Summary
En enkel, men effektiv metode, der benytter magnetiske nanopartikler til at opdage og berige antigen-reaktive B-celler til funktionel og fænotypisk analyse beskrives.
Introduction
Begrænsende fortynding analyser af antistof-secernerende celle forstadieforekomst har antydet, at B-celler reaktive mod et bestemt antigen typisk sted med en frekvens på 0,05 til 0,005% i det normale repertoire, afhængigt af status vaccination og størrelse / antal epitoper er til stede på antigenet. Den lavfrekvente af disse celler har gjort det vanskeligt at studere ændringer i deres status under udviklingen af immunreaktioner, såsom efter vaccination eller udsættelse for et fremmed antigen, eller under udviklingen af autoimmunitet. Tidligere har forskere gennemført isolering af antigen-reaktive B-celler under anvendelse af teknikker, der spænder fra antigen coatede plader eller kolonne adsorbenter, til antigen-coatede røde blodlegemer nulstilling, til fluorescens-aktiveret cellesortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though disse teknikker har haft succes med at identificere og isolere antigen-reaktive B-celler, har resultaterne varieret i form af udbytte, renhed og skalerbarhed. For nylig har vi udviklet en ny fremgangsmåde til både påvisning og berige sjældne B lymfocyt subpopulationer anvendelse af magnetiske nanopartikler. Metoden muliggør berigelse med relativt højt udbytte og renhed fra store udgangspunkter befolkninger, og er kompatibel med analyse af reaktioner på antigen. Ved at berige fra populationer af celler i suspension, hvilken fremgangsmåde eliminerer problemer, der er forbundet med geometrien af antigen-coatede plader eller kolonner og begrænser gennemløb. Endelig eftersom berigede celler forblive forbundet med antigen og en fluorescerende reporter, kan de renses yderligere ved FACS-sortering. Som beskrevet heri har vi anvendt denne metode til undersøgelse af perifere blod tetanustoxoid-reaktive B-celler før og efter immunisering af humane individer, såvel som autoantigene reaktive B-celler fra individer med forskellige autoimmune lidelser, herunder type 1-diabetes, Graves 'sygdom, og Hashimotos sygdom 7. Fremgangsmåden fungerer lige godt i mus og menneske, og er kompatibel med analyse af antigen-reaktive B-celler fra en række forskellige væv (manuskript under udarbejdelse).
I sin grundlæggende format, er perifert blod mononukleære celler først inkuberet med biotinyleret antigen sammen med antistoffer mod celleoverfladeantigener kræves til fænotypisk analyse. Dette trin mærkning efterfulgt af vask og fiksering, og tilsætning af streptavidin koblet til langt-rød-fluorescerende farvestof til detektering af biotinylerede-antigenbindende celler (figur 1). Tidligere undersøgelser har identificeret antigenspecifikke B-celler på lignende måde men under anvendelse antigener direkte konjugeret til et fluorochrom 8, 9, 10, 11. Selv om dette er en værdigtilgang, anvendelse af biotinylerede antigener i sammenhæng med streptavidin muliggør en større signalforstærkning (dermed bedre differentiering af bindende og ikke-bindende celler), især når antigener er små 12, 13, 14. En yderligere overvejelse er anvendelsen af streptavidin i stedet for avidin fordi streptavidin deglycosyleret, faldende ikke-specifik binding. Yderligere bruger vi langt-rød-fluorescerende farvestof som fluorchrom grundet dens fotostabilitet, kvantumudbytte (lysstyrke), og dens lille størrelse (~ 1,3 kD). Protein-fluorochromer, såsom phycoerythrin (~ 250 kD) og allophycocyanin (~ 105 kD) 15 er ikke optimale, da de potentielt indeholde mange antigene epitoper. Anvendelse af et lille organisk fluorescerende farvestof sammensat af en enkelt epitop, såsom langtrækkende rød-fluorescerende farvestof, reducerer kompleksiteten af det isolerede cellepopulation.
Når celler biotinyleres-antigen og langt-rød-fluorescerende farvestof-streptavidin adsorberet, er de berigede anvendelse af anti-far-rød-fluorescerende farvestof-konjugeret magnetiske nanopartikler. Enkelte nanopartikler er ikke opdaget af de fleste flowcytometre og skal derfor ikke fjernes før rensning ved FACS sortering og downstream analyser 16. Magnetisk selektion for antigenspecifikke B-celler beriger populationen af interesse, hvilket eliminerer den tid og omkostninger til sortering sjældne begivenheder ved hjælp et flowcytometer.
Nedenfor viser vi repræsentative resultater fra berigelse af stivkrampe-toxoid-specifikke B-celler fra et emne før og syv dage efter tetanustoksoid booster immunisering. Vi valgte denne særlige anvendelse som et eksempel for at demonstrere evnen af denne fremgangsmåde til at berige antigenspecifikke B-celler efter akut in vivo-stimulering. Når kombineret med flowcytometri, denne metode er stand til at berige og differentierende antigen-specifik naive, hukommelse, ogplasmablast B-celler og gør det muligt for forskeren at følge ændringer i deres frekvens over tid. Derudover inkluderer vi en anden mulig nedstrøms assay, fx en ELISPOT-analyse, der viser, at celler bevarer evnen til at udskille antistof efter berigelse. En anden anvendelse af denne metode kan indebære adoptiv overførsel af berigede celler i en vært. Vi har tidligere vist celler opretholder evnen til at virke som antigenpræsenterende celler til antigenspecifikke T-celler efter isolering og overførsel (data ikke vist). Derfor er der en række mulige downstream assays, der kunne kobles til den metode, der tilsammen informerer forståelse af antigen-specifikt immunrespons. Vi har beskrevet nedenstående metode, herunder kontrol for at bestemme samlede udbytte, renhed, celle specificitet, og fold-berigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af Humane PBMC'er
- Saml 30-50 ml blod ved hjælp af hepariniseret blod indsamling rør.
BEMÆRK: Den mængde blod, der anvendes afhænger af den særlige eksperimentelle spørgsmål og frekvens i blod af antigenspecifikke B-celler af interesse. Hepariniseret blod kan forarbejdes straks eller vippes blidt natten over ved stuetemperatur til behandling den følgende dag. Forsinkelsen i forarbejdningen har meget lille virkning på effektiviteten af berigelse og er forbundet med minimalt tab af levedygtighed. - Bland fuldblod 1: 1 med sterilt, stuetemperatur magnesium og calcium fri phosphatbufret saltvand (PBS).
- I et 50 ml sterilt konisk rør, der tilsættes 10 ml stuetemperatur densitetsgradient opløsning. Opbevar de åbnede densitetsgradient flasker i mørke ved 4 ° C, men varm op til stuetemperatur før brug.
- Hvis det er muligt indstille pipetten pistol til den langsomme indstilling og / eller anvende meget lidt, men dog konsekvent, udløse trykket til langsomtlag 30-35 ml af den fortyndede blod på toppen af densitetsgradient, og pas på ikke at blande de to.
BEMÆRK: Placering af spidsen af pipetten mod kanten af de 50 ml koniske mens tilsætning af den fortyndede blod vil sikre en ensartet jævn strøm. - Centrifuger ved 400 xg i 30 min ved 20 ° C med bremsen slået fra.
- Fjern det øverste lag, som indeholder plasma og blodplader, og pas på ikke at forstyrre mononukleære cellelag nedenfor.
- Anvendelse af en steril pipette, indsamle det mononukleære cellelag (buffy coat) og anbringes i en separat steril 50 ml konisk rør.
- Tilføj PBS til cellesuspensionen til et volumen på 50 ml. Centrifuger ved 400 xg i 10 minutter ved 20 ° C med bremse.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleterede celler i 10 ml PBS. Tæl celler og bestemme levedygtighed under anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller.
- Resuspender cellerne ved 10 7 celler / ml og sted på is indtil klar til videre behandling.
2. farvning af celler
- Fjern 1-2 x 10 6 celler for hver fluorescens kompensation / FMO kontrol nødvendig, hvis det er relevant. Centrifuge resterende celler ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med bremse.
- Resuspender celler i sterilt filtreret kold FACS-buffer (PBS + 1% bovint serumalbumin (BSA) + 0,01% natriumazid) ved 3-6 x 10 7 celler / ml (fjern i et 1,5 ml centrifugerør). Sørg for, at FACS-buffer er koldt og holde det på is under hele farvningen procedure.
- Opdel cellepopulationen i fjerdedele (AD) ved optimering af assayet. Brug fraktion A at berige antigen-specifikke B-celler af interesse, brug fraktionerne B og C til at bestemme specificiteten af berigelse / farvning (se 2.5 og 2.6 nedenfor), og brug fraktion D til at bestemme hyppigheden og antallet af antigen-specifikke celler i den ikke-stimulusberigede befolkning til at muliggøre beregning af udbytte og fold-berigelse.
- Tilføj human FcyR blokerer remiddel til brøkdele AD på is for at forhindre binding af antistoffer mod Fc-receptorer.
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger for passende betingelser. - Tilføj fluorokromkonjugerede antistoffer mod celleoverfladeantigener af interesse for fraktionerne AD for 30 minutter på is i mørke, og pas på ikke at medtage fluorokromer, der kan krydse reagerer med anti-langt-rød-fluorescerende farvestof antistoffer koblet til magnetiske nanopartikler.
BEMÆRK: Disse omfatter antistofkonjugater til nær-IR fluorescerende farvestof, Cy5, Cy5.5, og Cy7. Eventuelle levedygtighed pletter, der tilsættes bør være foreneligt med anvendelsen af et fiksativ. Hvis man ikke har til hensigt at analysere cellerne under anvendelse af FACS, men bestemme antistof-secernerende frekvens, for eksempel ved ELISPOT, overflade farvning med antistoffer er unødvendig. - For at teste specificiteten af assayet inkuberes fraktion B med tilstrækkelig mængde umærket antigen i 30 minutter på is, således at størstedelen af receptorerne med en affinitet på mindst10 -6 M er blokerede.
BEMÆRK: Typisk et godt udgangspunkt koncentration er en 50-100 gange overskud af mængden af antigen i 2,6 anses for tilstrækkelig nedenfor (fx 50-100 uM). Dette bør blokere alle B-celler med en høj affinitet for den umærkede antigen at binde til den biotinylerede antigen, der tilsættes i trin 2.6 nedenfor, hvilket således tillader bekræftelse af specificiteten af cellerne er beriget. Dette trin kan være afsluttet i forbindelse med trin 2.4 ovenfor. - Tilføj biotinyleret antigen til Fraktioner A, B og D. Der inkuberes på is i 30 minutter.
BEMÆRK: Koncentration af biotinyleret antigen bør titreres for at bestemme den optimale mængde er nødvendig for at sikre tilstrækkelig påvisning og adskillelse af bindende celler fra ikke-specifikke bystander celler. Typisk et godt udgangspunkt fusions test er 1-5 uM.
BEMÆRK: Brøker A og D, dette trin kan udføres samtidig med trin 2.4 ovenfor. For Fraktion B, bør dette skridt ske efter trin 2.5 (vask i mellem kølingeen trin er unødvendig). - Udelad biotinyleret antigen fra fraktion C for at bestemme nogen binding af B-celler til andre reagenser i protokollen, såsom streptavidin- langt-rød-fluorescerende farvestof og de magnetiske perler.
- Vask cellerne to gange ved suspension af celler i 1 ml kold FACS-buffer per 5 x 10 7 celler og centrifugering ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Efter den sidste vask, fortyndes koncentreret cellesuspension i 1 ml 2% formaldehyd per 5 x 10 7 celler og lad sidde i mørke på is i 5 min.
BEMÆRK: Fiksering af cellerne på dette punkt sikrer, at den biotinylerede antigen forbliver bundet til BCR for resten af proceduren. For levedygtige celler - for downstream analyse, som i ELISPOTs eller adoptivforældre overførsler, udelade fiksering trin. - Vask cellerne to gange med 1 ml kold FACS-buffer per 5 x 10 7 celler og centrifugeres ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C. Resuspender i 1 ml kold FACS buffer pr 5 x 107-celler.
- Tilføj 1-2 ug streptavidin-far-rød-fluorescerende farvestof / ml og inkuberes på is i 20 minutter i mørke. Titrere mængden af streptavidin til hver anvendelse.
- Vask cellerne to gange med 1 ml kold FACS-buffer per 5 x 10 7 celler og centrifugeres ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C. Fraktion D forberedelse er afsluttet på dette punkt, da det ikke vil undergå berigelse ved hjælp af de magnetiske perler.
BEMÆRK: Denne prøve vil blive brugt til at bestemme hyppigheden og antallet af antigen-specifikke B-celler i prøven. Den bruges til at bestemme udbyttet og fold-berigelse opnås ved berigelse.
3. Magnetisk Nanopartikel-baserede Berigelse
- Resuspender celler fra prøver AC i 1 ml kold adskillelse puffer (PBS + 0,5% BSA + 2mM EDTA) per 5 x 10 7 celler og passere gennem et 40 um filter for at fjerne eventuelle klumper, der kunne tilstoppe kolonnen.
- Tilføj Anti-Cy5 / Anti-langt-rød-fluorescerende farvestof nanopartikler. for optimale resultater, bør koncentrationen af nanopartikler titreres for hver anvendelse, men et godt udgangspunkt er 50 pi suspension pr 5 x 10 7 celler / ml. Rotere i mørke ved 4 ° C i 10 minutter.
- Vask to gange med 1 ml kold adskillelse buffer ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C. Resuspender celler i 1 ml kold adskillelse buffer per 5 x 10 7 celler.
4. Magnetisk Berigelse Brug LS eller LD Kolonner
- Placere tre LS eller LD kolonner i det magnetiske felt af et magnetisk separator, og der tilsættes 3 ml adskillelse puffer til våd kolonnerne (se produktbeskrivelse at afgøre, hvilken type kolonne er bedst egnet). Tillad alle 3 ml passere gennem søjlen og kasseres efter indsamling.
BEMÆRK: Selvom separation af magnetiske nanopartikler mærkede celler kan gennemføres ved anvendelse helst af de magnetisk separation udstyr, som er kommercielt tilgængelige, har laboratoriet havde mest succes med anvendelse af LS kolonner, i terms af udbytte, renhed, og effektiviteten af berigelse. - Anbring tre 15 ml koniske rør mærket "fraktion A / (B) / (C) negativ", for negativt selekterede celler, i kolonnen. Tilsæt magnetisk partikel mærkede celler til deres respektive kolonne og lade hele mængden at passere igennem.
- Tilsæt 3 ml kold adskillelse buffer på toppen, og lade dette passere gennem søjlen og gentag med 2 ml. Saml de negativt udvalgte celler og der er afsat på is.
- Fjern kolonne fra magnetfeltet og sted på toppen af en 15 ml konisk rør mærket "fraktion A / (B) / (C) positive", for positivt selekterede celler.
- Fyld kolonnen til toppen med ca. 6 ml adskillelse puffer og straks kaster dette volumen gennem søjlen for at indsamle celler, der var bundet til magnetiske felt ved hjælp af billede stemplet.
- At øge renheden, kan de positivt selekterede celler blive yderligere beriget ved hjælp af en anden ren kolonne, gentage procedure.
- Spin både de negativt og positivt selekterede fraktioner ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C og suspension i ønskede endelige volumen. Fortsæt med nedstrøms analyse, såsom FACS, ELISPOT eller adoptiv overførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse af renhed, udbytte, og fold-berigelse ved hjælp af flowcytometri
Populationer beriget som beskrevet ovenfor uundgåeligt indeholde kontaminerende celler, som ikke er bundet streptavidin- langt-rød-fluorescerende farvestof, men er fanget i matrixen. Disse urenheder kan fjernes fra berigede populationer ved FACS-sortering. For at estimere renhed berigede populationer, gate på levende celler baseret på forward og side scatter og / eller live / dead plet og analysere langt-rød-fluorescerende farvestof + celle frekvens. Procentdelen under denne sidstnævnte gate er indikativ for renhed. Yderligere analyse af specificiteten og antigen affinitet af disse celler kræver FACS-sortering af enkeltceller, efterfulgt af kloning og sekventering af udtrykte immunoglobulingener og rekombinant antistof produktion og analyse.
Udbytte refererer til antallet af isolerede antigen-bindende B-celler inddrevet i fraktion A i forhold til antallet i udgangspopulationen (fraktion D). Da det samme antal celler var i fraktion D som fraktion A, kan man direkte bestemme udbyttet (# af antigenbindende B-celler i fraktion A ÷ # af antigenbindende B-celler i fraktion D).
Fold-berigelse (E) reflekteres af den procentdel af langt-rød-fluorescerende farvestof + B-celler i "positivt" beriget fraktion A i forhold til, at der i Fraction D. Denne værdi angiver proportional stigning i antigen-specifikke B-celler opnået ved nanopartikel berigelse. Værdien kan findes ved hjælp af følgende ligning:
For at demonstrere denne teknik, viser vi repræsentative resultater opnået ved anvendelse af tetanus-toxoid (Tet-Tox) som modelantigen til påvisning og berige med Tet-Tox-reaktive B-celler i det perifere blod af forsøgspersoner, som er vaccineret mod stivkrampe ved varierende tidspunkter. Figur 1 er et skema over fremgangsmåden og antigenet adsorbent. Figur 2a viser frekvensen af Tet-Tox-reaktive B-celler fra et individ, der sidst blev vaccineret mod stivkrampe mere end et årti siden. Vist er den berigede ( "positive") og afladet ( "negative") populationer fra fraktion A og baseline hyppigheden af Tet-Tox-specifikke B-celler fra fraktion D. Derfor, i dette eksempel er vi i stand til at berige bindende celler med ca. 7 gange og opnåede en renhed på 4% i den berigede fraktion.
Figur 2b viser specificiteten af reaktionen under anvendelse af blod fra et individ, der var blevet vaccineret ~ 3 år tidligere. Når vi tilføjet et 50 gange overskud (50 uM) umærket tetanus-toxoid til cellerne før addition af det biotinylerede antigen (fraktion B) er vi i stand til at blokere binding med 83%, hvilket viser specificiteten af antigenbinding. Når vi udeladt biotinyleret antigen fra proceduren (fraktion C), et lille antal (~ 0,2%) af B-celler stadig bundet; denne lille fraktion af B-celler formentlig afspejler binding til nogle ikke-antigen i adsorbant, såsom streptavidin-far-rød-fluorescerende farvestof, anti-far-rød-fluorescerende farvestof-antistof eller de magnetiske perler.
Til at demonstrere brugen af metoden til at analysere ændringer i antigenbindende cellefænotype efter immunisering vi viser i figur 3 hyppigheden af Tet-Tox-specifikke B-celler i det naive, hukommelse og plasmablast befolkninger i blod udtaget før og 7 dage efter booster vaccination af en rask person. Mens andelen af naive B-celler blandt de samlede Tet-Tox-bindende B-celler faldt fra 84% til 64% efter boost, procentdelen af MEMORy og plasmablast befolkninger blandt samlede Tet Tox-reaktive celler steg fra 16% til 36% og 0% til 40%, hhv. Figur 3b viser repræsentative ELISPOT data fra perifert blod fra de 7 dage efter boost rask individ. Isolering af Tet-Tox-bindende B-celler førte til 4-fold berigelse i tetanustoksoid antistofsecernerende-celle frekvens.
Figur 1: Fremgangsmåde til påvisning og berigelse af tetanustoxoid (Tet Tox) -bindende B-celler. (A) Protokol til berigelse og isolering af Tet-Tox-bindende B-celler. (B) Diagram over adsorbent anvendes til at identificere og berige Tet-Tox-bindende B-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
n-side = "1"> 
Figur 2: Repræsentative cytogrammer demonstrerer berigelse af Tet Tox-bindende B-celler fra humant perifert blod. (A) cytogrammer af beriget og forarmet Tet Tox-reaktive B-celler fra fraktion A og totale Tet-Tox-reaktive B-celler fra Fraktion D fra et normalt emne sidste vaccineret> 10 år tidligere. (B) cytogrammer af PBMC'er fra de "positive" populationer fra et individ vaccineres ~ 3 år tidligere og beriget som i A (fraktion A), efter præinkubation med overskud af 50 uM umærket Tet-tox (fraktion B), eller beriget med Tet-Tox-biotin udeladt under proceduren (fraktion C). Alle analyser blev gated på CD19 + lymfocytter. Procenter repræsenterer procent af Tet-Tox-bindende celler af alle B-celler (CD19 +) i den endelige fraktion.ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempler på post-berigelse analyse af antigen-bindende celler. (A) repræsentant flowcytometrisk analyse af cellefænotype efter berigelse af Tet-Tox-bindende B-celler. Cytogrammer skildrer identifikation og analyse af Tet-Tox-reaktivt naive (CD27 -), hukommelse (CD27 +), og plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++) i B-celle subpopulationer af et emne før og 7 dage efter booster vaccination mod stivkrampe. Alle celler blev gated på CD19 + lymfocytter fra de berigede "positive" populationer. (B) repræsentant ELISPOT-analyse af antistof-secernerende celler i berigede udtømte, og de samlede stimulusberigede B cellefraktioner fra perifert blod fra en rask person 7 dage efter boost. For ELISPOT-analyse blev brønde i en plade med 96 først coatet med en 10 ug / ml opløsning af tetanus-toxoid. To gange serielle fortyndinger af cellesuspensioner blev fremstillet i brønde (på tværs af pladen), startende med celler ved lige koncentration fra de berigede, udtømte, og de samlede stimulusberigede fraktioner. Anti-tetanus-antistof-secernerende celler blev detekteret med biotinyleret anti-humant IgG (H & L), efterfulgt af Streptavidin-AP. Pladen blev udviklet med ELISPOT udvikling buffer, og reaktionen blev stoppet ved vask af pladen tre gange med dobbelt-destilleret H2O Antallet af pletter ved en celle fortynding i det lineære område blev bestemt, og antallet af ASC'er blev beregnet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en hidtil ukendt metode til at opnå isolering og berigelse af antigen-bindende B-celler fra humant perifert blod. Fremgangsmåden er let anvendelig til mus og til andre væv, såsom milten og lymfeknuderne, og er kompatibel med post-berigelse analyse af cellefænotype og funktion (manuskript under udarbejdelse).
Brugeren skal være bekendt med en række variabler, som kan påvirke succes af denne procedure. Af erfaring døde celler tendens til at klæbe til de magnetiske perler og "fylder" fluorescerende farvestoffer, såsom Streptavidin-far-rød-fluorescerende farvestof, der fører til ikke-specifik forøget baggrund. Det er afgørende at fjerne så mange døde celler fra prøver som muligt, før du begynder denne procedure. Anvendelse af pletter, der giver levende / død forskelsbehandling gate ud døde celler fra analysen kan være nyttige, men tilstedeværelsen af døde celler kan kompromittere fortolkning af analyser af antistof secernerende celle frekvens ogfunktion efter adoptiv overførsel.
Desuden har vi fundet, at omhyggelig titrering af biotinyleret antigen tilsættes, er afgørende for at skelne antigen-specifik og ikke-specifik binding. Anvendelse af for lidt antigen vil føre til undervurdering af frekvensen af antigenbindende celler, mens for megen antigen kan forårsage falsk positiv detektion / berigelse. Anvendelse af antigen-koncentrationer, der er for høje maj kan angives med tydelig binding til ikke-B-celler i prøverne. Endvidere tilsyneladende påvisning af en for høj frekvens (> 1%) af antigen-reaktive celler kan være en indikation af bindingsspecificitet problem. Det ultimative mål ved fastlæggelsen af optimale mængde antigen at bruge, er at tilføje en lille smule mere antigen end det er til stede ved fysiologiske koncentrationer, således at størstedelen af B-celle receptorer med en affinitet på <10 -6 M, for eksempel til antigenet er mættede. Dette sikrer, at antigen-specifikke B-celler er being detekteret med en affinitet, der har patogene potentiale. Tilsætning af for lidt antigen, dvs. ved eller under fysiologiske koncentrationer kan føre til påvisning af meget få antigenspecifikke B-celler på grund af nedsat antigen besættelse af bindende virksomhedsregler. På den anden side, tilsætning af for meget antigen, der langt overstiger fysiologiske koncentrationer, kan føre til øget ikke-specifik binding som vil omfatte B-celler med en lav affinitet for antigenet (> 10 -6 M) og er faktisk uvidende af antigenet in vivo. Derfor er det afgørende at først titrere biotinylerede antigen tværs af et par logs for at være sikker på, at der bliver opdaget kun sande antigen-reaktive B-celler. Ligeledes har vi fundet, at anvendelse af for meget streptavidin-far-rød-fluorescerende farvestof kan øge baggrunden.
Det er også vigtigt at bemærke, at biotinylering af antigen kan påvirke tilgængeligheden af antigene epitoper. Derfor optimering med forskelligt biotinylering opfyldtrække tværgå- ende kan være vigtig. Alternativt biotin kan kobles til primære aminer, tertiære aminer, sulfhydryler eller carboxylgrupper. Brug af udvidede spacer arm længder kan forbedre epitop tilgængelighed ved at reducere sterisk hindring.
En af begrænsningerne til denne teknik er dens reduceret effektivitet for berigelse af antigen-bindende B-celler fra kryopræserveret sammenlignet med friske celler. Dette kunne forholde sig til større celledød og tilhørende "klæbrighed" i frosne prøver. Ikke desto mindre kan fremgangsmåden anvendes på frosne prøver, men det er sandsynligvis vigtigt ikke at direkte sammenligne resultater fra berigelse og analyse af friske og frosne celler. En anden begrænsning er renheden af antigenspecifikke B-celler i den berigede prøve. Af erfaring, er der altid nogle celler, "tag langs", som omfatter både ikke-specifikke B-celler og T-celler. Dette er for at forventes givet sjældenhed af cellepopulationen på forsøger at berige. Imidlertid er renheden af than celler kan være stigning ved at sikre, at en enkelt celle suspension er opnået før tilsætning af cellerne til søjlen, berige en anden gang på en ny kolonne, eller ved FACS-sortering af antigen-specifikke B-celler. Afhængigt af hvilken type af undersøgelsen, forskeren kan afgøre, hvilken løsning der er bedst, og om det er nødvendigt.
Som vi optimeret denne teknik vi forudset, at det ville være muligt at foretage en skelnen mellem høj affinitet versus lav affinitet antigen-reaktive celler baseret på antigen titrering eller farvningsintensitet. I en tidligere undersøgelse viste vi antigen-reaktive B-celler med op til en 1000-fold forskel i affinitet til deres antigen blev ligeledes beriget ved hjælp af denne metode 7. Derfor er formel måling af affiniteten af berigede celler under anvendelse af overfladeplasmonresonans-analyse af udtrykte rekombinante antigen-receptorer påkrævet, hvis kendskab affiniteten er relevant for undersøgelsen.
Iboende i denne teknik er lefterligning at tilsætning af biotinyleret antigen og streptavidin kan aktivere cellerne ved tværbinding BCR. Dette kan udgøre et problem for bestemte downstream funktionelle assays, såsom dem, der søger at sammenligne stimulerede celler til en hvilende kontrol. Dette problem kan afhjælpes ved at holde kontrolprøver kolde at forhindre transduktion af signaler. Det er også muligt, at BCR-signaler kan påvirke en igangværende biologisk respons. Af erfaring antigen-berigede celler bevarer deres evne til at secernere antistof, som angivet ved ELISPOT-analyse (figur 3b) og fungerer som antigen-præsenterende celler til T celler in vitro og efter adoptiv overførsel i mus (data ikke vist). En sidste begrænsning til denne teknik er anvendelsen af anti-fluorochome antistoffer til at udrette nanopartikel binding til antigen adsorberet celler. Anti langt-rød-fluorescerende farvestof krydsreagerer med visse strukturelt beslægtede fluorokromer, herunder Cy7 og Cy5.5. Dette kan begrænse mulighederne of antistofkonjugater til rådighed til måling af fænotypiske markører. Men med øget tilgængelighed af nye fluorokromer, dette bliver mindre af et problem.
Brug af denne afsløring og berigelse fremgangsmåde er det muligt let at identificere antigenbindende B-celler i ex vivo perifert blod, milt eller andet væv. Denne fremgangsmåde er særlig nyttig ved undersøgelse af immunresponset af antigenreaktive celler efter immunisering eller udsættelse for fremmede antigener og i fastsættelsen af autoimmun sygdom. Selv om ingen metode til at påvise antigen-reaktive B-celler har vist sig at være uden sine fejl, denne metode er hurtig, enkel, og danner en relativt høj renhed, udbytte og berigelse af antigen-reaktive celler, der kan kobles til en række aftagere assays. Desuden, på grund af de grundlæggende principper for fremgangsmåden, denne procedure kan let tilpasses til en række forskellige eksperimentelle behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
