Summary
描述了采用磁性纳米颗粒，以检测和富集的功能和表型分析抗原反应性B细胞中的简单而有效的方法。
Introduction
限制稀释抗体分泌细胞前体的频率的分析已经表明，该反应的特定抗原的B细胞通常发生在0.05〜0.005％，在正常剧目的频率取决于接种的状态和存在于抗原表位的大小/数量。这些细胞的低频率，因此难以的免疫反应，如接种后或暴露于外来抗原或自身免疫的发展过程中发育过程研究在它们的状态的改变。先前，研究人员已经进行的使用的技术，从抗原包被的板或柱吸附剂，抗原包被的红细胞复位，对抗原反应性B细胞的分离荧光激活细胞分选1，2，3，4，5，6。 Thougħ这些技术已成功地鉴定和分离抗原反应性B细胞，结果在收率，纯度和可扩展性方面变化。最近我们开发了一种新的方法来检测二者并用的磁性纳米粒子丰富罕见的B淋巴细胞亚群。该方法能够富集具有相对高产量和纯度从大的起动种群，并与对抗原的反应分析兼容。通过从悬浮液中的细胞群富集，该方法消除了与抗原包被的板或列，并限制可以通过的几何结构相关的约束。最后，由于富集的细胞保持与抗原和荧光报道相关联的，它们可以被进一步通过FACS分选进行纯化。如本文所述，我们使用从与各种autoi受试者这种方法对于外周血破伤风类毒素反应性B前细胞的研究和人类受试者的免疫接种后，以及自身抗原反应的B细胞mmune疾病，包括1型糖尿病，格雷夫斯病，桥本氏病7。该方法同样适用于小鼠和人，并与从各种组织（手稿中制备）抗原反应性B细胞的分析相容。
在其基本形式，外周血单核细胞首先用抗体与细胞用于表型分析所需表面抗原的沿生物素化的抗原温育。此标记步骤之后是洗涤和固定，以及另外的链霉耦合到远红荧光染料用于检测生物素化的抗原结合的细胞（ 图1）。以前的研究已经确定了抗原特异性的B细胞以类似的方式，但使用抗原直接缀合到荧光染料8，9，10，11。虽然这是一个值得的做法，与链霉结合使用生物素标记抗原能够取得更大的信号放大（绑定和非绑定细胞从而更好的区分），特别是当抗原是小12，13，14。另外一个考虑是利用链霉代替抗生物素蛋白，因为链霉去糖基化，减少非特异性结合的。此外，我们用远红荧光染料作为荧光由于其光稳定性，量子产率（亮度），并且它的体积小（〜1.3 KD）。荧光蛋白，如藻红蛋白（〜250 KD）和别（〜105 KD）15不是最佳的，因为它们可能含有大量的抗原表位。单一表位组成，如远红荧光染料小的有机荧光染料的使用，减少了分离的细胞群的复杂性。
一旦细胞被生物素化一ntigen和远红色荧光染料的链霉亲和吸附，他们使用的是抗远红荧光染料缀合的磁性纳米粒子富集。单个纳米颗粒不被大多数流式细胞仪检测到的，因此，不必纯化之前通过FACS分选和下游测定16除去。抗原特异性B细胞的磁性选择丰富感兴趣的人口，消除了时间和排序使用流式细胞仪罕见的事件的成本。
下面，我们显示从破伤风类毒素特异性的B细胞的富集来自破伤风类毒素加强免疫后前七天受试者代表性结果。我们为了说明此方法的充实下列体内刺激急性抗原特异性B细胞的能力选择了这个特定的应用，例如，当用流式细胞仪结合，这种方法能够丰富和分化抗原特异性天真，内存，以及浆母B细胞和允许研究者跟随随时间在它们的频率的变化。此外，我们还包括另一种可能的下游分析， 例如 ELISPOT测定，这表明细胞保留分泌以下富集抗体的能力。该方法的另一个应用可能涉及富集细胞过继转移入宿主。我们以前曾表明细胞保持作为抗原呈递以下隔离和传输细胞抗原特异性T细胞的能力（数据未显示）。因此，有许多可能被耦合到所述的方法，其中一起通知抗原特异性免疫应答的理解可能下游测定。我们已经描述下面的方法，包括控制，以确定总收率，纯度，细胞特异性，和折叠式富集。
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Protocol
1.人PBMC的分离
- 收集使用肝素血液收集管30-50毫升的血液。
注：血液中所用的量取决于在感兴趣的抗原特异性B细胞的血液的特定的实验问题和频率。肝素化的血液可立即被处理或摇动轻轻在室温下过夜处理翌日。在处理的延迟对富集效率的影响非常小，并且与活力的最小损失有关。 - 混合全血1:1用无菌，室温镁和钙自由磷酸盐缓冲的盐水（PBS）。
- 在50毫升的无菌锥形管中，加入10毫升室温的密度梯度溶液中。存储在黑暗中打开的密度梯度瓶在4℃，但在使用前温热至室温。
- 如果可能的话设置移液枪的缓凝和/或很少，但一致的，触发压力施加缓慢30-35层毫升稀释血液的密度梯度的顶部，小心不要混用两种。
注：放置针对50毫升的边缘吸移管的前端锥形同时加入稀释的血液，将有助于确保一致的稳定流动。 - 离心机在20℃下与制动400×g离心30分钟，关闭。
- 取出上层，其中包含血浆和血小板，小心不要去打扰下面的单核细胞层。
- 使用无菌吸管，收集单核细胞层（血沉棕黄层）并放入一个单独的无菌50ml锥形管中。
- 向细胞悬浮液中添加PBS中至50ml体积。离心在20°C带制动400 XG 10分钟。
- 除去上清，悬浮沉淀的细胞在10ml PBS中。计数细胞并使用血球或自动细胞计数器测定生存力。
- 重悬的细胞以10 7个细胞/ ml，在冰上的地方，直到准备好用于进一步处理。
2.细胞染色
- 除去1-2×10 6个细胞的每个荧光补偿/需要的话，如果适用FMO控制。离心机在400×g离心10分钟，细胞的其余部分在4℃下与制动。
- 在3-6×10 7个细胞/ ml的无菌过滤，冷FACS缓冲液（PBS + 1％牛血清白蛋白（BSA）+ 0.01％叠氮化钠）重悬细胞（在1.5ml的离心管中移除）。确保FACS缓冲是冷的，并保持它在冰上整个染色过程。
- 优化分析时除以细胞群为四分之三（AD）。使用级分A，以丰富的兴趣，使用馏分B和C的抗原特异性B细胞，以确定富集/染色的特异性（参见2.5和2.6以下），并使用组分D以确定抗原特异性细胞的频率和数目在未浓缩的人口，使产量计算和折叠式富集。
- 补充人体的FcγR再堵代理分数AD冰以防止抗体的Fc受体的结合。
注：按照适当的条件下制造商的说明。 - 添加荧光标记的抗体细胞的利益表面抗原，以分数为AD在黑暗中冰30分钟，注意不要包括可以用交叉耦合磁性纳米粒子的抗远红外荧光染料抗体反应的荧光染料。
注意：这些包括抗体偶联物到近红外荧光染料Cy5标记，经Cy5.5和Cy7的。被添加任何活力污渍应与使用固定剂的兼容。如果不打算分析使用FACS的细胞，但确定抗体分泌频率，例如，通过ELISPOT，与抗体表面染色是不必要的。 - 为了测试该试验的特异性，用未标记抗原的足够量的孵育馏分B在冰上30分钟，以使得广大的受体具有亲和至少10 -6 M被封锁。
注意：通常情况下，一个好起始浓度是50-100倍过量的抗原的量在2.6认为是足够的下面（ 例如 50-100微米）。这应该阻止任何B细胞具有高亲和性的未标记的抗原结合到生物素化的抗原，这是在下面的步骤2.6中加入，从而使富集的细胞的特异性的确认。本步骤可以在与上面步骤2.4一起完成。 - 生物素化抗原的级分A，B和D孵育加在冰上30分钟。
注：生物素化抗原的浓度应滴定以确定需要确保足够的检测和来自非特异性旁观者细胞结合的细胞分离的最佳量。通常一个很好的起点浓度测试为1-5微米。
注：对于馏分A和D，这一步可以同时使用上述步骤完成2.4。对于馏分B，这一步应该在工序2.5（在betw清洗完成EEN步骤是多余的）。 - 省略从组分C的生物素化抗原，以便确定B细胞中的协议的其他试剂，例如链霉远红荧光染料和磁性珠粒任何结合。
- 在4℃在1ml每5×10 7个细胞的冷FACS缓冲液和离心洗细胞两次通过细胞悬浮液在400×g离心5分钟。
- 最后一次洗涤后，稀释浓缩细胞悬浮液中每5×10 7个电池1毫升2-％甲醛和让坐在黑暗冰上5分钟。
注：细胞在这一点上的固定确保了生物素化抗原保持结合到BCR的过程的剩余。对活细胞 - 对于下游分析，如在ELISPOTs或过继转移，省略固定步骤。 - 洗涤细胞用1毫升每5×10 7个细胞的冷FACS缓冲液和离心分离两次，在400×g离心在4℃下5分钟。悬浮在1毫升冷流式细胞仪每5×10缓冲7细胞。
- 加1-2微克链霉远红荧光染料/毫升，并在冰上孵育在黑暗中20分钟。滴定链霉为每个应用程序的数量。
- 在4℃下以每5×10 7个电池1毫升冷的FACS缓冲液，离心洗涤细胞两次，在400×g离心5分钟。组分D制剂在这一点完成，因为它不会使用磁珠进行富集。
注：此示例将被用于确定样品中的频率和抗原特异性B细胞的数量。这将被用于确定产量和折叠式富集富集实现。
3.基于磁性纳米颗粒富集
- 从样品交流重悬细胞于1ml每5×10 7个细胞，并通过冷分离缓冲液（PBS + 0.5％BSA + 2mM的EDTA）的通过40微米的过滤器，以消除可能堵塞列中的任何团块。
- 添加抗的Cy5 /抗远红光荧光染料的纳米颗粒。佛ř最佳结果，纳米颗粒的浓度应该滴定每次使用，但一个好的起点是每5×10 7个细胞/ ml加入50μl悬浮液。旋转在黑暗中在4℃下10分钟。
- 在4℃以400 xg离心用1ml冷的分离缓冲液洗两次，每次5分钟。悬浮细胞在1ml每5×10 7个细胞的冷分离缓冲液中。
4.磁富集使用LS或LD列
- 将三个LS或LD列在磁分离器的磁场，并添加3毫升分离缓冲液的润湿列（见产品说明，以确定哪些列的类型是最适合）。允许所有3毫升水穿过柱，收集后丢弃。
注意：虽然磁性纳米颗粒标记细胞的分离可以使用磁分离装置是市售的任何一种来完成，该实验室已与使用LS柱的最成功，在德产量，纯度和富集效率的有效值。 - 将标有3支15mL的锥形管“分数A /（B）/（C）阴性”，为负选定单元格，列下。添加磁性粒子标记的细胞，以它们各自的柱，并允许整个体积通过。
- 加上前3毫升冷的分离缓冲液中，并让此穿过柱并用2ml重复。收集负选定单元格，并预留冰上。
- 从磁场中删除列和放置在标记为“份A /（B）/（C）的正面”，为阳性选择细胞的15毫升锥形管的顶部。
- 用大约6毫升分离缓冲液的填充柱顶端，并立即通过该柱沉浸这个体积来收集已使用所提供的柱塞结合到磁场的细胞。
- 为了提高纯度，在正选择的细胞可以进一步使用第二清洁列充实，重复PROCE杜热。
- 在400 xg离心在4℃下旋转同时负，正选择的馏分为10分钟，并在所需的最终体积暂停。与下游的分析，如FACS，ELISPOT或过继转移继续。
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Representative Results
纯度，产量分析，并用流式细胞仪倍富集
种群如上述那样必然包含未结合的链霉远红荧光染料，但被截留在基质污染细胞富集。这些杂质可以从富集的群体通过FACS分拣除去。估算富集群体的纯度，对活细胞栅极上了基于和侧向散射和/或活/死染色和分析远红光荧光染料+细胞频率。这后一种门控内的比例是指示纯度。这些细胞的特异性和抗原亲和力的进一步分析需要单个细胞的FACS分选，随后通过克隆和表达的免疫球蛋白基因的测序和重组抗体的生产和分析。
产率是指分离的antige数正结合在馏分回收B细胞A相对于在起始种群（组分D）的数量。因为同样数量的细胞是在组分D作为馏分A，人们可以直接决定产量（抗原结合B细胞级分在级分D抗原结合的B细胞的÷＃的＃）。
折叠富集（E）是通过远红荧光染料+ B细胞中的“正”富集的馏分A相对于在分数D.该值表示在所取得的抗原特异性B细胞的比例增加的百分比反射纳米颗粒富集。该值可以使用下面的等式找到：
为了证明这种技术，我们显示了使用破伤风类毒素（TET-TOX）作为模型获得代表性的结果抗原检测和富集在谁已经在不同的时间点接种过破伤风患者外周血TET-Tox的反应性B细胞。 图1是本方法和抗原吸附剂的示意图。 图2a显示TET-Tox的反应性B细胞从一个人谁是最后的接种破伤风比十年前更多的频率。示出的是富集的（“正”），并耗尽（“负”）从馏分A和馏分D. TET-Tox的特异性B细胞。因此的基线频率种群，在本例中，我们能够通过围绕充实结合细胞7倍和在富集的级分达到4％的纯度。
图2b示出从谁已接种〜3年更早的受试者使用血液反应的特异性。当我们ADDIT之前加入未标记的破伤风类毒素的50倍过量的（50μM）至细胞生物素化抗原（馏分B）的离子，我们能够通过83％到方框的结合，这表明抗原的特异性结合。当我们省略从步骤（馏分C）生物素化的抗原，B细胞仍结合少量（〜0.2％）; B细胞的这个小部分大概反映在吸附剂结合某些非抗原，如链霉抗远红荧光染料，抗远红荧光染料的抗体或磁性珠粒。
为了证明使用的方法来分析升压后在抗原结合细胞表型免疫后的变化，我们表明在图3中的幼稚，存储器的Tet-TOX-特异性B细胞的频率，和在血液浆母群之前绘制和7天一个健康的受试者的预防接种。而总的Tet-TOX结合的B细胞中幼稚B细胞的百分比从84％下降到64％升压后，MEMOR的百分比总的Tet TOX-反应性细胞中y和浆母群分别从16％提高到36％和0％至40％。 图3b显示了从外周血7天升压后的健康受到代表ELISPOT数据。在TET-Tox的结合的B细胞的分离导致在破伤风类毒素的抗体分泌细胞的频率4倍富集。
图1：用于检测和破伤风类毒素（四环素的Tox）结合的B细胞的富集方法。 （ 一 ）协议TET-TOX-结合B细胞富集和分离。 （B）来识别和丰富的Tet-TOX结合B细胞吸附剂的图。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2：代表cytograms展示的四环素的Tox结合的B细胞从人外周血富集。 （ 一 ）丰富Cytograms并从部分A和组分D来自正常受试者接种最后> 10年以前总TET-Tox的反应性B细胞耗尽春节Tox的反应性B细胞。从接种〜3年以前，丰富了A（A组分）的主体，“正”的人群，预培养过剩50庵后的外周血单个核细胞（B）Cytograms未标记的TET-TOX（分数B），或富集与过程（馏分C）中省略TET-TOX-生物素。所有分析选通CD19 +淋巴细胞。百分比表示在最后的级分的所有B细胞（CD19 +）的四环素-TOX结合的细胞的百分比。ANK“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：抗原结合的细胞的富集后分析的实例。细胞表型之后TET-TOX-结合B细胞富集（ 一 ）代表流式细胞仪分析。 Cytograms描绘的Tet-TOX反应天真的鉴定和分析（CD27 - ），存储器（CD27 +），和在之前的受试者的B细胞亚群，并针对破伤风加强接种后7天plasmablasts（CD27 + CD38 +）。所有的细胞，门从丰富的“积极”的人群CD19 +淋巴细胞。 （B）分泌抗体的丰富，贫和总未富集B细胞的部分细胞博后7天外周血的健康受试者的代表ELISPOT分析OST。对于ELISPOT测定，在96孔平板的孔中首先用破伤风类毒素的10微克/毫升的溶液。细胞悬浮液的两倍系列稀释液在井在从富集，贫化和总非富氧馏份相等浓度作了（横跨板）开始细胞。用生物素化抗人IgG（H＆L），随后链霉-AP进行检测抗破伤风抗体分泌细胞。该板用ELISPOT发展缓冲器发达国家和反应通过三次O.测定在该线性范围内的细胞稀释斑点的数目双蒸H 2洗涤该板停止，并计算携带者的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了一种新方法来完成分离和从人外周血抗原结合的B细胞的富集。该方法是容易适用于小鼠和其它组织，如脾脏和淋巴结肿大，是与细胞表型和功能（手稿准备中）的富集后分析兼容。
用户应该认识到许多的可能影响该过程的成功变量。从经验死细胞倾向于粘到磁性珠粒和“占用”荧光染料，如链霉亲和远红荧光染料，导致非特异性背景增加。关键是要开始此过程之前，从样本中删除尽可能多的死细胞。污渍，使从分析门出来的死细胞活/死歧视的使用可能是有益的，但死细胞的存在可能会影响抗体检测的解释分泌细胞的频率和以下过继转移函数。
此外，我们已发现，加入生物素化的抗原的小心滴定是可区别的抗原特异性和非特异性结合是至关重要的。太少抗原的使用将导致抗原结合细胞的频率的低估，而过多的抗原可引起假阳性检测/富集。抗原浓度在过高可能的使用可以通过表观结合到样品中的非B细胞中注明。此外，过高的频率抗原（> 1％）的表观检测反应性细胞可以是具有结合特异性的问题的指示。确定抗原使用的最佳量时的最终目标是加入比存在于生理浓度，这样一点点抗原，多数B细胞受体与例如，对于<10 -6 M 的亲和抗原是饱和。这确保了抗原特异性的B细胞是B-使用具有致病潜力的亲和eing检测。太少抗原， 即在等于或低于生理浓度的加成，可能导致检测由于很少抗原特异性B细胞对降低BCRS的抗原占领。另一方面，除了过多抗原，远远超过生理浓度的，可导致增加的非特异性结合，其中将包括B细胞与抗原（> 10 -6 M）的亲和力低，并实际上昧抗原体内 。因此，它是至关重要的，首先滴定跨越几个日志的生物素化抗原，以确信被发现只有真正的抗原反应性B细胞。同样，我们已发现，使用过多链霉远红光荧光染料会增加背景。
同样重要的是要注意的抗原是生物素化可以影响抗原性表位的可用性。因此，使用不同的生物素化优化满足部门首长可能是重要的。备选地生物素可耦合到伯胺，叔胺，巯基，或羧基。延长间隔臂长的使用可以通过降低空间位阻提高表位的可用性。
一限制该技术的是其从冷冻的抗原结合的B细胞相比，新鲜细胞的富集降低有效性。这可能涉及到更大的细胞死亡和冷冻样品中相关的“粘性”。尽管如此，该方法可以适用于冷冻样品，但它不直接比较从新鲜和冷冻的细胞的富集和分析结果可能是很重要的。另一个限制是富集样品中的抗原特异性B细胞的纯度。从以往的经验，总有一些细胞“尾随”，其中既包括非特异性B细胞和T细胞。这是在试图丰富可以预期给出的细胞群体的罕见的。然而，T的纯度他细胞可以是通过确保，或通过FACS分选的抗原特异性B细胞的单个细胞悬浮液加入细胞以列，丰富上一个新的列的第二时间之前所获得的增加。根据研究的类型，研究者可以决定哪个选项是最好的，是否有必要。
正如我们优化该技术，我们设想，这将是适合于高亲和力与基于抗原滴定或染色强度低亲和力抗原反应性细胞的鉴别。然而，在先前的研究中，我们发现抗原反应的B细胞与最多在亲和力其抗原的1000倍的差异是用这种方法7同样丰富。因此，如果亲和的知识是相关的研究，需要使用表达的重组抗原受体的表面等离子共振分析富集细胞的亲和力的正式测量。
固有在该技术中是第l仿，加入生物素化的抗原和链霉能激活通过交联的BCR的细胞。这可能会给特定下游功能测定，例如那些寻求刺激的细胞进行比较，以静息控制的问题。这个问题可以通过保持控制样品冷，以防止信号转导来减轻。它也可能是BCR信号可能影响正在进行的生物反应。从经验抗原富集的细胞维持其分泌的抗体的能力，通过ELISPOT分析（ 图3b）和功能作为抗原呈递细胞向T细胞在体外和过继转移到小鼠后所指示（未示出数据）。该技术的最终限制是使用抗fluorochome抗体来完成纳米粒子结合到抗原吸附的细胞。与某些结构上相关的荧光，包括Cy7的和经Cy5.5抗远红光荧光染料交叉反应。这可以限制的选项Ø可用于表型标记测量˚F标记抗体。然而，增加的新的荧光染料的可用性，这是成为不再是一个问题。
使用这种检测和富集的方法，也能够容易地识别在体外外周血，脾脏，或其它组织的抗原结合的B细胞。这种方法是在研究抗原反应性细胞的免疫接种或接触外来抗原和自身免疫疾病的设置的免疫反应特别有用。虽然没有检测抗原反应性B细胞的方法已被证明是没有它的缺点，这种方法是快速，简便，并产生一个相对高的纯度，收率，和富集抗原反应性细胞，可以连接到各种各样的下游检测。此外，由于该方法的基本原理，这一程序可以很容易地适合于各种实验的需求。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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