аккуратно с помощью вихревой смеситель.
    3. Алиготе решение порционно 70 мкл. Отказаться от каждого Алиготе в 0,5 мл пробирок и хранить на -80 ° C.
  6. Подготовить апоптоз индукции решение: TNFα раствор 40 нг/мл.
      ,
    1. Оттепель Алиготе Стоковый раствор индукции апоптоза, инкубации его в водяной бане при 25 ° c на 10 мин
    2. Развести индукции апоптоза запасов решение 40 нг/мл, добавив 61 мкл раствора TNFα 3,3 мкг/мл 4.939 мл пробы питательной среды в 15 мл стерильной пробирке.
    3. Смесь, вихревой смеситель для 10 s; это решение должны быть готовы свежезаваренным перед использованием.
    4. Разогреть решение до 37 ° C для по крайней мере 30 минут до использовать th eneutralization пробирного.
  7. Для приготовления раствора субстрата: каспазы-3/7 Glo решения 7 ,- 8.
    1. Оттепель 12 h перед использованием caspase буферного раствора (буфер Glo каспазы-3/7).
    2. Пусть caspase буферного раствора и субстрата (каспазы-3/7 гло субстрате) сидеть отдельно при температуре 25 ± 5 ° C за 30 мин до смешивания.
    3. Передачи 10 мл буферного раствора caspase субстрат флакона и перемешать путем инверсии.
    4. Держать на 25 ± 5 ° C, защищены свет до использования.
      Примечание: Решение сохраняет стабильность в течение 6 ч при комнатной температуре.

2. Клетки Culturing и подсчета

  1. клеток оттаивания и первый субкультура.
    1. Удалить один флакон с WEHI 164 клетки 9 из морозильника в-80 градусов и передавать их на ледяной бане.
    2. Вверх и вниз Пипетка с 1 мл раствора подогретым питательной среды, до тех пор, пока полностью разморозить замороженные клетки.
    3. Обойтись 9 мл подогретым питательной среды на 15 мл стерильной пробирке.
    4. Передача суспензию клеток в 15 мл стерильной пробирке и смешайте нежно пять раз путем инверсии.
    5. Центрифуга суспензию клеток в 125 x g на 3 мин удалить супернатант и разбить ячейки Пелле.
    6. Добавить 5 мл питательной среды на трубу. Перемешать до тех пор, пока клетки полностью высокомобильна.
    7. Для подсчета клеток, передачи 50 мкл суспензии клеток к 500 мкл Микропробирка и смешивают с 50 мкл 0,4% Трипановый синий. Подсчитать количество ячеек и приспособиться к 0,5 х 10 6 клеток/мл. Ниже шаг 2,2,.
    8. Добавить 13 мл подогретым питательной среды в колбе культуры клеток 75 мл.
    9. Обойтись достаточно подвеска объем ячейки от шага 2.1.6 для достижения 0,5 х 10 6 клеток/мл в колбу культуры клеток и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO 2 на ночь.
  2. Клеток подсчета.
    Примечание: См. ссылку 10.
    1. С помощью решения от шага 2.1.6, передача 0,05 мл Горяева и определить плотность клеток под микроскопом, с помощью исключения Трипановый синий.
    2. Подсчитать общее количество клеток и жизнеспособных клеток.
    3. Настроить клеточных суспензий 0,5 x 10 6 клеток/мл.
      Уравнение 1
      V питательной среды (мл) = Equation 1
      V питательной среды (мл) = (5 мл - V суспензию клеток)
      V питательной среды (мл) = скорректированный объем WEHI 164 Сотовый подвеска
      NVC = количество жизнеспособных клеток/мл WEHI 164
      V питательной среды (мл) = Assay объем культуры среднего добавлен в суспензию клеток для достижения 0,5 х 10 6 клеток/мл
      0,5 x 10 6 = плотность клеток целевой
  3. Сотовый отряда и второй и третий субкультура.
    Примечание: Вакуумная система может использоваться для удаления решения из колбы. Может быть использован стекла или одноразовые стерильные пипетки. Если дозатор имеет хлопок забивают на вершине, он должен быть удален перед использованием.
    1. Удалить питательной среды из клеточной культуры T-колбу с использованием 1 мл стерильной пипеткой и вакууме.
      2. Решение
    2. обойтись 5 мл мыть ячейки в культуру T-колба, осторожно перемешать и отменить решение. Повторите этот шаг дважды.
      Примечание: Полное удаление питательной среды имеет решающее значение для эффективного клеток отряда.
    3. Добавить 15 мл раствора отряд клеток T-колбу и дать постоять 3 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2.
    4. Проверить отсутствие прилагаемый клеток в колбу внутренней стене под микроскопом. Удаление ячеек из культуры T-колбу с помощью 20 мл стерильной пипеткой и распределять их в 50-мл стерильной пробирке.
    5. Центрифуга суспензию клеток в 125 x g на 3 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с другой 5 мл питательной среды.
    6. Подсчитать количество ячеек и добавить достаточно питательной среды для достижения желаемой клетки концентрация согласно уравнение 1.
    7. Добавить Эта подвеска в 72 см 2 T-колбу и инкубировать на ночь при 37 ° C и 5% CO 2 и.
    8. Субкультура assay клетки по крайней мере два раза перед их использованием в нейтрализации. Повторите шаги 2.3.1-2.3.8 для следующих двух дней.
  4. Assay суспензию клеток.
    1. Выберите WEHI 164 субкультуры, имеющий по крайней мере три пропуска. Шаг 2.1.
    2. Отсоединение и подсчитать количество ячеек согласно шаги 2.2 и 2.3 настоящего Протокола.
    3. Разбавления суспензии клеток согласно уравнение 1 до 0,5 х 10 6 клеток/мл.
    4. Использовать этот сотовых подвеска для нейтрализации assay. Смешайте все клеточных суспензий, вихревой смеситель до использования.

3. Подготовка антител и разведения

  1. Quantitation mAbs.
    1. Определить концентрацию вещества ссылка, образец элемента управления и аналитической пробы через поглощения УФ на 280 Нм, используя коэффициент (1.39) их массового вымирания 11.
      Примечание: Оригинальный концентрации могут быть взяты из наркотиков этикетках. Однако, это должна быть подтверждена УФ поглощения.
  2. МАБ разведениях.
    1. Все развести образцы независимо друг от друга в трех экземплярах, мг - и Ca свободно раствором DPBS в 2 мл пробирок, вплоть до 2 мг/мл. Подтвердите этот концентрации, УФ поглощения в трех экземплярах, с помощью DPBS мг и Ca бесплатно решения как пустые.
    2. Смесь фондовых белка решения для 5 s с помощью вихревой смеситель.
    3. Разбавляют 100 мкл каждого решения МАБ 2 мг/мл 0,9 мл пробы питательной среды с.
    4. Смесь для 5 s, вихревой смеситель.
      Примечание: Эти решения имеют концентрацию 200 мкг/мл. Разведений должно быть сделано для каждого экземплярах.
    5. Развести 10 & #181; L каждое решение МАБ 200 мкг/мл с 0.99 мл пробы питательной среды. Смесь для 5 s с помощью вихревой смеситель. Эти решения имеют концентрацию 2 мкг/мл. Выполнение серийных разведений для каждого экземплярах перед их использованием в нейтрализации assay.
    6. Сделать анти TNFα МАБ разведений в трех независимых планшет. Сделать дубликат из каждой независимой экземплярах и распределять их в одном микроплиты, как указано в таблице 1. Ссылка вещество < таблица fo:keep-together.within-страницы = «1» fo:keep-с-next.within-страницы = «всегда» fo:text-выравнивание = «center» > пластина 1 2 пластины пластина 3 Уэллс образец скважин образца скважин образца B2:B11 ссылка вещество B2:B11 Образец элемента управления B2:B11 аналитической пробы C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 аналитической пробы D2:D11 ссылка вещество D2:D11 Пример элемента управления E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 Образец элемента управления F2:F11 аналитической пробы F2:F11 вещество ссылки G2:G11 G2:G11 G2:G11 Таблица 1: Гонав образец массивы. Полной нейтрализации пробирного должна выполняться в трех планшетов в пределах координат B2 для G11. Случайные дозирования ведения, аналитические и контрольные образцы позволяют исследователям для проверки каких-либо отклонений в assay.
    7. Выполнять МАБ разведений каждой ссылки, образец, или управления, как показано в таблице 2.
      Примечание: Концентрации МАБ анти TNFα, описанные в этой таблице являются не окончательный концентрации в assay нейтрализации. < td > 250
      Плиты столбца объем пробы питательной среды (мкл) объем справочных вещество, аналитической пробы или управления Пример (uL) концентрация в Assay пластины (нг/мл)
      2 0 230 2000
      3 150 150 из строки 2 1000
      4 75 75 от линии 3 500
      5 100 50 от линии 3 333
      6 75 75 из строки 4
      7 75 75 от линии 5 166
      8 75 75 от линии 6 125
      9 75 75 сюда m линия 7 83
      10 75 75 из строки 9 41
      11 150 75 от линии 10 13
      Т возможность 2: анти-TNFα МАБ разведениях. Серийных разведений анти TNFα mAbs демонстрируются в этой таблице. Окончательный концентрации, описанные в этой таблице являются не концентрации в assay, где анти TNFα mAbs разводили с коэффициентом 3 (МАБ разрежения + культура среднего + подвеска клетки). Линии жирным шрифтом представляют разведениях от линии 3, 5, 7, 9 и 10; линии не жирным шрифтом представляют разрежения от линии 3, 4 и 6. Эти серийных разведений выполняются перед выполнением нейтрализации assay. Необходимо позаботиться mix закупорить вверх и вниз три раза перед подачей разведениях.
    8. Держите пластины 25 ± 5 ° C до использования.

4. Нейтрализация проба с WEHI 164 клетки

  1. микс, vortexing, все клетки суспензий (0,5 х 10 6 клеток/мл) до выдачи на любом этапе данного протокола.
    Примечание: В этом разделе, теплый каждое решение до 37 ° C за 30 мин до использования.
  2. Передача 50 мкл суспензии клеток каждого из 60 скважин планшет, переход от столбца 2-11 и линии B-G.
  3. Передачи 50 мкл МАБ, образец, и управления разведений в планшет. Следуйте схеме изображен на рисунке 1.
  4. Добавьте 50 мкл раствора индукции апоптоза для каждой скважины.
  5. Использование клеточных элементов 50 мкл WEHI 164 клетки, обойтись в трех скважинах. Принесите каждой скважины в окончательный объем 150 мкл с Пробирной культуры среднего.
  6. Использовать элемент управления цитотоксичность смеси 50 мкл WEHI 164 клеток плюс 50 мкл раствора индукции апоптоза. Принесите каждой скважины в окончательный объем 150 мкл с Пробирной культуры среднего.
  7. Управления для TNFα, использовать 50 мкл раствора индукции апоптоза и довести его до 150 мкл с питательной среды пробирного.
  8. Для заготовки, используйте 150 мкл пробирного питательной среды одиночку.
  9. Заполнить оставшиеся скважин с 150 мкл питательной среды, чтобы избежать испарения эффектов пластина.
    10. 4.1.1-4.1.9
  10. повторите шаги дважды в двух других планшетов.
    Примечание: Окончательный концентрации МАБ в являются: 0.666 микроплиты, 0.333 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 и 0,004 мкг/мл.
  11. Загрузить образцы в планшет, как указано на рис. 1.
    Figure 1
    Рисунок 1: расположения образцов в пластинах пробирного. B1 G11 хорошо координаты в планшет и описания позиции, где размещены разведения образца. Отсутствующие координаты являются колодцы, заполненные с элементами управления и анализа питательной среды (A1-A12 и H1-H12). Это случайное распределение образцов (прямого и обратного разведений в планшет) помогает устранить предвзятость в результатах из-за испарения среднего или других переменных. Это лучшее, что каждый Гонав делается один аналитик одновременно. R: ссылку, S: пример, CS: образец элемента управления, Дил: разрежения. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
  12. Инкубировать три пластины при 37 ° C и 5% CO 2 для 16 ± 2 ч.
  13. Пусть стоять на 25 ± 5 ° C 30 мин перед использованием реагента Glo каспазы-3/7.
  14. Добавить 100 мкл этого реагента для всех скважин, включая примеры и элементы управления.
  15. Shake пластины Гонав вихревой смеситель для 3 мин при температуре 25 ± 5 ° C сразу же после подачи в скважины.
  16. Инкубировать пластин для 2,5 ± 0,5 ч при температуре 25 ± 5 ° C, защищать от света.
  17. Вставить микрофонroplates в Люминометр и завершить следующий раздел.

5. Анализ результатов

  1. с помощью программного обеспечения для обнаружения люминесценции, выберите функцию, режим и конечной люминесценции.
  2. Выберите 96-луночных ясно нижней пластины и его 80 внутренних скважины, за исключением колонки 1 и 12.
  3. Выберите время интеграции 1250 ms и 10 s для смешивания микроплиты перед чтением.
  4. Выберите скважин, где ссылка вещество, аналитической вещество и образец элемента управления будут размещены и идентифицировать себя с их соответствующими концентрациями.
  5. Читать образцов, размещенных в планшет с люминометра.
  6. Использовать четвертый параметр уравнение для анализа результатов. График кривой доза реакция, как показано на рис. 2.
    Figure 2
    Рисунок 2: кривая доза реакция. Изображен анти-TNFα МАБ концентрации по сравнению с люминесценции (жизнеспособность клеток). Четвертый параметр уравнение, описывающее анти TNFα защиты mAbs использовался в качестве модели. ЭК50 является концентрация МАБ, которые могут нейтрализовать количество TNFα, которые вызывают гибель клеток 50% в калибровочных, примером в графе как изменения в склон. Бары описывают стандартное отклонение свечения для каждого МАБ концентрации. x представляет анти TNFα Ab концентрацию и изображается как логарифмическая функция в нг/мл, а y представляет люминесценции ответ в единицах произвольных люминесценции. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
    Примечание: В уравнении четвертый параметр C является эффективная концентрация 50 (ЭК50). Это значение будет использоваться для сравнения ссылка вещество, аналитической пробы и пример элемента управления с помощью функции эффекторных.
  7. Для расчета относительных потенции, исправить ссылку вещества до 100% и рассчитать потенции образца и контроля соответственно.
    Примечание: Эти значения изображены на рис. 3.
    Figure 3
    Рисунок 3: математические уравнения, используемые для расчета EC50s и их значения. Значения ЭК50, или C параметры, имеют их неопределенности, изображается как стандартная ошибка. Изображен также сравнение EC50s между результатами выборки и ссылки относительной силы. Доверительный интервал вычисляется с α = 0,05. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Доза реакция граф (с элементами управления)
Рисунок 1 представляет люминесценции ответ против концентрации МАБ. Эта функция сигмоид олицетворяет caspase 3 и 7 релиз в среде культуры пробирного благодаря лизис клеток. Гибель клеток усиливается сыворотки голода плюс TNFα, сигнализации индукции. Таким образом анти TNFα молекулы (МАБ) взаимодействует с цитокинов, ингибирующих (путем их пространственной помех) его взаимодействие с TNF клеточных рецепторов. Это вызывает выживаемость клеток в более высоких концентрациях МАБ.

Элементы управления, используемые в методе были: клетки с assay культура среднего, клетки плюс TNFα плюс пробирного питательной среды и пробирного культуры mediumalone. Клетки, наедине с Пробирной питательной среды под FBS голода не претерпела к апоптозу, тем самым развивая люминесценции. Кроме того клетки подвергаются TNFα только но культивируемых с питательной среды действительно выжить.

Еще один важный элемент управления является только Пробирная питательной среды. Это контролирует помогает с понимание молекулярных вмешательства, касающимся средний, специально белков, которые могут переварить caspase субстрата, показывая тем самым, ложно положительных светящийся сигнал. ЭК50 и относительной силы результаты изображены в таблице 3.

Пример ЭК50 Относительной силы (%) Доверительный интервал (%) RDS (%)
Ссылка вещество 241.5 100 -- --
243,6
234.2
Аналитической пробы 225.2 99,7 86.0-115.1 8.5
240.3
258.8
Пример элемента управления 230.5 97,1 86,5-108,7 6.9
264
248.4

Таблица 3: результаты относительной силы. Аналитической пробы сравнивается с известным потенции образец, описанные в таблице как ссылка, с фиксированной 100% потенцию. Отношение вычисляется с ЭК50 каждого образца. Интервал вычисляется в 95% доверия (α = 0,05). RSD: относительная стандартное отклонение.

Таблица 3 показывает относительную потенции, в процентах, между ссылку МАБ и образец под следствием. Сопоставимости предполагается в диапазоне 80-120% ссылки. Однако иногда ссылка имеет большой изменчивости между сериями; Таким образом можно изменить диапазон приема. Следовательно желательно выбрать ссылку пакеты в течение короткого периода производства, затянув физико-химических свойств и принятие интервала.

Эта таблица показывает, что ссылка имеет потенции 100%, в то время как аналитические выборки имеет потенцию 99,7%. Этот результат означает, что возможности нейтрализации TNFα в образце сопоставима с ссылки. Ожидается, что болезни, связанные с гиперэкспрессия цитокинов может управляться этими mAbs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта характеристика позволяет определить априори биологическое поведение молекулы стадии разработки прежде чем дорогим и трудоемким клинические испытания проводятся. Это также полезно для выпуска партии партии утвержденный препарат. Стоит отметить, что эти анализы являются полезными для определения если молекула имеет надлежащее биологическое воздействие относительно механизм его действия. Био аналитический метод, представленный в этом учебнике критически важен для сравнения различных анти TNFα молекул. Несмотря на общий физико-химический метод эта методология может определить, через биологические средства, потенции и эффективности препарата как атрибут качества, тем самым показывая полное и полное значение эффекторных функций.

Обычно апоптоз клеток реагировать TNFα может быть сложной задачей для исследователей для выполнения. Устранение неполадок может проводиться через характеристику ячейки банка, который используется на ежедневной основе до стандартизации этот биологический метод. Одним из примеров является изменчивость клеток ответ в течение периода времени, касающиеся старения клеток линия12. Эта проблема устраняется с помощью Мастер ячейки банка, Замороженные при температуре-80 ° C. Банк клеток работы должна быть достаточно большой, чтобы покрыть требования Доу исследования, проведенного R & D или один летний период для использования в лаборатории контроля качества. Кроме того этой реакции может быть исправлено с помощью Температура Стабилизированный решения перед их добавлением в клетки в любой момент во время этого протокола. По крайней мере три пропуска должны быть выполнены перед запуском нейтрализации пробирного и ограничивает продолжительность времени, что клетки выращивают в непрерывной культуре вследствие адаптации и населения динамики12,13.

TNFα молекулы должны быть защищены от циклов замораживания оттаивания, как потенции этого белка существенно подорваны, если не стабилизировалась. Формулировки цитируется, что других14 для приготовления, цитокин предложил, когда будет храниться восстановленный цитокина, как концентрация TNFα имеет решающее значение для успеха протокола. Реакции клетки к цитокинов зависит количество рецепторов в клетку. Таким образом оптимальная концентрация TNFα зависит от клеток линии и плотность15,16. Мы разбавляют TNFα до конечной концентрации 13,3 нг/мл и корректировать плотность клеток с использованием кривой вокруг 25 000 клеток/хорошо. Таким образом плотность ячеек должны быть проверены для каждого TNFα концентрации.

Камачо Вильегас и др. сообщает TNFα конечная концентрация 1,25 нг/мл; Эта группа также использует актиномицин Д как стресс клетки фактор9,17,18. Вместо этого поменяли FBS от 10% до 1% от питательной среды для анализа среды, давая сигнал сильный стресс для индуцировать апоптоз в клетках WEHI 164 с TNFα одиночку, устраняя другой переменной из протокола. Другие группы сообщают жизнеспособность клеток с помощью MTT. Методологии с использованием люминесценции субстрата, чувствительных к caspase 37, вместо спектрофотометрического метода, где UV-Vis поглощения вещества присутствуют в культурной среде или сами (например, фенола Красного всасывается клетки клетками) могут мешать сигнал. Таким образом чувствительность анализа был увеличен с помощью этого luminescentreactant Ac-DEVD-pNA, как не ожидается присутствие светящиеся веществ (фон) в среде культуры.

Ограничением этого метода является, что она может применяться только к TNFα-чувствительные клетки; другие линии клетки должен быть испытан и концентрации цитокинов приспособлены для оптимизированного клеточного ответа. Кроме того абсолютный ответ не может быть измерена, как мы не используем линии главной ячейки или в естественных условиях assay; Вместо этого для первоначальный метод регулировки предлагаются ортогональных изотермический титрования калориметрии (ЦМТ) эксперименты. Информация от ЦМТ является полезной для установления TNFα сродство с молекулой новой стадии разработки и определения исходных условий в биологический метод.

Этот метод полезен для тестирования новых молекул, когда исследователи имеют ссылку вещества для получения базальной относительной ответ; Таким образом рекомендуется использовать оценки био лучше или молекулярный ответ, касающимся защиты клеток. Она может применяться к другим анти TNFα белков. Например это применимо к оценке относительной биологической силы этанерцепт, инфликсимаб, Certolizumab или Golimumab19. Однако все эти анти TNFα молекулы имеют различные сродства для цитокинов; Таким образом их концентрации должна корректироваться индивидуально. Еще одним преимуществом данного метода является короткое время между началом экспериментов и достижения результатов, что делает его легко выполнить и недорогой по сравнению с животных моделей. Кроме того этот метод меры взаимодействия МАБ с полностью активные молекулы TNFα, предполагая, что МАБ является признание тример TNFα и что молекулы не были изменены во время хранения или лаборатории манипуляции. С другой стороны чисто физико пробирного результат по-прежнему сомнительна. Например взаимодействие между TNFα и МАБ, с использованием обычных ELISA может быть артефактом, касающимся структурных изменений, обусловленных цитокина химической иммобилизации; Таким образом могут быть затронуты сродство и измерения скомпрометированы. Кроме того в ходе анализа ЦМТ, разбавления решения можно изменить структуру TNFα или МАБ, препятствуя таким образом доступу TNFα тример формирования, МАБ взаимодействия или артефакты epitope поколения. Использование первичных элементов линии в этом методе могут быть требовательным; Тем не менее защита от TNFα может дать интересные результаты, подражая ответы в естественных условиях .

Мы разработали этот метод, чтобы быть легко следовать и воспроизводимость. Как люминесценция нельзя быть замаскированы фенола красного или других веществ, поглощение UV-Vis, почти каждый культуры среднего добавки могут использоваться для выращивания клеток. Эта модификация СПИДа исследователей в исследовании сложных клеточных линий, с полной обнаружения ответом для жизнеспособности после лечения цитокина. Перед выполнением нейтрализации пробирного должны проводиться по меньшей мере три ячейки проходы и корректировки плотности клеток. Кроме того, стабилизации цитокинов и его концентрации, а также потепления и equilibrating концентрации CO2 в питательной среды и решения являются важные шаги для анализа успеха. В целом эта статья показывает шаги, необходимые для нейтрализации TNFα цитокинов с МАБ, используя в vitro биологические испытания для сравнения ссылку и образец в стадии разработки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национального Совета по науке и технике (КОНАСИТ), Мексика Грант PEI КОНАСИТ 2015 220333, без участия в разработке исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
WEHI 164 ATCC CRL-1751 Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium ATCC 30-2001 Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red GIBCO 11835-030 Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red GIBCO 25200-056 Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium GIBCO 14190-136 Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein R&D Systems 210-TA-020 Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG HyClone SH3089803 Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized HyClone SH3007103 Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit Promega G8093 Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent J.T.Baker 8993-01 --
Sample mAb Adalimumab Probiomed NA Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab Abbvie NA Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader Molecular Devices 89429-536 SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software  Molecular Devices -- SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator  Revco  30482 Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood  The Baker Company   200256 Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2          

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
  3. Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
  4. Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
  5. Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
  6. Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
  7. Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
  8. Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
  9. Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
  10. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
  11. Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
  12. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  13. Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
  14. Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
  15. Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
  16. Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
  17. Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
  18. Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
  19. Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).

Tags

Медицина выпуск 127 апоптоз нейтрализация пробирного фактора некроза опухоли альфа анти TNFα МАБ biocomparability
Определение относительной силы из анти-ФНО моноклональных антител (МАБ), Neutralizing ФНО, с помощью метода Биоаналитические <em>In Vitro </em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tierrablanca-Sánchez, L.,… More

Tierrablanca-Sánchez, L., Pérez Medina Martínez, V., Ramírez Ibañez, N. D., Pérez Ramírez, N. O., Flores Ortiz, F. L., Medina-Rivero, E. Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method. J. Vis. Exp. (127), e55376, doi:10.3791/55376 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter