Summary
En enkel, men effektiv metode som benytter magnetiske nanopartikler å oppdage og berike antigen-reaktive B-celler for funksjonell og fenotypeanalyser er beskrevet.
Introduction
Begrensende fortynning analyser av antistoff-utskillende celle forløper frekvens har foreslått at B-celler som er reaktive til et spesielt antigen vanligvis forekommer ved en frekvens på 0,05 til 0,005% i den normale repertoaret, avhengig av vaksinasjonsstatus og størrelse / antall epitoper som er tilstede på antigenet. Den lave frekvens av disse celler har gjort det vanskelig å studere forandringer i deres status i løpet av utviklingen av immunresponser, så som etter vaksinasjon eller eksponering for et fremmed antigen, eller i løpet av utviklingen av autoimmunitet. Tidligere forskere har foretatt isolering av antigen-reaktive B-celler ved anvendelse av teknikker som varierer fra antigen-belagte plater eller kolonne adsorbenter, til antigen-belagte røde blodlegemer tilbakestilling, til fluorescens-aktivert cellesortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though disse teknikkene har vært vellykket i å identifisere og isolere antigen-reaktive B-celler, har resultatene variert i form av utbytte, renhet og skalerbarhet. Nylig har vi utviklet en ny metode for å både oppdage og berike sjeldne B lymfocytsubpopulasjoner ved hjelp av magnetiske nanopartikler. Fremgangsmåten gjør det mulig anrikning med relativt høyt utbytte og renhet fra store utgangs populasjoner, og er kompatibel med analyse av responser til antigen. Ved å anrike fra populasjoner av celler i suspensjon, eliminerer fremgangsmåten begrensninger som er knyttet til geometrien av antigen-belagte plater eller kolonner, og begrense gjennomstrømningen. Til slutt, siden anrikede celler forbli assosiert med antigen og et fluorescerende reporter, kan de renses ytterligere ved FACS sortering. Som beskrevet her er det brukt denne tilnærmingen for studier av perifere blod tetanustoksoid-reaktive B-celler før og etter immunisering av mennesker, så vel som autoantigen-reaktive B-celler fra individer med forskjellige autoimmune lidelser, inkludert type 1 diabetes, Graves 'sykdom, og Hashimotos sykdom 7. Metoden fungerer like bra i mus og menneske, og er kompatibel med analyse av antigen-reaktive B-celler fra forskjellige vev (manuskript under forberedelse).
I sin grunnleggende format, perifert blod mononukleære celler først inkubert med biotinylert antigen sammen med antistoffer til celleoverflateantigener som kreves for fenotypisk analyse. Denne merking trinnet er etterfulgt av vasking og fiksering, og tilsetning av streptavidin koblet til langt-rød-fluorescerende fargestoff for deteksjon av de biotinylerte-antigenbindende-celler (figur 1). Tidligere studier har identifisert antigen-spesifikke B-celler på en lignende måte, men ved bruk av antigenene direkte konjugert til et fluorokrom 8, 9, 10, 11. Selv om dette er en verdigtilnærming, bruk av biotinylerte antigener i forbindelse med streptavidin muliggjør større signalforsterkning (og dermed bedre differensiering av bindende og ikke-bindende celler), særlig når antigenene er liten, 12, 13, 14. En ytterligere betraktning er bruken av streptavidin i stedet for avidin fordi streptavidin er deglykosylert, redusere ikke-spesifikk binding. Videre bruker vi langt-rød-fluorescerende fargestoff som fluorokrom på grunn av sin fotostabilitet, kvanteutbytte (lysstyrke), og dens lille størrelse (~ 1,3 kD). Protein fluorokromer slik som fykoerytrin (~ 250 kD) og allofykocyanin (~ 105 kD) 15 er ikke optimal fordi de potensielt inneholder flere antigene epitoper. Anvendelse av et lite organisk fluorescerende fargestoff som består av en enkel epitop, slik som langt-rød-fluorescerende fargestoff, reduserer kompleksiteten av den isolerte cellepopulasjon.
Når cellene er biotinylert-enntigen og vidt rød-fluorescerende fargestoff-streptavidin adsorbert, er de beriket bruker anti-langt-rød-fluorescerende fargestoff-konjugert magnetiske nanopartikler. Enkeltnanopartikler er ikke oppdaget av de fleste flowcytometere og derfor trenger ikke fjernes før rensing ved FACS sortering og nedstrøms analyser 16. Magnetisk utvalg for antigen-spesifikke B-celler beriker bestanden av interesse, eliminere tiden og kostnadene for sortering sjeldne hendelser ved hjelp av et flowcytometer.
Nedenfor viser vi representative resultater fra anriking av tetanus-toksoid-spesifikke B-celler fra et emne før og syv dager etter tetanustoksoid booster vaksinasjon. Vi valgte denne spesielle anvendelse som et eksempel for å demonstrere evnen som denne fremgangsmåten for å anrike antigen-spesifikke B-celler etter akutt in vivo stimulering. Når dette kombineres med strømningscytometri, er denne metoden i stand til å berikende og differensierende antigen-spesifikke naive, hukommelse, ogplasmablast B-celler og tillater forskeren å følge endringer i frekvens over tid. I tillegg, inkluderer vi en annen mulig nedstrøms assay, for eksempel en ELISPOT-analyse, som viser at celler som beholder evnen til å utskille antistoff etter anrikning. En annen anvendelse av denne fremgangsmåte kan omfatte adoptiv overføring av anriket celler i en vert. Vi har tidligere vist celler opprettholde evnen til å virke som antigenpresenterende celler til antigen-spesifikke T-celler etter isolering og overføring (data ikke vist). Derfor er det et antall mulige nedstrøms analyser som kan bli koplet til den metode som sammen informerer forståelsen av den antigen-spesifikke immunrespons. Vi har beskrevet metoden nedenfor, inkludert kontroller for å fastslå samlede utbyttet, renhet, celle spesifisitet, og fold-berikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av menneske PBMC
- Samle 30-50 ml blod ved bruk av heparinisert blod samling rør.
MERK: Mengden blod som brukes avhenger av bestemte eksperimentelle spørsmålet og frekvens i blodet av antigen-spesifikke B-celler av interesse. Heparinisert blod kan behandles umiddelbart eller rystet forsiktig over natten ved romtemperatur for å behandle den neste dag. Forsinkelsen i behandlingen har meget liten effekt på effektiviteten av anrikning og er forbundet med minimalt tap av levedyktighet. - Bland fullblod 1: 1 med steril romtemperatur magnesium og kalsium fri fosfat-bufret saltvann (PBS).
- I et 50 ml sterilt konisk rør, tilsett 10 ml romtemperatur densitetsgradient løsning. Lagre de åpnede densitetsgradient flasker i mørke ved 4 ° C, men varmes opp til romtemperatur før bruk.
- Hvis det er mulig sette pipette pistol til den langsomme innstilling og / eller bruke svært lite, men konsekvent, trigger press for å saktelag 30-35 ml av den fortynnede blod på toppen av tettshetsgradient den, være forsiktig med å blande de to.
MERK: Plassering spissen av pipetten mot kanten av 50-ml konisk mens du legger fortynnet blod vil bidra til å sikre en konsekvent jevn flyt. - Sentrifuger ved 400 xg i 30 min ved 20 ° C med bremsen slått av.
- Fjern det øverste laget, som inneholder plasma og blodplater, være forsiktig for ikke å forstyrre den mononukleære cellelaget under.
- Ved hjelp av en steril pipette, samle mononukleære cellelaget (buffy coat) og plasser i en separat steril 50 ml konisk tube.
- Legg PBS til cellesuspensjonen til et volum på 50 ml. Sentrifuger ved 400 xg i 10 min ved 20 ° C med brems.
- Fjern supernatant og resuspender pelleterte celler i 10 ml PBS. Telle celler og bestemme levedyktighet ved hjelp av en hemocytometer eller automatisert celleteller.
- Resuspender celler 10 7 celler / ml og legg på is inntil den er klar for videre behandling.
2. Farging av celler
- Fjern 1-2 x 10 6 celler for hver fluorescens kompensasjon / FMO kontroll er nødvendig, hvis det er aktuelt. Sentrifuge resten av cellene ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med brems.
- Resuspender celler i sterilfiltrert, kald FACS-buffer (PBS + 1% bovint serumalbumin (BSA) + 0,01% natriumazid) ved 3-6 x 10 7 celler / ml (fjern i et 1,5 ml sentrifugerør). Pass på at FACS buffer er kaldt og holde det på is i hele fargeprosedyre.
- Del celle populasjon i fjerde (AD) når du optimaliserer analysen. Bruk fraksjon A for å berike antigen-spesifikke B-celler av interesse, bruk fraksjoner B og C for å bestemme spesifisiteten av anrikning / farging (se 2.5 og 2.6 nedenfor), og bruk fraksjon D for å bestemme frekvensen og antallet antigen-spesifikke celler in den ikke-anrikede befolkningen for å muliggjøre beregning av avkastning og fold-berikelse.
- Legg menneskelig FcγR blokkerer reagent for å fraksjoner AD på is for å hindre binding av antistoffer mot Fc-reseptorer.
MERK: Følg produsentens anvisninger for egnede forhold. - Legg fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer mot celleoverflateantigener av interesse for fraksjoner AD i 30 min på isen i mørket, være forsiktig med å inkludere fluorokromer som kan kryssreagere med anti-langt-rød-fluorescerende fargestoff antistoffer koblet til magnetiske nanopartikler.
MERK: Disse inkluderer Antistoffkonjugatene til nær-IR fluorescerende fargestoff, Cy5, Cy5.5, og Cy7. Eventuelle levedyktighet flekker som tilsettes bør være kompatibel med bruk av et bindemiddel. Hvis man ikke har til hensikt å analysere celler ved hjelp av FACS, men bestemme antistoff-utskillende frekvens, for eksempel ved ELISPOT, er overflate farging med antistoffer unødvendig. - For å teste spesifisiteten av analysen, inkuber fraksjon B med tilstrekkelig mengde av umerket antigen i 30 minutter på is, slik at flertallet av reseptorer med en affinitet på minst10 -6 M er blokkert.
MERK: Vanligvis er et godt utgangspunkt konsentrasjon en 50-100 ganger overskudd av mengden av antigen anses tilstrekkelig i 2.6 nedenfor (f.eks 50-100 mm). Dette bør blokkere eventuelle B-celler med en høy affinitet for umerket antigen å binde til biotinylerte antigen, som tilsettes i trinn 2.6 nedenfor, og dermed gir bekreftelse av spesifisiteten av cellene anriket. Dette trinnet kan gjennomføres i forbindelse med trinn 2.4 ovenfor. - Legg biotinylert antigen til Fraksjonene A, B og D. Inkuber på is i 30 min.
MERK: Konsentrasjon av biotinylert antigen bør titreres for å bestemme den optimale mengden som trengs for å sikre tilstrekkelig påvisning og separering av å binde celler fra ikke-spesifikke tilskuer celler. Vanligvis et godt utgangspunkt konsentrasjon til testen er 1-5 mikrometer.
MERK: For fraksjoner A og D, dette trinnet kan gjøres samtidig med trinn 2.4 ovenfor. For Fraksjon B, bør dette trinnet gjøres etter trinn 2,5 (vask i between trinn er unødvendig). - Utelate biotinylert antigen fra Fraksjon C for å fastslå noen binding av B-celler til andre reagenser i protokollen, slik som streptavidin-langt-rød-fluorescerende fargestoff, og de magnetiske kuler.
- Vask cellene to ganger ved suspensjon av celler i 1 ml kald FACS-buffer per 5 x 10 7 celler og sentrifugering ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Etter den siste vask, fortynne konsentrert cellesuspensjon i 1 ml 2% formaldehyd per 5 x 10 7 celler og la det stå i mørke på is i 5 min.
MERK: Fiksering av cellene på dette punkt gjør at det biotinylerte antigen forblir bundet til den BCR for resten av prosedyren. For levedyktige celler - for nedstrøms analyse, for eksempel i ELISPOTs eller adoptiv overføringer, utelate fiksering trinn. - Vask cellene to ganger med 1 ml kald FACS-buffer per 5 x 10 7 celler og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender i 1 ml kald FACS-buffer per 5 x 107 celler.
- Legg 1-2 ug streptavidin-far-rød-fluorescerende fargestoff / ml og inkuberes på is i 20 min i mørket. Titrere mengden av streptavidin for hver enkelt applikasjon.
- Vask cellene to ganger med 1 ml kald FACS-buffer per 5 x 10 7 celler og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fraksjon D preparatet er fullført ved dette punkt som det ikke vil gjennomgå anrikning ved hjelp av magnetiske kuler.
MERK: Denne prøven blir brukt til å bestemme frekvens og antallet av antigen-spesifikke B-celler i prøven. Dette vil bli brukt til å bestemme utbyttet og fold-berikelse oppnås ved berikelse.
3. Magnetic Nanopartikkel-basert Enrichment
- Resuspender celler fra prøvene AC i 1 ml kald separasjonsbuffer (PBS + 0,5% BSA + 2mM EDTA) per 5 x 10 7 celler og passerer gjennom et 40 um filter for å fjerne eventuelle klumper som kunne tette kolonnen.
- Legg Anti-Cy5 / Anti-langt-rød-fluorescerende fargestoff nanopartikler. for optimale resultater, bør konsentrasjonen av nanopartikler titreres for hver bruk, men et godt utgangspunkt er 50 pl suspensjon per 5 x 10 7 celler / ml. Rotere i mørke ved 4 ° C i 10 min.
- Vask to ganger med 1 ml kald buffer separasjon ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender celler i 1 ml kald separasjonsbuffer pr 5 x 10 7 celler.
4. Magnetisk Enrichment Bruk LS eller LD kolonner
- Plasser tre LS LD eller søyler i det magnetiske felt av en magnetisk separator og tilsett 3 ml separasjon buffer for å fukte søylene (se produktbeskrivelsen for å bestemme hvilken type søyle er best egnet). Tillat alle 3 ml til å passere gjennom kolonnen og kast etter samlingen.
MERK: Selv om separasjon av magnetiske nanopartikkel merkede celler kan oppnås ved hjelp av et hvilket som helst av de magnetiske separasjonsinnretningene som er kommersielt tilgjengelige, har laboratoriet hatt mest suksess med anvendelse av LS kolonner, i terms av utbytte, renhet, og effektiviteten av berikelse. - Plasser tre 15 ml koniske rør som er merket "fraksjon A / (B) / (C) negative", for negativt utvalgte celler, under kolonnen. Tilsett magnetiske partikler merkede celler til deres respektive kolonne og tillate hele volumet til å passere gjennom.
- Tilsett 3 ml kald buffer separasjon på toppen, og la dette passere gjennom kolonnen og gjenta med 2 ml. Samle negativt valgte cellene og sett til side på is.
- Fjerne kolonnen fra det magnetiske feltet og plassere på toppen av en 15 ml konisk rør som er merket "fraksjon A / (B) / (C) positive", for positivt selekterte celler.
- Fylle kolonnen til toppen med ca. 6 ml buffer separasjon og umiddelbart styrter dette volumet gjennom kolonnen for å samle celler som var bundet til det magnetiske feltet ved hjelp av den medfølgende stempelet.
- For å øke renheten, kan de positivt utvalgte celler bli ytterligere beriket ved hjelp av en annen ren kolonne, gjenta procedure.
- Spinne både negativt og positivt selekterte fraksjoner ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C og suspendere i ønskede sluttvolum. Fortsett med nedstrøms analyse, slik som FACS, ELISPOT eller adoptiv overføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse av renhet, utbytte, og fold-berikelse ved hjelp av flowcytometri
Populasjoner anriket som beskrevet ovenfor, uunngåelig inneholde forurensende celler som ikke er bundet streptavidin-langt-rød-fluorescerende fargestoff, men er fanget i matriksen. Disse urenheter kan fjernes fra anrikede populasjoner ved hjelp av FACS-sortering. For å beregne renhet av anrikede populasjoner, gate på levende celler basert på fremover og sidespredning og / eller levende / død flekken og analysere langt-rød-fluorescerende fargestoff + celle frekvens. Prosentandelen innenfor dette sistnevnte port er indikativ for renhet. Videre analyse av spesifisiteten og affiniteten av antigenet i disse celler krever FACS sortering av enkeltceller, etterfulgt av kloning og sekvensering av uttrykte immunoglobulingener og rekombinant antistoff-produksjon og analyse.
Utbytte refererer til antall isolerte antigenen-bindende B-celler som gjenfinnes i fraksjon A i forhold til antall i utgangspopulasjonen (fraksjon D). Siden det samme antall celler var i fraksjon D som fraksjon A, kan man direkte bestemme utbyttet (# av antigen-bindende B-celler i fraksjon A ÷ # av antigen-bindende B-celler i fraksjon D).
Fold-anrikning (E) blir reflektert av prosentandelen av langt-rød-fluorescerende fargestoff + B-celler i "positivt" anriket fraksjon A i forhold til den i fraksjon D. Denne verdien angir den tilsvarende økning av antigen-spesifikke B-celler oppnådd av nanopartikkel berikelse. Verdien kan finnes ved hjelp av følgende ligning:
For å demonstrere denne teknikken, viser vi representative resultater oppnådd ved bruk av tetanus-toksoid (Tet-Tox) som modellantigen for å oppdage og berike for Tet-Tox-reaktive B-celler i perifert blod av pasienter som har blitt vaksinert mot stivkrampe på varierende tidspunkter. Figur 1 er en skjematisk fremstilling av fremgangsmåten og antigenet adsorbenten. Figur 2a viser hyppigheten av Tet-Tox-reaktive B-celler fra et individ som sist ble vaksinert mot stivkrampe mer enn et tiår siden. Vist er de anrikede ( "positive") og utarmet ( "negative") befolkninger fra fraksjon A og referansefrekvensen for Tet-Tox-spesifikke B-celler fra fraksjon D. Derav, i dette eksemplet er vi i stand til å berike bindende celler med ca. 7-fold og oppnådde en renhet på 4% i den anrikede fraksjonen.
Figur 2b viser spesifisiteten av reaksjonen ved hjelp av blod fra et individ som hadde blitt vaksinert ~ 3 år tidligere. Når vi lagt til en 50 gangers overskudd (50 mm) av umerket tetanus-toksoid til cellene før addition av biotinylert antigen (fraksjon B) vi er i stand til å blokkere binding med 83%, noe som viser spesifisitet av antigen bindende. Når vi utelatt biotinylert antigen av prosedyren (fraksjon C), et lite antall (~ 0.2%) av B-celler fremdeles bundet; Dette liten brøkdel av B-celler formodentlig skyldes binding til noen ikke-antigen i adsorpsjonsmiddel, slik som streptavidin-far-rød-fluorescerende fargestoff, anti-far-rød-fluorescerende fargestoff-antistoff eller magnetiske kuler.
For å demonstrere bruk av metoden for å analysere endringer i antigen-binding cellefenotyp etter vaksinasjon vi viser i figur 3 hyppigheten av Tet-Tox-spesifikke B-celler i en naiv, minne og plasmablast befolkninger i blod trukket før og 7 dager etter booster vaksinering av et sunt emne. Selv om prosentandelen av naive B-celler blant de totale Tet-Tox-bindende B-celler ble redusert fra 84% til 64% etter boost, prosentandelen av memory og plasmablast populasjoner blant de totale Tet Tox-reaktive celler økte fra 16% til 36% og 0% til 40%, respektivt. Figur 3b viser representative ELISPOT data fra perifert blod fra de 7 dager etter boost sunn fag. Isolering av de Tet-Tox-bindende B-celler førte til 4-gangers anrikning av tetanustoksoid antistoffutskillende celler frekvens.
Figur 1: Metode for påvisning og anriking av tetanustoksoid (Tet Tox) -binding B-celler. (A) Protokoll for anrikning og isolering av Tet-Tox-bindende B-celler. (B) Diagram av adsorbent ansatt for å identifisere og berike Tet-Tox-bindende B-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
n-page = "1"> 
Figur 2: Representative cytogrammene demonstrerer anrikning av Tet Tox-bindende B-celler fra humant perifert blod. (A) cytogrammene av anriket og utarmet Tet Tox-reaktive B-celler fra Fraksjon A og total Tet-Tox-reaktive B-celler fra Brøk D fra en normal gjenstand siste vaksinert> 10 år tidligere. (B) cytogrammene av PBMC fra de "positive" befolkninger fra et emne vaksinert ~ 3 år tidligere og anriket som i A (fraksjon A), etter pre-inkubering med overskudd av 50 pM umerket Tet-tox (fraksjon B), eller anriket med Tet-Tox-biotin utelatt i løpet av prosedyren (fraksjon C). Alle analyser ble separert på CD19 + lymfocytter. Prosentandeler representerer prosent av Tet-Tox-bindende celler av alle B-celler (CD19 +) i sluttfraksjonen.ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel på etteranrikning analyse av antigen-bindende celler. (A) Representative strømningscytometrisk analyse av celle-fenotype etter anrikning av Tet-Tox-bindende B-celler. Cytogrammene skildre identifisering og analyse av Tet-Tox-reaktivt naive (CD27 -), minne (CD27 +), og plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++) i B-celle subpopulasjoner av et emne før og 7 dager etter booster vaksinasjon mot stivkrampe. Alle celler ble separert på CD19 + lymfocytter fra de anrikede "positive" populasjoner. (B) Representant ELISPOT analyse av antistoff utskillende celler i beriket, utarmet, og totalt ikke-anrikede B cellefraksjoner fra perifert blod av en sunn emne 7 dager etter boost. For ELISPOT-analysen, ble brønner i en 96-brønners plate først belagt med en 10 mikrogram / ml oppløsning av tetanus-toksoid. To-gangers serielle fortynninger av cellesuspensjoner ble foretatt i brønner (på tvers av platen) ved å starte med celler ved lik konsentrasjon fra den anrikede, utarmet, og de totale ikke-anrikede fraksjoner. Anti-tetanus-antistoffsekreterende celler ble detektert med biotinylert anti-humant IgG (H & L), etterfulgt av streptavidin-AP. Platen ble utviklet med ELISPOT utvikling buffer og reaksjonen ble stanset ved å vaske platen tre ganger med dobbeltdestillert H2O Antall flekker på en celle fortynning i det lineære området ble bestemt, og antallet ASC ble beregnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en ny fremgangsmåte for å oppnå isolering og anrikning av antigen-bindende B-celler fra humant perifert blod. Fremgangsmåten er lett anvendelig for mus og andre vev, slik som milt og lymfeknuter, og er kompatibel med etteranrikning analyse av celle-fenotype og funksjon (manuskript under forberedelse).
Brukeren bør være bevisst på en rekke variabler som kan påvirke suksessen av denne prosedyren. Av erfaring døde celler har en tendens til å holde seg til de magnetiske kuler og "ta opp" fluorescerende fargestoffer, slik som streptavidin-far-rød-fluorescerende fargestoff, som fører til økt ikke-spesifikk bakgrunn. Det er viktig å fjerne så mange døde celler fra prøvene som mulig før starter denne fremgangsmåten. Bruk av flekker som gjør levende / død diskriminering for å separere ut døde celler fra analysen kan være nyttig, men tilstedeværelsen av døde celler kan kompromittere tolkning av analyser av antistoff utskillende celle frekvens ogfunksjon etter adoptiv overføring.
I tillegg har vi funnet at forsiktig titrering av biotinylert antigen tilsettes, er avgjørende for å skille antigen-spesifikk og ikke-spesifikk binding. Anvendelse av for lite antigenet vil føre til undervurdering av frekvensen av antigen-bindende celler, mens for mye antigenet kan føre til falsk positiv påvisning / berikelse. Bruken av antigen-konsentrasjoner som er for høyt, kan kan angis med tydelig binding til ikke-B-celler i prøvene. Videre åpen påvisning av en for høy frekvens (> 1%) av antigen-reaktive celler kan være en indikasjon på bindingsspesifisitet problemet. Det endelige målet ved bestemmelse av den optimale mengden av antigen til bruk, er å legge en litt mer antigen enn det som er til stede ved fysiologiske konsentrasjoner, slik at mesteparten av B-celle reseptorer med en affinitet på <10 6 M, for eksempel, for antigenet er mettet. Dette sikrer at antigen-spesifikke B-celler er being oppdaget med en affinitet som har sykdomsfremkallende potensial. Tilsetning av for lite antigenet, dvs. ved eller under fysiologiske konsentrasjoner, kan føre til oppdagelse av meget få antigen-spesifikke B-celler på grunn av redusert antigen okkupasjon av BCRs. På den annen side vil tilsetning av for mye antigen, som langt overskrider fysiologiske konsentrasjoner, kan føre til økt ikke-spesifikk binding, som inneholder B-celler med en lav affinitet for antigenet (> 10 -6 M), og er faktisk uvitende av antigenet in vivo. Derfor er det viktig først å titrere den biotinylerte antigen over noen stokker for å være sikker på at bare sanne antigen-reaktive B-celler blir detektert. Tilsvarende har vi funnet ut at bruk av for mye streptavidin-far-rød-fluorescerende fargestoff kan øke bakgrunn.
Det er også viktig å merke seg at biotinylering av antigen kan påvirke tilgjengeligheten av antigene epitoper. Derfor optimalisering ved hjelp av ulike biotinylering oppfylthods kan være viktig. Alternativt biotin kan kobles til primære aminer, tertiære aminer, sulfhydryler eller karboksylgrupper. Bruk av utvidet avstands armlengder kan forbedre epitop tilgjengelighet ved å redusere sterisk hindring.
En av begrensningene i denne teknikken er den reduserte effektivitet for anrikning av antigen-bindende B-celler fra kryopreservert sammenlignet med friske celler. Dette kunne forholde seg til større celledød og tilhørende "klissete" i frosne prøver. Ikke desto mindre kan fremgangsmåten anvendes på frosne eksempler, men det er sannsynligvis viktig ikke å direkte sammenligne resultatene fra anrikning og analysering av ferske og frosne celler. En annen begrensning er renheten av antigen-spesifikke B-celler i den anrikede prøven. Erfaringsmessig er det alltid noen celler som "tag along", som omfatter både ikke-spesifikke B-celler og T-celler. Dette er å forvente gitt sjeldenhet av cellen befolkningen på prøver å berike. Imidlertid er renheten av than celler kan øke ved at en enkelt cellesuspensjon blir oppnådd før tilsetning av cellene til kolonnen, å anrike en andre gang på en ny kolonne, eller ved FACS sortering av antigen-spesifikke B-celler. Avhengig av type studie, er forskeren kan bestemme hvilket alternativ som best, og om det er nødvendig.
Som vi optimalisert denne teknikk vi seg at det ville være mottagelig for diskriminering av høy affinitet i forhold til lav affinitet antigen-reaktive celler basert på antigenet titrering eller fargeintensitet. Men i en tidligere studie viste vi antigen-reaktive B-celler med opp til 1000 ganger forskjell i affinitet til sitt antigen ble like beriket med denne metoden 7. Derfor er formell måling av affiniteten av anrikede celler ved hjelp av overflate-plasmonresonans analyse av uttrykte rekombinante antigen-reseptorer nødvendig hvis kjennskap til affinitet er relevant for studien.
Iboende i denne teknikken er letterligning at tilsetning av biotinylert antigen og streptavidin kan aktivere cellene ved tverrbinding av BCR. Dette kan utgjøre et problem for bestemte nedstrøms funksjonelle analyser, slik som de som søker å sammenligne stimulerte celler til en hvilende kontroll. Dette problemet kan reduseres ved å holde kontrollprøver kalde for å forhindre transduksjon av signaler. Det er også mulig at BCR-signaler kan påvirke en pågående biologisk respons. Av erfaring antigen-anrikede celler som opprettholder deres evne til å utskille antistoff, som angitt av ELISPOT-analyse (figur 3b), og virker som antigen-presenterende celler til T-celler in vitro og etter adoptiv overføring i mus (data ikke vist). En endelig begrensning til denne teknikk er bruken av anti-fluorochome antistoffer for å oppnå nanopartikkel-binding til antigen adsorbert celler. Anti langt-rød-fluorescerende fargestoff kryssreagerer med visse strukturelt beslektede fluorokromer, inkludert Cy7 og Cy5.5. Dette kan begrense valg of antistoff-konjugater som er tilgjengelige for måling av fenotypiske markører. Men med økt tilgjengelighet av nye fluorokromer, dette blir mindre av et problem.
Ved hjelp av denne gjenkjennings- og berikelse metoden, er det mulig å enkelt identifisere antigenbindende B-celler i ex vivo perifert blod, milt, eller andre vev. Denne fremgangsmåte er spesielt nyttig i å studere immunresponsen av antigen-reaktive celler etter immunisering eller eksponering for fremmede antigener og i innstillingen av autoimmune sykdommer. Selv om ingen metode for å påvise antigen-reaktive B-celler har vist seg å være uten sine feil, er denne metoden rask, enkel, og frembringer en forholdsvis høy renhet, utbytte og anriking av antigen-reaktive celler som kan kobles til en rekke av nedstrøms analyser. I tillegg, på grunn av de grunnleggende prinsippene i fremgangsmåten, denne fremgangsmåten kan lett tilpasses til en rekke eksperimentelle behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
