Summary
Простой, но эффективный метод, который использует магнитные наночастицы для обнаружения и обогащения антиген-реактивных В-клеток для функционального и фенотипического анализа описан.
Introduction
Лимитирующего разведения анализ частоты предшественника клеток секретирующих антитела показали, что В-клетки, реакционноспособные в отношении конкретного антигена, обычно возникают на частоте от 0,05 до 0,005% в обычном репертуаром, в зависимости от статуса вакцинации и размер / количество эпитопов, присутствующих на антиген. Низкая частота этих клеток затрудняет для изучения изменений в их статусе в процессе развития иммунных реакций, таких как после вакцинации или воздействие чужеродного антигена, или во время развития аутоиммунитета. Ранее исследователи провели изоляцию антиген-реактивных В - клеток с использованием методик , начиная с антигенным покрытием пластин или адсорбенты колонки, к покрытым антигеном клеток сбросу красной крови, флуоресценцией сортировка клеток 1, 2, 3, 4, 5, 6. Thougч эти методы были успешными в деле выявления и выделения антиген-реактивных В-клеток, результаты варьировались с точки зрения доходности, чистоты и масштабируемости. Недавно мы разработали новый метод, как обнаружить и обогащать редкие B субпопуляций лимфоцитов с использованием магнитных наночастиц. Метод позволяет обогащение с относительно высоким выходом и чистотой из крупных исходных популяций, и совместим с анализом ответов на антиген. Обогатив из популяций клеток в суспензии, метод устраняет ограничения, связанные с геометрией пластинок, покрытых антигеном или столбцов, а также ограничить пропускную способность. И наконец, так как обогащенные клетки остаются связанными с антигеном и флуоресцентным репортером, они могут быть дополнительно очищен с помощью FACS-сортировкой. Как описано в настоящем документе, мы использовали этот подход для исследования периферической крови столбнячный анатоксин-реактивным В-клеток до и после иммунизации человеческих субъектов, а также аутоантигенов-реактивный В-клетки пациентов с различными autoimmune расстройства, в том числе сахарный диабет 1 типа, базедова болезнь, и болезнь Хашимото 7. Метод одинаково хорошо работает в мыши и человека, а также совместим с анализом антиген-реактивных В-клеток из различных тканей (рукопись в процессе подготовки).
В своем базовом формате одноядерные клетки периферической крови инкубируют с биотинилированным антигеном вместе с антителами к антигенам клеточной поверхности, необходимые для фенотипического анализа. Этот этап маркировки с последующей промывкой и фиксации, а также добавлением стрептавидина , соединенный с дальним красным-флуоресцентный краситель для обнаружения биотинилированного-связывания антигена клеток (рисунок 1). Предыдущие исследования выявили антиген-специфических В - клеток аналогичным образом , но при использовании антигенов , непосредственно конъюгированное с флюорохромом 8, 9, 10, 11. Несмотря на то, что это достойноподход, использование биотинилированных антигенов в сочетании с стрептавидином дает большее усиление сигнала (следовательно , более четко разграничить связывания и необязательных клеток), в частности , когда антигены малы 12, 13, 14. Дополнительным фактором является использование стрептавидина вместо авидин, так как стрептавидин дегликозилирован, уменьшая неспецифическое связывание. Кроме того, мы используем далеко-красно-флуоресцентный краситель в качестве флуорохрома из-за его светостойкости, квантовый выход (яркость) и его небольшой размер (~ 1,3 кД). Белковые флуорохромы , такие как фикоэритрин (~ 250 кДа) и аллофикоцианин (~ 105 кДа) 15 не являются оптимальными , поскольку они потенциально содержат много антигенные эпитопы. Использование небольшого органического флуоресцентного красителя, состоящего из одного эпитопа, например, дальнего красного флуоресцентного красителя, уменьшает сложность населения изолированной клетки.
После того, как клетки биотинилированного-аntigen и далеко-красно-флуоресцентный краситель адсорбированная-стрептавидин, они обогащены с использованием анти-далеко-красно-флуоресцентный краситель-конъюгированные магнитные наночастицы. Одиночные наночастицы не обнаруживаются большинством цитометров и , следовательно , не должны быть удалены до очистки с помощью FACS сортировки и последующих анализов 16. Магнитный отбор антиген-специфичных В-клеток обогащает население интерес, устраняя затраты времени и средств сортировки редких событий с использованием проточного цитометра.
Ниже мы покажем, репрезентативные результаты от обогащения столбняк-анатоксина специфических В-клеток от субъекта до и через семь дней после столбняка повторной иммунизации. Мы выбрали это конкретное применение в качестве примера для того , чтобы продемонстрировать способность этого метода обогащать антиген-специфические В - клетки после острой стимуляции в естественных условиях. В сочетании с проточной цитометрии, этот метод способен обогащать и дифференцирующей антиген-специфической наивным, памяти, иplasmablast В-клетки и позволяет исследователю следить за изменениями в их частоте с течением времени. Кроме того, мы включаем другой возможный вниз по течению анализа, например, анализа ELISPOT, который демонстрирует , что клетки сохраняют способность секретировать антитела следующего обогащения. Другое применение этого метода может включать в себя адоптивную передачу обогащенных клеток в организм хозяина. Ранее мы показали, клетки сохраняют способность действовать в качестве антиген-представляющих клеток на антиген-специфических Т-клеток после выделения и передачи информации (данные не показаны). Следовательно, существует целый ряд возможных последующих анализов, которые могут быть связаны с методом, который вместе информирующее понимание антиген-специфического иммунного ответа. Мы описали метод ниже, включая элементы управления, чтобы определить общий выход, чистота, клеточную специфичность и откидные обогащения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение человека МНПК
- Собрать 30-50 мл крови с использованием гепаринизированной трубки забора крови.
Примечание: Количество крови используется, зависит от конкретного экспериментального вопроса и частоты в крови антиген-специфических В-клеток, представляющих интерес. Гепаринизированной крови может быть обработан немедленно или качали осторожно в течение ночи при комнатной температуре в течение обработки на следующий день. Задержка в обработке очень мало влияет на эффективность обогащения и связана с минимальной потерей жизнеспособности. - Смешайте цельной крови 1: 1 со стерильным, при комнатной температуре магния и кальция свободной фосфатно-солевом буфере (PBS).
- В 50 мл стерильной коническую пробирку, добавляют 10 мл при комнатной температуре раствора в градиенте плотности. Хранить открываемые градиент плотности бутылки в темноте при температуре 4 ° С, но нагреться до комнатной температуры перед использованием.
- Если возможно установить пипеток пистолет к медленной установке и / или применять очень мало, но последовательное, триггер давление медленнослой 30-35 мл разведенной крови на верхней части градиента плотности, стараясь не смешивать два.
Примечание: Размещение наконечника пипетки против края 50 мл коническую при добавлении разведенной крови поможет обеспечить постоянный стабильный поток. - Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при температуре 20 ° С с тормозом выключен.
- Снимите верхний слой, который содержит плазму и тромбоциты, стараясь не нарушить слой мононуклеарных клеток ниже.
- С помощью стерильной пипетки, собирают слой мононуклеарных клеток (охристые пальто) и поместить в отдельную стерильную 50 мл коническую трубку.
- Добавить PBS к клеточной суспензии до объема 50 мл. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при температуре 20 ° С с тормозом.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осажденные клетки в 10 мл PBS. Граф клеток и определения жизнеспособности с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
- Ресуспендируют клетки в 10 7 клеток / мл и место на льду до готовности для дальнейшей обработки.
2. Окрашивание клеток
- Удалить 1-2 х 10 6 клеток для каждой компенсации флуоресценции / управления FMO необходимо, если это применимо. Центрифуга остаток клеток при 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
- Ресуспендируют клеток в стерильном отфильтрованном, холодного буфера FACS (PBS + 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 0,01% азида натрия) при 3-6 х 10 7 клеток / мл (удалить в 1,5 мл центрифужную пробирку). Убедитесь в том, что буфер FACS холодно и держать его на льду в течение всей процедуры окрашивания.
- Разделите популяцию клеток в четвертями (AD) при оптимизации анализа. Используйте фракцию А для обогащения антиген-специфических В-клеток, представляющих интерес, используют части В и С для определения специфичности обогащения / окрашивания (см 2.5 и 2.6 ниже), а также использовать фракцию D, чтобы определить частоту и количество антиген-специфических клеток в необогащенной населения для того, чтобы рассчитать доходность и откидные обогащения.
- Добавить человека FcγR блокировки повторноагент фракции AD на льду для предотвращения связывания антител с рецепторами Fc.
Примечание: Следуйте инструкциям производителя для соответствующих условий. - Добавить Флуорохром-конъюгированные антитела к клеточной поверхности антигены, представляющие интерес для фракций АД в течение 30 минут на льду в темноте, стараясь не включать флуорохромии, которые могут перекрестно реагировать с анти-далеко-красно-флуоресцентных антител красителя в сочетании с магнитными наночастицами.
Примечание: К ним относятся конъюгатов антитело к ближней ИК флуоресцентного красителя, Cy5, Cy5.5 и Cy7. Любые жизнеспособность пятна, которые добавлены должны быть совместимы с использованием закрепителя. Если не намерен анализировать клетки с использованием FACS, но определить частоту секретирующих антитела, например, с помощью ELISPOT, поверхность окрашивание антителами ненужно. - Чтобы проверить специфичность анализа, инкубировать фракция В с достаточным количеством немеченого антигена в течение 30 мин на льду, таким образом, что большинство рецепторов с аффинностью, по крайней мере,10 -6 М блокируются.
Примечание: Как правило, хорошая начальная концентрация является 50-100 - кратный избыток количества антигена считается достаточной 2.6 ниже (например , 50-100 мкМ). Это должно блокировать любые В-клетки с высоким сродством к непомеченная антигена для связывания с биотинилированным антигеном, который добавляют на стадии 2.6 ниже, что позволяет подтвердить специфичность клеток, обогащенных. Этот шаг может быть завершена в сочетании с шагом 2.4 выше. - Добавить биотинилированный антиген фракциях А, В и D. инкубировать на льду в течение 30 мин.
Примечание: Концентрация биотинилированного антигена следует титровать, чтобы определить оптимальное количество, необходимое для обеспечения адекватного обнаружения и разделения связывания клеток с неспецифическими байстэндер клеток. Как правило, хорошая отправная концентрация для теста составляет 1-5 мкМ.
Примечание: Для получения фракций А и D, этот шаг может быть сделано одновременно с шагом 2.4 выше. Для фракции B, этот шаг должен быть сделан после шага 2.5 (мытья в betwееп шаги не требуется). - Опустить биотинилированный антиген из фракции С, чтобы определить любое связывание В-клеток в других реагентов в протоколе, например, стрептавидином дальнего красного флуоресцентного красителя и магнитных шариков.
- Промыть клетки дважды суспензии клеток в 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 10 7 клеток и центрифугировали при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
- После окончательной промывки разбавленной концентрированной суспензии клеток в 1 мл 2% -ного формальдегида на 5 х 10 7 клеток , и пусть сидят в темноте на льду в течение 5 мин.
Примечание: фиксирование клеток в этой точке, что обеспечивает биотинилированный антиген остается связанным с BCR для оставшихся процедуры. Для получения жизнеспособных клеток - для нисходящего анализа, например, в ELISPOTs или приемными передачи, пропустить шаг фиксации. - Промыть клетки дважды 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 10 7 клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют в 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 107 клеток.
- Добавить 1-2 мкг стрептавидин-далеко-красно-флуоресцентный краситель / мл и инкубируют на льду в течение 20 мин в темноте. Титрование количества стрептавидина для каждого приложения.
- Промыть клетки дважды 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 10 7 клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. Подготовка фракции D завершается в данный момент, поскольку он не будет проходить обогащение с использованием магнитных шариков.
Примечание: Этот образец будет использоваться для определения частоты и количества антиген-специфических В-клеток в образце. Это будет использоваться для определения выхода и сложите обогащением достигается за счет обогащения.
3. Магнитный Наночастицы на основе Обогащение
- Ресуспендируют клеток образцов AC в 1 мл холодного буфера разделения (PBS + 0,5% БСА + 2 мМ ЭДТА) на 5 х 10 7 клеток и проходят через фильтр 40 мкм , чтобы устранить любые комки , которые могут засорить колонну.
- Добавить Anti-далеко-красно-флуоресцентные наночастицы красителя Anti-Cy5 /. Foг оптимальных результатов, концентрация наночастиц должна подбираться для каждого использования, но является хорошей отправной точкой является 50 мкл суспензии на 5 × 10 7 клеток / мл. Поворот в темноте при 4 ° С в течение 10 мин.
- Промыть два раза с помощью 1 мл буфера холодного разделения при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 1 мл холодного буфера разделения на 5 х 10 7 клеток.
4. Магнитная Обогащение с помощью LS или LD столбцов
- Поместите три LS или LD столбцов в магнитном поле магнитного сепаратора и добавляют 3 мл буфера для разделения смачивать столбцы (см описание товара, чтобы определить, какой тип колонки лучше всего подходит). Разрешить все 3 мл пройти через колонку и выбросить после сбора.
Примечание: Несмотря на то, разделение магнитных наночастиц меченых клеток может быть осуществлено с использованием любого одного из магнитных устройств разделения, которые являются коммерчески доступными, лаборатория была наиболее успешной с использованием колонок LS, в ТЕСКО доходности, чистоты и эффективности обогащения. - Поместите три 15 мл конические пробирки меченые "Фракция А / (В) / (С) негативный", для отрицательно выбранных ячеек в столбце. Добавьте магнитная частица меченых клеток к их соответствующей колонке и позволяют весь объем, чтобы пройти.
- Добавьте 3 мл буфера холодного разделения на вершине, и это позволит пройти через колонку и повторить с 2 мл. Сбор отрицательно отобранных клеток и отложите на льду.
- Удалить столбец из магнитного поля и место на вершине 15 мл коническую пробирку с надписью "Фракцию А / (В) / (С) положительные", для положительно отобранных клеток.
- Заполните колонки в верхнюю приблизительно 6 мл буфера для разделения и немедленно погрузить этот объем через колонку, чтобы собрать клетки, которые, связанные с магнитным полем с помощью прилагаемого плунжера.
- Для повышения чистоты, позитивно отобранной клетки могут быть дополнительно обогащен с использованием второй чистый столбец, повторяя процеДюре.
- Спин оба отрицательно и положительно отобранных фракций при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С и подвесить в желаемом конечном объеме. Продолжайте вниз по течению анализа, такие как FACS, ELISPOT или приемному передачи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ чистоты, выход, и сложите обогащения с помощью проточной цитометрии
Популяции, обогащенные, как описано выше, неизбежно содержат загрязняющие клетки, которые не связаны стрептавидином далеко красно-флуоресцентный краситель, но попавшие в матрице. Эти примеси могут быть удалены из обогащенных населения путем FACS-сортировкой. Для оценки чистоты обогащенных популяций, ворота на живых клетках на основе прямого и бокового рассеяния и / или живой / мертвый пятно и анализировать частоту далеко-красный флуоресцентный краситель + клеток. Процент в пределах этой последней ворот свидетельствует о чистоте. Дальнейший анализ специфичности и аффинности антигена этих клеток требует FACS сортировки отдельных клеток, а затем клонирования и секвенирования экспрессируемых генов иммуноглобулина и производства рекомбинантного антитела и анализа.
Выход относится к числу изолированных antigeн-связывающий В-клетки взысканные в Фракция А по отношению к числу в начальной популяции (фракция D). Так как такое же количество клеток, были во фракции D в качестве фракции А, можно непосредственно определить выход (# антигенсвязывающих В-клеток во фракции А ÷ # антигенсвязывающих В-клеток во фракции D).
Откидные обогащение (Е) отражается процент далеко-красно-флуоресцентный краситель + В-клеток в "положительно" обогащенную фракцию А относительно, что во фракции D. Это значение указывает на пропорциональное увеличение антиген-специфических В-клеток, достигнутых обогащение наночастицами. Значение может быть найдено с помощью следующего уравнения:
Чтобы продемонстрировать эту технику, мы показываем репрезентативные результаты, полученные с использованием столбняк-анатоксина (Tet-Tox) в качестве моделиАнтиген для выявления и обогащения для Tet-Tox-реактивных В-клеток в периферической крови субъектов, которые были привиты от столбняка при различных временных точках. На рисунке 1 представлена схема способа и антигенной адсорбента. На рисунке 2а показана частота Tet-Tox-реактивных В - клеток от человека , который был последним вакцинированы против столбняка больше , чем десять лет назад. Показаны обогащенный ( "позитивный") и истощены ( "негативный") популяции из фракции A и базовой частотой Tet-Tox-специфических В-клеток из фракции D. Таким образом, в этом примере мы можем обогатить связывающие клетки, вокруг 7-кратный и достиг чистоты 4% в обогащенную фракцию.
На фиг.2b показана специфичность реакции с использованием крови из субъекта , который был вакцинирован ~ 3 года назад. Когда мы добавили 50-кратный избыток (50 мкМ) немеченого столбнячный анатоксин-клеткам, прежде чем Additиона биотинилированного антигена (фракция В), мы способны блокировать связывание на 83%, что свидетельствует о специфичности связывания антигена. Когда мы опустили биотинилированный антиген из процедуры (фракция С), небольшое количество (~ 0,2%) В-клеток по-прежнему связаны; эта малая часть В-клеток, по-видимому, отражает связывание с какой-то не-антигена в адсорбенту, такие как стрептавидин-далеко-красно-флуоресцентный краситель, антитело анти-дальнего красного флуоресцентного красителя или магнитных шариков.
Чтобы продемонстрировать применение метода для анализа изменений в антигенсвязывающей клеточный фенотип после иммунизации мы показали на рисунке 3 частота Tet-Tox-специфических В - клеток в наивном, памяти и plasmablast популяции в крови отбирались до и через 7 дней после бустер вакцинация здорового субъекта. В то время как процент наивных В-клеток, среди общего количества Tet-Токс-связывающих В-клеток, уменьшилась с 84% до 64% после того, как импульс, процент MemorY и plasmablast популяции среди общего числа Tet Tox-реактивных клеток увеличилось с 16% до 36% и от 0% до 40%, соответственно. Рисунок 3b показывает репрезентативные данные ELISPOT из периферической крови от 7 дней после форсирование здорового субъекта. Выделение Tet-Tox-связывающих В-клеток привело к 4-кратное обогащение частоты секретирующих клеток столбняка антител.
Рисунок 1: Метод обнаружения и обогащения столбнячного анатоксина (Tet Tox) -связывающим В - клеток. (A) Протокол для обогащения и выделения Tet-Tox-связывающих В - клеток. (B) Схема адсорбента , используемого для идентификации и обогащения Tet-Tox-связывающих В - клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
п-страница = "1"> 
Рисунок 2: Представитель цитограммах , демонстрирующие обогащение Tet Tox-связывающий В - клетки из периферической крови человека. (A) цитограммах обогащенного и обедненного Tet Tox-реактивных В - клетки из фракции А и общего Tet-Tox-реактивных В - клеток из фракции D от нормального субъекта последние вакцинированные> 10 лет назад. (B) цитограммах МНПК из "положительных" населения от субъекта , вакцинированного ~ 3 -х лет назад , и обогащенный , как в (фракция А), после предварительной инкубации с избытком 50 мкМ немеченого Tet-Tox (фракция В), или обогащенный с Tet-Tox-биотина пропущенной во время процедуры (фракция с). Все анализы были закрытого типа на CD19 + лимфоцитов. Процентные доли представляют собой процент Tet-Токс-связывающих клеток всех В - клеток (CD19 +) в конечной фракции.апк "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Примеры анализа после обогащения антигенсвязывающих клеток. (А) Анализ цитометрии Представитель потока клеточного фенотипа следуя обогащения Tet-Tox-связывающих В - клеток. Цитограммах изображают идентификацию и анализ Tet-Tox-реактивного наивных (CD27 -), память (CD27 +) и plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++) в клеточных субпопуляций субъекта до и через 7 дней после бустерной вакцинации против столбняка. Все клетки закрытого типа на CD19 + лимфоцитов из обогащенных "положительных" населения. (Б) представитель ELISPOT анализ выделяющую антитела клеток в обогащенных, обедненный, и общего количества необогащенных фракций В - клеток из периферической крови здорового субъекта через 7 дней после боост. Для анализа ELISPOT, лунки 96-луночного планшета, были сначала покрыты 10 мкг / мл раствора столбнячного анатоксина-. Двукратные серийные разведения клеточных суспензий были сделаны в скважинах (по всей пластине), начиная с клетками при концентрации, равной от обогащенных, обедненных, и общего количества необогащенных фракций. Противостолбнячных секретирующие антитела клетки были обнаружены с биотинилированным антителом против человеческого IgG (H & L), а затем стрептавидином-AP. Пластина была разработана с буфером развития ELISPOT и реакцию останавливают путем промывания планшета три раза с бидистиллированной H 2 O. было определено количество пятен при разведении клеток в линейном диапазоне, и подсчитывали количество ИСС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем метод для достижения выделения и обогащения антигенсвязывающих В-клеток из периферической крови человека. Метод легко применимы к мышам и в других тканях, таких как селезенка и лимфатические узлы, а также совместим с пост-обогатительной анализа клеточного фенотипа и функции (рукопись в процессе подготовки).
Пользователь должен быть осведомлен о ряде переменных, которые могут повлиять на успех этой процедуры. Из опыта мертвые клетки имеют тенденцию придерживаться магнитных шариков и "занимают" флуоресцентные красители, такие как стрептавидин-далеко-красно-флуоресцентный краситель, что приводит к неспецифической повышенного фона. Крайне важно, чтобы удалить как можно больше мертвых клеток из образцов, как это возможно, прежде чем начать эту процедуру. Использование пятен, которые позволяют живой / мертвый дискриминации в ворота из мертвых клеток из анализа может быть полезным, но наличие мертвых клеток может поставить под угрозу интерпретацию анализов антитела секретирующих клеток и частотуфункции после передачи усыновителя.
Кроме того, мы обнаружили, что тщательное титрование биотинилированного антигена добавленного имеет важное значение для различения антиген-специфических и неспецифическое связывание. Использование слишком малого количества антигена приведет к недооценке частоты антигенсвязывающих клеток, в то время как слишком много антиген может вызвать ложное положительное обнаружение / обогащение. Использование концентраций антигена, которые являются слишком высокими могут быть Май обозначены очевидными связывания с не-клеток в образцах. Кроме того, очевидно, обнаружение чрезмерно высокой частоты (> 1%) антигена реактивных клеток может быть признаком связывания проблемы специфичности. Конечной целью при определении оптимального количества антигена , чтобы использовать это , чтобы добавить немного больше , чем антиген присутствует в физиологических концентрациях, таким образом, что большинство клеточных рецепторов с аффинностью <10 -6 М, например, для антиген насыщены. Это гарантирует, что антиген-специфические В-клетки бEing обнаружен с аффинностью, которая имеет патогенный потенциал. Добавление слишком малого количества антигена, то есть на уровне или ниже физиологической концентрации, может привести к обнаружению очень немногих антиген-специфических В - клеток из - за снижения антигена оккупации БКРС. С другой стороны, добавление слишком большого количества антигена, что значительно превышает физиологические концентрации, может привести к повышению неспецифического связывания , которое будет включать в себя В - клетки с низким сродством к антигену (> 10 -6 М) и на самом деле знают антигена в естественных условиях. Следовательно, жизненно важно, чтобы сначала титрование биотинилированного антигена через несколько бревен для того, чтобы быть уверенным в том, что единственный истинный антиген-реактивных В-клетки обнаруживаются. Аналогичным образом, мы обнаружили, что использование слишком большого количества стрептавидин-далеко-красно-флуоресцентный краситель может увеличить фон.
Важно также отметить, что биотинилирования антигена может повлиять на наличие антигенных эпитопов. Следовательно, оптимизация с использованием различных биотинилирование метHODS может иметь важное значение. В качестве альтернативы биотин могут быть соединены с первичными аминами, третичные амины, sulfhydryls или карбоксильных групп. Использование расширенной длины ножка может улучшить доступность эпитопа за счет уменьшения стерического затруднения.
Одним из недостатков этого метода является то его снижение эффективности для обогащения антигенсвязывающих В-клеток из криоконсервации по сравнению со свежим клеток. Это может быть связано с большей клеточной смерти и связанной с "липкость" в замороженных образцах. Тем не менее, этот метод может быть применен к замороженных образцах, но это, вероятно, важно не непосредственно сравнивать результаты обогащения и анализа свежих и замороженных клеток. Другим ограничением является чистота антиген-специфических В-клеток в обогащенном образце. Из опыта, всегда есть некоторые клетки, которые "плетутся", который включает в себя как неспецифические В-клеток и Т-клеток. Это следовало ожидать, учитывая редкость популяции клеток на пытается обогатить. Тем не менее, чистота тон клетки может быть увеличение путем обеспечения того, чтобы суспензии отдельных клеток получают перед добавлением клеток в колонну, обогащении второй раз на новой колонке, или с помощью FACS сортируют антиген-специфических В-клеток. В зависимости от типа исследования, исследователь может решить, какой вариант лучше всего подходит, и является ли это необходимым.
Как мы оптимизировали эту технику, мы предполагается, что было бы поддается дискриминации с высоким сродством по сравнению с низким сродством антиген-реактивных клеток на основе антигена титрования или интенсивности окрашивания. Тем не менее, в предыдущем исследовании, мы показали антиген-реактивных В - клеток с точностью до 1000-кратную разницу в аффинности к их антигену были в равной степени обогащен с использованием этого метода 7. Следовательно, формальное измерение сродства обогащенных клеток с использованием поверхностного плазмонного резонанса анализа экспрессированных рекомбинантных рецепторов антигенов требуется, если знание сродства имеет отношение к изучению.
Присущее в этой технике является лимитация, что добавление биотинилированного антигена и стрептавидин могут активировать клетки сшивкой БСР. Это может создать проблему для конкретных последующих функциональных анализов, таких как те, которые стремятся сравнить стимулированных клеток к покоящимся управления. Эта проблема может быть уменьшена путем держать контрольные пробы холода для предотвращения трансдукции сигналов. Также возможно, что BCR сигналы могут повлиять на постоянный биологический ответ. Из опыта антиген обогащенным клетки сохраняют свою способность секретировать антитела, как показано с помощью анализа ELISPOT (рис 3b) , и функции в качестве антиген - представляющих клеток в Т - клеток в пробирке и после переноса в приемному мышей (данные не показаны). Окончательное ограничение этого метода является использование анти-fluorochome антител для достижения связывания с антигеном, адсорбируются клетками в виде наночастиц. Анти- далеко-красно-флуоресцентный краситель перекрестно реагирует с определенными структурно родственных флюорохромами, включая Cy7 и Cy5.5. Это может ограничить варианты выводаF конъюгаты антител, доступных для измерения фенотипических маркеров. Тем не менее, с повышением доступности новых флюорохромами, это становится менее важной проблемой.
С помощью этого метода обнаружения и обогащения, можно легко идентифицировать антиген-связывающих В - клеток в периферической экс виво в крови, селезенки, или других тканей. Этот метод особенно полезен при изучении иммунного ответа антиген-реактивных клеток после иммунизации или воздействия чужеродных антигенов и в установлении аутоиммунного заболевания. Хотя ни один из методов, чтобы обнаружить антиген-реактивных В-клеток не доказано, что без его недостатки, этот метод является быстрым, простым и дает относительно высокую степень чистоты, выход и обогащение антиген-реактивных клеток, которые могут быть соединены с различными вниз по течению анализов. Кроме того, из-за основных принципов метода, эта процедура может быть легко адаптированы к различным экспериментальным требованиям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
