Summary
Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.
Introduction
Sınırlandırıcı sulandırma antikor salgılayan hücre ön-madde frekans analizleri, belirli bir antijene reaktif B hücreleri tipik olarak aşı statüsü ve antijen üzerinde mevcut olan epitopları boyutu / sayısına bağlı olarak, normal bir repertuar% 0.05 0.005 arasında bir sıklıkta gerçekleştirilir olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu hücrelerin düşük frekanslı zor bir yabancı antijene karşı, veya otoimmün orijinli bir hastalık sırasında aşağıdaki aşılama veya maruz kalma gibi bağışıklık tepkilerinin, gelişimi sırasında durumundaki değişiklikleri çalışma yapmıştır. Daha önce, araştırmacılar, antijen kaplı kırmızı kan hücresi sıfırlama antijen kaplı plakalar veya sütun adsorbanlar arasında değişen teknikler kullanılarak antijene reaktif B hücrelerinin izole üstlenmiştir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ayırma hücresi floresans ile aktive. thougBu teknikler antijene reaktif B hücreleri belirlenmesi ve izole başarılı olmuştur h sonuçlar verim, saflık ve ölçeklenebilirlik açısından değişmiştir. Son zamanlarda biz de algılamak ve manyetik nanopartiküller kullanarak nadir B lenfosit alt popülasyonlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem geliştirdi. yöntem, geniş bir başlangıç popülasyonlarından nispeten yüksek verim ve saflıkta zenginleştirme sağlar ve antijene yanıtların analizi ile uyumludur. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin popülasyonlardan zenginleştirerek metot, antijene kaplı levha veya gruplarından ve limit hacmi geometrisi ile ilişkili kısıtlamalar ortadan kaldırır. zenginleştirilmiş hücrelerin antijen ve bir flüoresan raportör ile birlikte devam Son olarak, çünkü, bunlar daha FACS sıralama ile saflaştırılabilir. Burada tarif edildiği gibi çeşitli autoi olan deneklerden daha önce periferal kan tetanos toksoid-reaktif B hücrelerinin çalışma ve insan deneklerin aşağıdaki aşılama yaklaşımı, hem de otoantijen-reaktif B hücreleri kullandıkTip 1 diyabetin, Graves hastalığı, ve Hashimoto hastalığı 7 de dahil olmak üzere mmune bozuklukları. yöntem, fare ve insan eşit derecede iyi çalışır ve çeşitli dokularda (hazırlama yazısı) antigen reaktif B hücrelerinin analizi ile uyumludur.
Temel biçiminde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ilk fenotipik analizi için gerekli olan hücre yüzey antijenlerine karşı antikorlar ile biyotinile edilmiş antijen ile inkübe edilir. Bu etiketleme adım yıkama ve tespit ve hücreleri biyotinlenmiş-antijeni (Şekil 1) tespiti için uzak-kırmızı-floresan boya bağlanmış streptavidin ilave edildi edilir. Daha önceki çalışmalar, benzer bir şekilde antijene spesifik B hücreleri tespit ettik ancak burada antijenler doğrudan florokrom 8, 9, 10, 11 konjüge. bu layık olmasına rağmenyaklaşım streptavidin ile bağlantılı olarak biyotinlenmiş antijenler kullanımı antijenleri, 12, 13, 14 küçük, özellikle daha büyük bir sinyal amplifikasyon (bağlanma ve bağlayıcı hücrelerin dolayısıyla daha iyi farklılaşma) sağlar. Ek göz streptavidin yerine avidin, streptavidin deglikosile olduğundan, spesifik olmayan bağlanma azaltılması kullanılmasıdır. Ayrıca, biz nedeniyle, kuantum verimi (parlaklık) kendi foto stabilitesi ve küçük boyutu (~ 1.3 kD) için florokrom kadar kırmızı-floresan boya kullanın. Potansiyel olarak bir çok antijenik epitopları içerdikleri için protein, fikoeritrin olarak fluorochromes (~ 250 kD) ve alofikosiyanin (~ 105 kD) 15 optimal değildir. Bu uzak-kırmızı-flüoresan boya olarak, tek bir epitop oluşan küçük organik bir floresan boya kullanılması, izole edilmiş hücre popülasyonunun karmaşıklığını azaltır.
Hücreler sonra biyotinile-antigen ve uzak-kırmızı-floresan boya-streptavidin adsorbe, anti-uzak-kırmızı-floresan boya-konjuge manyetik nanopartiküller kullanılarak zenginleştirilmiştir. Tek nanopartiküller malzeme akışı sitometre ile tespit edilmez ve bu nedenle ayırma FACS ve alt deneyleri 16 ile saflaştırma öncesinde iyice uzaklaştırılması gerekmez. antijen-spesifik B hücreleri için manyetik seçim zamanı ve debi sitometresinde nadir olaylar sıralama maliyetini ortadan kaldırarak, ilgi nüfusu zenginleştirir.
Daha önce, yedi gün tetanos toksoid destekleyici aşılamadan sonra gönüllüden tetanoz toksoid özgü B hücrelerinin çoğalmasını, temsili sonuçlar göstermektedir görebilirsiniz. In vivo uyarım akut Aşağıdaki antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için bu yöntemin yeteneğini göstermek için, örnek olarak, bu özel uygulama seçtik. akış sitometrisi ile birlikte, bu yöntem, zenginleştirici ve ayırt antijene özgü saf, bellek kapasitesine sahip olan veplazmablast B hücreleri ve araştırmacı zamanla sıklığı değişiklikleri izlemenizi sağlar. Buna ek olarak, örneğin, hücreler, zenginleştirme Aşağıdaki antikor salgılayan kabiliyetini muhafaza göstermektedir bir ELISPOT deneyi, başka bir olası alt-deneyi içerir. Bu yöntemin başka bir uygulaması, bir konakçıya zenginleştirilmiş hücrelerinin adoptif transferini içerebilir. Daha önce hücreler izolasyon ve devri sonrasında antijen-spesifik T hücrelerine antijen sunan hücrelerin olarak hareket yeteneğini korumak göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, araya antijene özel bağışıklık tepkisinin anlaşılmasını bilgi yöntemi, bağlanmış olabilir aşağı taraftaki muhtemel bir çok deney mevcuttur. Biz genel verim, saflık, hücre özgünlüğünü belirleyen ve kat-zenginleştirme kontrolleri de dahil olmak üzere, yöntem aşağıda tarif var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan PBMC 1. izolasyonu
- heparinize kan toplama tüpleri kullanarak kan 30-50 ml toplayın.
Not: kullanılan kan miktarı ilgi antijene özgü B hücreleri, kandaki özel deneysel söz ve frekansına bağlıdır. Heparin enjekte edilmiş kan hemen işleme ya da ertesi gün işlem oda sıcaklığında gece boyunca yavaşça sallandı edilebilir. işleme gecikmesi zenginleştirme verimliliği üzerinde çok az bir etkiye sahiptir ve canlılığı kaybıyla ilişkilendirilir. - tam kan 1 karışım: 1 steril oda sıcaklığında magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile.
- 50 ml'lik steril bir konik tüp, oda sıcaklığı yoğunluk gradyan çözeltisi 10 ml. 4 ° C'de karanlıkta açılan yoğunluk gradyanlı şişeleri saklamak fakat kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya.
- Mümkünse yavaş ayara pipet silahı ayarlamak ve / veya yavaş çok az, ancak tutarlı, tetik baskı uygulamakiki karıştırmak için dikkatli olmak, yoğunluk gradyanı üstünde seyreltilmiş kan 30-35 ml katman.
NOT: sulandırılmış kan ekleyerek tutarlı bir sabit bir akış sağlamak ise 50 ml kenarına pipet ucu yerleştirilmesi konik. - Fren 20 ° C'de 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje kapalı.
- Aşağıdaki mononükleer hücre tabakası rahatsız etmemek için dikkatli olmak, plazma ve trombosit içeren üst katman, çıkarın.
- Steril bir pipet kullanarak, tek çekirdekli hücre tabakası (buffy coat) toplanması ve ayrı bir steril 50 ml konik tüp içine yerleştirin.
- 50 ml'lik bir hacme kadar hücre süspansiyonu PBS ekleyin. Fren 20 ° C 'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı ve 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Hücreleri saymak ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacını kullanarak canlılığı belirler.
- Daha fazla işlem için hazır olana kadar 10 7 hücre / ml ve buz üzerinde yer yeniden süspanse hücre.
Hücreler 2 boyanması
- Her floresan tazminat / varsa, gerekli FMO kontrolü için 1-2 x 10 6 hücreleri çıkarın. fren 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücrelerin geri kalanı.
- 3-6 x 10 7 hücre / ml steril filtre, soğuk FACS tampon maddesi (PBS +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 0.01 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri (1.5 ml santrifüj tüpüne kaldırmak). FACS tampon soğuk olduğundan emin olun ve boyama işlemi boyunca buz üzerinde tutmak.
- tahlil optimize dörtte içine hücre popülasyonu (AD) bölün. zenginleştirme / boyanması özgünlüğünü belirlemek için faiz, kullanım fraksiyonları B ve C antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için fraksiyon A kullanın antijen-spesifik hücrelerin sıklığını ve sayısını belirlemek için, ve kullanım fraksiyon D (2.5 aşağıda 2.6 bakınız) unenriched nüfus verim hesaplama sağlamak ve kat-zenginleştirme için.
- insan FcyR engelleme yeniden ekleBuz üzerinde fraksiyonlar MS madde Fc reseptörlerine antikorların bağlanma önler.
NOT: Uygun koşullar için üreticinin talimatlarına uyun. - çapraz manyetik nano partiküller ile birleşmiş anti-uzak-kırmızı-flüoresan boya antikorları ile reaksiyona girer fluorochromes dahil için dikkatli olmak karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca kısımlar MS ilgi yüzey antijenlerini hücre florokrom-eşlenik antikor ekleyin.
Not: Bu IR-yakını, floresan boya, Cy5 Cy5.5 ve Cy7, antikor eşlenikleri. ilave edilir herhangi bir canlılık lekeleri bir sabitleyici kullanımı ile uyumlu olması gerekmektedir. bir ELISPOT, örneğin, FACS kullanarak hücrelerin analiz, ancak antikor salgılayan sıklığını belirlemek niyetinde değilse, antikorlar ile yüzey boyama gereksizdir. - Testin özelliğini test etmek buz üzerinde 30 dakika için, etiketlenmemiş antijen yeterli miktarda B fraksiyonu inkübe edilmesi, böylece bir afiniteye sahip reseptörlerin çoğunun, en azından10 -6 M engellenir.
Not: Genellikle, iyi bir başlangıç konsantrasyonu antijen miktarının 50-100 kat fazla (örneğin, 50-100 uM) altına 2.6 yeterli kabul edilir. etiketlenmemiş antijen Bu şekilde zenginleştirilmiş hücrelerin özgüllük teyit sağlayan aşağıda adım 2.6 ilave edilir biyotinile antijen bağlanma Bu yüksek afinite ile tüm B hücreleri bloke edilmelidir. Bu adım, önceki aşamada 2.4 ile bağlantılı olarak tamamlanabilir. - 30 dakika boyunca buz üzerinde fraksiyonlar A, B ve D kuluçkalanması biyotinile edilmiş antijen ekleyin.
Not: biyotinlenmiş antijenin konsantrasyonu, yeterli algılama ve spesifik olmayan nötr hücreler hücreleri bağlanma ayrılmasını sağlamak için gerekli uygun miktarını belirlemek için titre edilmelidir. Tipik test etmek için iyi bir başlangıç konsantrasyonu 1-5 uM'dir.
Not: fraksiyonları A ve D, bu aşama, yukarıda adım 2.4 ile eş zamanlı olarak yapılabilir. B fraksiyonu için, bu adım betw aşama 2.5 (yıkamadan sonra yapılmalıdıreen aşama) gereksizdir. - Böyle bir streptavidin uzak-kırmızı-floresan boya ve manyetik boncuklar protokolde diğer reaktifler, B hücrelerinin bağlanmasını belirlemek amacıyla Fraksiyon C biyotinile edilmiş antijen sayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de soğuk FACS 5 x 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml hücre süspansiyonu ile hücreler iki kez yıkanır.
- Son yıkamadan sonra, 5 x 10 7 hücre başına 1 ml% 2 formaldehid konsantre hücre süspansiyonu seyreltilmiş ve 5 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta bekletilir.
NOT: Bu noktada hücrelerin tespiti biotinlenmiş antijen prosedürünün geri kalan BCR için bağlı kalmasını sağlar. canlı hücreler için - örneğin ELISPOTs veya evlat transferlerde olduğu gibi aşağı analiz için, sabitleme adımı atlayabilirsiniz. - 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de iki kez soğuk FACS 5 x 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml hücreleri yıkayın. 1 ml süspanse soğuk FACS 5 x 10 başına tampon7 hücreleri.
- 1-2 ug streptavidin uzak-kırmızı flüoresan boya / ml ilave edilir ve karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Her bir uygulama için streptavidin miktarını titre edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 1 ml soğuk FACS 5 x 10 7 hücre başına tampon ve santrifüj ile hücreler iki kez yıkanır. manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirme uğramaz gibi D fraksiyonunun hazırlanması, bu noktada tamamlandı.
NOT: Bu örnek, örnek frekansı ve antijene özgü B hücre sayısını belirlemek için kullanılır. Bu zenginleşme elde-zenginleştirme kat verim belirlemek ve kullanılacaktır.
3. Manyetik Nanoparçacık tabanlı Zenginleştirme
- 40 um'lik bir filtreden soğuk ayırma tamponu (PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA) 5 x 10 7 hücre başına geçmesi 1 ml numune ac hücreleri tekrar sütun tıkayabilecek herhangi bir yığınının ortadan kaldırmak için.
- Anti-Cy5 / Anti-uzak-kırmızı-floresan boya nanopartiküller ekleyin. foEn iyi sonuçları r, nano-taneciklerinin konsantrasyonu her bir kullanım için titre edilmelidir, ama iyi bir başlangıç noktası, 5 x 10 7 hücre / ml başına 50 ul süspansiyondur. 10 dakika boyunca 4 ° C'de karanlıkta döndürün.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 1 ml soğuk ayırma tamponu ile iki kez yıkanır. 5 x 10 7 hücre başına soğuk ayrılması 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri.
LS veya LD sütunlar kullanma 4. Manyetik Zenginleştirme
- Bir manyetik ayırıcı manyetik alanında üç LS veya LD sütunları yerleştirin ve sütunları ıslak ayırma tampon 3 ml ekleyin (sütun tipi en uygun olduğunu belirlemek için ürün açıklamasına bakınız). 3 ml sütununda geçer ve toplandıktan sonra çıkarmanıza izin verir.
Not: Manyetik nanopartikül işaretli hücrelerin ayrılması ticari olarak temin edilebilir manyetik ayırma cihazların herhangi biri kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak laboratuar TE içinde LS sütun kullanımı ile en başarılı olmuşturverim, saflık ve zenginleştirme verimliliği rms. - sütununun altında, negatif seçilen hücreler için etiketlenmiş üç 15 ml konik tüpler "Fraksiyon A / (B) / (C) negatif", yerleştirin. ilgili kolonuna manyetik parçacık etiketli hücreler ekleyin ve bütün hacim geçmesine izin verir.
- en soğuk ayırma tamponu 3 ml ilave edilir ve bu sütun içinden geçmek ve 2 ml tekrar sağlar. olumsuz seçilen hücreleri toplamak ve buz üzerinde bir kenara koyun.
- manyetik alandan sütunu kaldırmak ve pozitif seçilen hücreler için "Fraksiyon A / (B) / (C) pozitif" etiketli 15 ml konik tüp üstüne yerleştirin.
- sağlanan piston kullanılarak manyetik alana bağlı olan hücreleri toplamak için sütun üzerinden bu hacim dalma hemen ayırma tampon yaklaşık 6 ml üstüne sütun doldurun ve.
- saflığını artırmak için, pozitif seçilen hücreler daha Proce tekrarlayarak, ikinci bir temiz kolonu kullanarak zenginleştirilmiş olabilirdure.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de negatif ve pozitif seçilen kısımlar hem Spin ve arzu edilen nihai hacim içinde askıya. Böyle FACS, ELISPOT veya evlat edinen transferi gibi aşağı analizi ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
saflık, verim analizi ve kat zenginleştirme akış sitometri kullanılarak
kaçınılmaz olarak streptavidin uzak-kırmızı-floresan boya bağlı değil ama matris içinde sıkışıp kalırlar kirletici hücreleri içeren yukarıda tarif edildiği gibi zenginleştirilmiş popülasyonları. Bu yabancı maddeler FACS sıralama tarafından zenginleştirilmiş nüfus kaldırılabilir. zenginleştirilmiş nüfus saflığını tahmin etmek için, canlı hücreler üzerinde kapısı ileriye dayalı ve yan dağılım ve / veya canlı / ölü leke ve uzak-kırmızı-floresan boya + hücre frekansı analiz. Bu ikinci kapı içinde kullanılan yüzde saflığın göstergesidir. Bu hücrelerin özgüllük ve antijen afinite daha fazla analizi, klonlama ve ifade edilen immünoglobulin genlerinin sekanslama ve yeniden birleştirici antikor üretimi ve analiz ve ardından tek hücre FACS gerektirir.
Verim izole antige sayısına değinmektedirbaşlangıç popülasyonu (Kesir D) sayısına göreli bir Kesir ele B hücrelerini n bağlayıcı. aynı sayıda hücre fraksiyonu A olarak fraksiyon D olduğundan, bir doğrudan verim (fraksiyon antijen bağlayıcı B hücrelerinin Fraksiyon D antijen bağlayıcı B hücrelerinin bir ÷ # içinde) belirleyebilir.
Fold-zenginleştirme (E) "olumlu" zenginleştirilmiş Kesir de uzak-kırmızı-floresan boya + B hücrelerinin yüzdesi Bu değer elde antijen-spesifik B hücrelerinde orantılı artışa işaret Kesir D. buna bir akrabası tarafından yansıtılır nanoparçacık zenginleştirme. değeri aşağıdaki denklem kullanılarak bulunabilir:
Bu tekniği göstermek için, bir model olarak tetanoz-toksoid (Tet-Tox) kullanılarak elde temsili sonuçlar göstermektedirantijen tespit etmek ve değişen zaman noktalarında tetanoza karşı aşılanmış kişilerde periferik kan Tet-Tox-reaktif B hücreleri için zenginleştirmek. Şekil 1, yöntemi ve antijen yüzerme şematik bir görünümüdür. Şekil 2a on yıl önce daha fazla tetanoz aşısı son bir kişiden Tet-Tox-reaktif B hücrelerinin frekansı gösterir. Gösterilen etrafında tarafından bağlayıcı hücreleri zenginleştirmek mümkün bu örnekte, Kesir A ve Dolayısıyla Fraksiyon D. Tet-Tox özgü B hücrelerinin bazal frekans nüfuslar ( "negatif") zenginleştirilmiş ( "pozitif") ve tükenmiş olan 7-kat ve zenginleştirilmiş fraksiyon% 4 bir saflık elde edilir.
Şekil 2b 3 yıl önce ~ aşı olmuştu gönüllüden kan kullanılarak reaksiyonun özgünlüğünü göstermektedir. Bu addit önce hücrelere etiketlenmemiş tetanoz toksoid, 50-kat fazla (50 uM) ilave zamanbiyotinile edilmiş antijen (B Fraksiyonu) iyon Bu antijen bağlama spesifikliğini gösteren% 83 bağlanmasını bloke edebiliyoruz. Bu prosedür, (Fraksiyon C) den biyotinile edilmiş antijen, B hücreleri de bağlanmış bir küçük sayıda (~% 0.2) ihmal ne B hücrelerinin bu küçük bir kısmı muhtemelen bu streptavidin uzak-kırmızı-flüoresan boya, bir anti-uzak-kırmızı-fluoresan boya antikoru veya manyetik boncuk gibi yüzerme maddesi olmayan bazı antijene bağlanma yansıtır.
Güçlendirici sonra Şekil 3'te naif, bellekte Tet-Tox özgü B hücrelerinin sıklığı göstermek antijen bağlama hücre fenotipi aşağıdaki aşılama değişiklikleri ve daha önce çekilen kandaki plazmablast popülasyonları ve 7 gün analiz yönteminin kullanımını göstermek için sağlıklı bir konu aşı. Toplam Tet-Tox bağlayıcı B hücreleri arasında naif B hücrelerinin yüzdesi artışı sonrasında% 64% 84 azalırken, Memor yüzdesiToplam Tet Tox-reaktif hücreler arasında y ve plazmablast popülasyonlar sırasıyla% 40% 36 ve% 0% 16 yükselmiştir. Şekil 3b 7 gün sonrası boost sağlıklı denek periferik kandan temsili ELISPOT verileri gösterir. Tet-Tox bağlayıcı B hücrelerinin izole edilmesi tetanos toksoid antikoru salgılayan hücre frekansında 4 katlık bir zenginleşmeye yol açtı.
Şekil 1: algılama ve B hücreleri -bağlayıcı tetanoz toksoid (Tet Tox) zenginleştirilmesi için yöntem. Tet-Tox bağlayıcı B hücrelerinin zenginleştirme ve izolasyonu için (A) Protokolü. Tet-Tox bağlayıcı B hücrelerini belirlemek ve ettirecek kullanılan yüzerme maddesinin (B) Diyagram. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
n-page = "1"> 
Şekil 2: Tet insan periferal kan B hücrelerinin Tox bağlayıcı zenginleştirilmesini gösteren Örnek cytograms. Zenginleştirilmiş (A) Cytograms ve A Fraksiyonu son aşılanmış> 10 yıl önce normal denekten D fraksiyonunun toplam Tet-Tox reaktif B hücreleri ile ilgili tükenmiş Tet Tox reaktif B hücreleri. 50 uM fazlası ile ön inkübasyondan sonra (fraksiyon A) 3 yıl önce ~ aşı gibi zenginleştirilmiş gönüllüden "pozitif" popülasyonlarının PBMC'ler (B) Cytograms Tet-Tox (B Fraksiyonu) etiketlenmemiş veya zenginleştirilmiş prosedür (Kesir C) sırasında atlanmış Tet-Tox-biotin ile. Tüm analizler CD19 + lenfositleri üzerinde kapı bulundu. Yüzdeler son fraksiyonunda tüm B hücreleri (CD19 +) ve Tet-Tox bağlayıcı hücrelerin yüzde temsil etmektedir.ank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: antijen bağlayıcı hücreleri sonrası zenginleştirme analizi örnekleri. Tet-Tox bağlayıcı B hücrelerinin çoğalmasını, aşağıdaki hücre fenotipinde (A) Örnek akış sitometrik analizi. Bellek (CD27 +) ve B hücresi önce konunun alt popülasyonlar ve tetanoza karşı rapel aşılamadan sonra 7 gün içinde plazmablastlar (CD27 ++ CD38 ++) - Cytograms (CD27) Tet-Tox-reaktif naif belirlenmesi ve analiz betimliyor. Tüm hücreler zenginleştirilmiş "olumlu" popülasyonlarında CD19 + lenfositleri üzerinde kapı bulundu. (B) 7 gün bo sonra sağlıklı deneğin periferik kandan zenginleştirilmiş tükenmiş ve toplam unenriched B hücre fraksiyonlarında salgılayan hücrelerin antikor Örnek ELISPOT analiziost. ELISPOT testi, 96 gözlü bir levhanın gözleri birinci tetanoz toksoid, 10 ug / ml solüsyonu ile kaplanmıştır. hücre süspansiyonları iki kat seri seyreltiler zenginleştirilmiş tükenmiş ve toplam unenriched fraksiyonlardan eşit konsantrasyonda hücre ile başlayan (plaka üzerinde) kuyulara yapılmıştır. Anti-tetanoz antikor salgılayan hücreler Streptavidin-AP ve ardından biyotinile edilmiş anti-insan IgG (H & L) ile tespit edildi. Plaka ELISPOT geliştirme tampon maddesi ile geliştirilmiş ve reaksiyon O lineer aralıkta hücre seyreltmede lekelerin sayısı belirlendi iki kez damıtılmış H 2 plaka, üç kez yıkanarak durduruldu ve TSK sayısı hesaplandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada yalıtım ve insan periferal kanından antijen bağlayıcı B hücrelerinin çoğalmasını, gerçekleştirmek için yeni bir metot açıklamaktadır. yöntem, farelere ve dalak ve lenf düğümleri gibi diğer dokuların, kolaylıkla uygulanabilir ve hücre fenotipi ve fonksiyonu (hazırlama yazısı) sonrası zenginleştirme analizi ile uyumludur.
Kullanıcı, bu işlemin başarılı olmasını etkileyebilecek değişkenlerin bir dizi vakıf olmalıdır. deneyim ölü hücreler non-spesifik artan arka plana lider, manyetik boncuk sopa ve Streptavidin-uzak-kırmızı-floresan boya olarak floresan boyalar, "almak" eğilimindedir. Prosedürü başlamadan önce mümkün olduğunca örnekleri gibi birçok ölü hücreleri çıkarmak için kritik öneme sahiptir. analizinden kapısı dışarı ölü hücreleri canlı / ölü ayrımcılığı sağlayacak lekeleri kullanılması yararlı olabilir, ama ölü hücrelerin varlığı hücre frekansı salgılayan antikor testlerinin yorumlanması tehlikeye atabilir veevlatlık transferi Aşağıdaki fonksiyon.
Buna ek olarak, ilave biyotinlenmiş antijenin dikkatli bir titrasyon antijene özgü ve spesifik olmayan bağlanma ayırt için gerekli olduğunu bulduk. Çok fazla antijen yanlış pozitif algılama / zenginleştirme neden olurken çok az antijenin kullanımı olup, antijen bağlayıcı hücrelerinin frekansının düşük tahmin yol açacaktır. Çok yüksek gösterebilir antijen konsantrasyonları Numunelerde olmayan B hücrelerine bağlanma belirgin gösterilebilir. Bundan başka, bir çok yüksek frekans antijenin (>% 1) belirgin saptama reaktif hücre spesifikliği sorunu bağlanabilen bir göstergesi olabilir. Kullanmak için antijen uygun miktarının belirlenmesi nihai amacı, fizyolojik konsantrasyonlardaki örneğin mevcut olandan daha biraz daha fazla antijenin eklemek olduğu <10 -6 M bir afinite, örneğin için B hücresi reseptörlerinin çoğu antijen doymuştur. Bu antijen-spesifik B hücreleri B olmasını sağlarpatojenik potansiyeli olan bir afinite ile tespit Eing. BCRs antijen işgal azalmış veya fizyolojik konsantrasyonlarda aşağıdaki yani çok az antijen eklenmesi nedeniyle çok az bir antijen-özgü B hücrelerinin saptanması neden olabilir. Diğer taraftan, çok fizyolojik konsantrasyonları aşan çok antijenin ek olarak, antijen (> 10 -6 M) için düşük bir afiniteye sahip B hücrelerini içerir ve aslında antijenin habersizdir olan artmış spesifik olmayan bağlanma yol açabilir in vivo. Bu nedenle, ilk tek gerçek antijene reaktif B hücreleri tespit ediliyor emin olmak için birkaç günlükleri arasında biyotinile antijeni titre hayati önem taşımaktadır. Benzer şekilde, arka plan artırabilir çok streptavidin uzak-kırmızı flüoresan boya bu kullanım bulmuştur.
Antijen bu biyotinilasyon antijenik epitopların kullanılabilirliğini etkileyebilir dikkat etmek de önemlidir. Bu nedenle, farklı biyotinilasyonunu kullanarak optimizasyon buluştuhods önemli olabilir. Seçenek olarak biyotin primer aminler, üçüncül aminler, sülfidril, ya da karboksil gruplarına bağlanabilmektedir. genişletilmiş boşluk kol uzunlukları kullanımı sterik engel azaltarak epitop kullanılabilirliğini artırabilir.
Bu tekniğe sınırlamalar biri taze hücrelere kıyasla dondurulan gelen antijen bağlanma B hücrelerinin zenginleştirilmesi için azaltılmış etkinliğidir. Bu daha fazla hücre ölümü ve dondurulmuş numuneler ilişkili "yapışkanlık" ile ilgili olabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, dondurulmuş numuneler uygulanabilir ancak doğrudan taze ve dondurulmuş hücre zenginleştirme ve analiz sonuçları karşılaştırmak için muhtemelen çok önemlidir. Diğer bir sınırlama, zenginleştirilmiş örneğinde antijen spesifik B hücreleri saflığı. deneyim, bazı hücreler her zaman vardır "boyunca etiket", hangi spesifik olmayan B hücreleri ve T hücrelerini içerir. Bu ettirecek çalışıyor hücre nüfusunun nadir verilen beklenebilir. t Ancak, saflıkO hücreleri ya da antijene özgü B hücreleri sıralama FACS ile tek bir hücre süspansiyonu, yeni bir sütun üzerinde bir kez zenginleştirici, sütun hücrelerinin eklenmesinden önce elde edilen sağlayarak artış olabilir. Çalışmanın türüne bağlı olarak, isteğe bağlı karar verebilir araştırmacı iyi olup olmadığını gereklidir.
Biz bu tekniği optimize olarak biz antijen titrasyonu veya boyama yoğunluğuna dayalı düşük afinite antijen-reaktif hücreler karşı yüksek afinite ayrımcılığa yatkın olacağını tasavvur. Kendi antijene afinite 1.000 kat fark kadar eşit bu yöntemi 7 kullanılarak zenginleştirildi ile Ancak, bir önceki çalışmada, biz antijene reaktif B hücreleri gösterdi. Afinitesi bilgisi çalışmaya uygun bir ifadeyle, eğer eksprese edilen rekombinant antijen reseptörlerinin yüzey plazmon rezonans analizi kullanılarak zenginleştirilmiş hücrelerin afinite resmi ölçümü gereklidir.
Bu teknikte doğasında lbiyotinlenmiş antijen ve streptavidin eklenmesi BCR çapraz bağlayarak hücrelerini taklidin. Bu tür bir dinlenme kontrol uyarılmış hücreleri karşılaştırmak için aradığı gibi belirli aşağı fonksiyonel deneyleri için bir sorun teşkil edebilir. Bu sorun sinyallerin iletimini önlemek için, soğuk kontrol numuneleri tutarak hafifletilebilir. BCR sinyalleri devam eden biyolojik tepki etkileyebilecek olması da mümkündür. In vitro olarak T hücrelerine antijen sunan hücrelerin gibi farelere adoptif transfer edildikten sonra ELISPOT analizi (Şekil 3b) ve fonksiyon ile gösterildiği üzere deneyim antijen zenginleştirilmiş hücrelerin (veriler gösterilmemiştir), antikor salgılama yeteneği muhafaza. Bu tekniğe son bir sınırlama anti-fluorochome antikorların kullanımı antijeni adsorbe hücrelere bağlanmasını nanoparçacık başarmak etmektir. Anti-uzak-kırmızı-fluoresan boya Cy7 ve Cy5.5 dahil olmak üzere belirli yapısal olarak ilişkili florokromlar ile çapraz reaksiyona girer. Bu o seçenekleri sınırlayabilirfenotipik işaretleyiciler ölçümü için uygun ön antikor konjügatları. Ancak, yeni fluorochromes artan kullanılabilirliği ile, bu daha az sorun haline gelmektedir.
Bu algılama ve zenginleştirme yöntemi kullanarak, kolayca ex vivo çevresel kan, dalak ve diğer dokularda antijen bağlayıcı B hücreleri tespit etmek mümkündür. Bu yöntem, yabancı antijenlere ve otoimmün hastalığın ortamda aşılama veya maruz kaldıktan sonra antijene reaktif hücrelerin bağışıklık tepkisinin incelenmesi özellikle yararlıdır. antijene reaktif B hücreleri tespit etmek için herhangi bir yöntem, hatasız olduğu kanıtlanmış olmakla birlikte, bu yöntem, hızlı, basit ve alt çeşitli bağlanabilir antijene reaktif hücrelerin nispeten yüksek bir saflık, verim, bir zenginleşme üretirse tahlilleri. Buna ek olarak, yöntemin temel ilkelerine bağlı, bu prosedür kolaylıkla deneysel çok çeşitli ihtiyaçları için özel olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
