Summary
Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.
Introduction
Diluizione limite analisi di frequenza precursore cellule che secernono anticorpi hanno suggerito che le cellule B reattive ad un particolare antigene tipicamente si verificano ad una frequenza da 0,05 a 0,005% nel repertorio normale, a seconda dello stato di vaccinazione e dimensione / numero di epitopi presenti sul antigene. La bassa frequenza di queste cellule ha reso difficile per studiare i cambiamenti della loro situazione durante lo sviluppo di risposte immunitarie, ad esempio dopo la vaccinazione o l'esposizione ad un antigene estraneo, o durante lo sviluppo di autoimmunità. In precedenza, i ricercatori hanno intrapreso isolamento delle cellule B antigene-reattiva utilizzando tecniche che variano da piastre rivestite con antigene o adsorbenti colonne, per l'antigene rivestite riarmo globuli rossi, alla cella di smistamento 1, 2, 3, 4, 5, 6 fluorescenza attivato. though queste tecniche sono riusciti ad identificare e isolare cellule B antigene-reattiva, i risultati hanno variato in termini di resa, purezza e scalabilità. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per rilevare sia e arricchire rari sottopopolazioni di linfociti B utilizzando nanoparticelle magnetiche. Il metodo consente di arricchimento relativamente elevata resa e purezza da grandi popolazioni di partenza, ed è compatibile con l'analisi di risposte alla antigene. Arricchendo da popolazioni di cellule in sospensione, il metodo elimina vincoli associati con la geometria delle lastre o colonne antigene rivestite e produttività limite. Infine, poiché le cellule arricchiti rimangono associate antigene e un reporter fluorescente, possono essere ulteriormente purificati mediante FACS ordinamento. Come descritto qui abbiamo usato questo approccio per lo studio delle cellule B periferiche tetano sangue tetanico-reattiva, prima e dopo l'immunizzazione di soggetti umani, così come le cellule B autoantigenici-reattiva da soggetti con varie autoidisturbi mmune, tra cui diabete di tipo 1, malattia di Graves ', e la malattia di Hashimoto 7. Il metodo funziona ugualmente bene in topo e umano, ed è compatibile con l'analisi di cellule B antigene-reattiva da una varietà di tessuti (manoscritto in preparazione).
Nel suo formato di base, cellule mononucleate del sangue periferico vengono prima incubate con l'antigene biotinilato con anticorpi di cella antigeni di superficie richiesti per l'analisi fenotipica. Questa fase di etichettatura è seguita da lavaggio e fissaggio, e l'aggiunta di streptavidina accoppiata al colorante rosso lontano fluorescente per il rilevamento della cellule vincolante biotinilato-antigene (Figura 1). Precedenti studi hanno identificato cellule B antigene-specifiche in modo simile, ma utilizzando antigeni direttamente coniugato ad un fluorocromo 8, 9, 10, 11. Anche se questo è un degnoapproccio, l'uso di antigeni biotinilati in combinazione con streptavidina consente una maggiore amplificazione del segnale (quindi una migliore differenziazione delle cellule vincolanti e non vincolanti), in particolare quando gli antigeni sono piccole 12, 13, 14. Un'ulteriore considerazione è l'uso di streptavidina invece di avidina perché streptavidina è deglicosilata, diminuendo legame non specifico. Inoltre, usiamo colorante far-rosso fluorescente come il fluorocromo a causa della sua fotostabilità, rendimento quantico (luminosità), e le sue piccole dimensioni (~ 1,3 KD). Fluorocromi proteine come ficoeritrina (~ 250 kD) e allophycocyanin (~ 105 kD) 15 non sono ottimali perché contengono potenzialmente molti epitopi antigenici. Uso di un piccolo colorante fluorescente biologico composto di un singolo epitopo, come colorante rosso lontano fluorescente, riduce la complessità della popolazione di cellule isolate.
Una volta che le cellule sono biotinilati-antigen e adsorbito lontano-rosso-colorante fluorescente-streptavidina, sono arricchiti con anti-far-rosso-fluorescenti nanoparticelle magnetiche colorante coniugato. Nanoparticelle singole non vengono rilevati dalla maggior parte dei citometri a flusso e quindi non devono essere rimossi prima di purificazione per FACS ordinamento e saggi a valle 16. Selezione magnetico per cellule B antigene-specifiche arricchisce la popolazione di interesse, eliminando i tempi ei costi di classificare gli eventi rari usando un citometro a flusso.
Qui di seguito vi mostriamo i risultati rappresentativi di arricchimento delle cellule B-specifici tetano-tetanico un soggetto prima e sette giorni dopo tetano richiamo di immunizzazione. Abbiamo scelto questa particolare applicazione come esempio per dimostrare la capacità di questo metodo per arricchire cellule B antigene-specifiche seguenti acuta nella stimolazione vivo. Una volta accoppiato con citometria a flusso, questo metodo è in grado di arricchire e differenziare antigene-specifica naive, la memoria, ecellule plasmablast B e consente al ricercatore di seguire i cambiamenti nella loro frequenza nel corso del tempo. Inoltre, includiamo un'altra possibile test a valle, ad esempio, un saggio ELISPOT, il che dimostra che le cellule mantengono la capacità di secernere anticorpi a seguito di arricchimento. Un'altra applicazione di questo metodo potrebbe comportare il trasferimento adottivo di cellule arricchite in un ospite. Abbiamo precedentemente dimostrato cellule mantengono la capacità di agire come cellule presentanti l'antigene alle cellule T antigene-specifiche seguenti isolamento e di trasferimento (dati non riportati). Quindi, ci sono una serie di possibili saggi a valle che potrebbero essere accoppiati al metodo, che informa insieme la comprensione della risposta immunitaria antigene-specifica. Abbiamo descritto il metodo di seguito, inclusi i controlli per determinare la resa complessiva, la purezza, la specificità delle cellule, e piegare-arricchimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolamento di PBMC umani
- Raccogliere 30-50 ml di sangue utilizzando provette per il prelievo del sangue eparinizzate.
NOTA: La quantità di sangue usato dipende dalla particolare domanda sperimentale e la frequenza nel sangue di cellule B antigene-specifiche di interesse. sangue eparinizzato può essere lavorato immediatamente o cullò dolcemente notte a temperatura ambiente per l'elaborazione del giorno successivo. Il ritardo nell'elaborazione ha poco effetto sulla efficienza di arricchimento ed è associata con una minima perdita di vitalità. - Mescolare sangue intero 1: 1 con una soluzione sterile, magnesio temperatura ambiente e calcio libero tampone fosfato salino (PBS).
- In un tubo da 50 ml sterile, aggiungere 10 ml di soluzione di gradiente di densità temperatura ambiente. Conservare le bottiglie gradiente di densità aperte al buio a 4 ° C, ma caldo a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Se possibile impostare la pistola pipetta all'impostazione lento e / o applicare molto poco, ma omogeneo, pressione trigger lentamentestrato 30-35 ml di sangue diluito in cima al gradiente di densità, facendo attenzione a non mescolare i due.
NOTA: Posizionare la punta della pipetta contro il bordo dei 50 ml conica, mentre l'aggiunta del sangue diluito contribuirà a garantire un flusso costante coerente. - Centrifugare a 400 xg per 30 min a 20 ° C con il freno disattivato.
- Rimuovere lo strato superiore, che contiene plasma e piastrine, facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule mononucleate di seguito.
- Usando una pipetta sterile, raccogliere lo strato di cellule mononucleate (buffy coat) e posto in una sterile tubo da 50 ml a parte.
- Aggiungere PBS alla sospensione cellulare ad un volume di 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a 20 ° C con freno.
- Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule pellet in 10 ml di PBS. Contare le celle e determinare la vitalità usando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
- Risospendere le cellule a 10 7 cellule / ml e posto su ghiaccio fino al momento per ulteriori elaborazioni.
2. colorazione delle cellule
- Rimuovere 1-2 x 10 6 cellule per ogni compensazione della fluorescenza / controllo FMO necessario, se applicabile. restante Centrifugare delle cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
- Risospendere le cellule in sterile filtrata, tampone freddo FACS (PBS + 1% di albumina sierica bovina (BSA) + 0,01% di sodio azide) a 3-6 x 10 7 cellule / ml (rimuovono in una provetta da 1,5 ml centrifuga). Assicurarsi che il buffer di FACS è freddo e tenerlo in ghiaccio per tutta la procedura di colorazione.
- Dividere la popolazione di cellule in quarti (AD), quando l'ottimizzazione del dosaggio. Utilizzare frazione A arricchire cellule B antigene-specifiche di interesse, usare le frazioni B e C per determinare la specificità di arricchimento / colorazione (vedi 2.5 e 2.6), e l'uso frazione D per determinare la frequenza e il numero di cellule antigene-specifiche in la popolazione non arricchito per consentire il calcolo del rendimento e piega-arricchimento.
- Aggiungere FcγR blocco re umanoagente per le frazioni dC sul ghiaccio per evitare il legame degli anticorpi ai recettori Fc.
NOTA: Seguire le istruzioni del produttore per le condizioni appropriate. - Aggiungere gli anticorpi coniugati a fluorocromi alla cella antigeni di superficie di interesse per le frazioni dC per 30 min in ghiaccio al buio, facendo attenzione a non includere fluorocromi che possono attraversare reagire con gli anticorpi anti-dye far-rosso-fluorescenti accoppiate a nanoparticelle magnetiche.
NOTA: Questi includono anticorpi coniugati a colorante fluorescente vicino IR, Cy5, Cy5.5, e Cy7. Eventuali macchie di vitalità che vengono aggiunti devono essere compatibili con l'uso di un fissativo. Se non si intende analizzare le cellule utilizzando FACS, ma determinano la frequenza secernono anticorpi, per esempio, da ELISPOT, colorazione della superficie con anticorpi è inutile. - Per verificare la specificità del test, incubare Frazione B con sufficiente quantità di antigene non marcato per 30 min in ghiaccio, tale che la maggior parte dei recettori con un'affinità di almeno10 -6 M sono bloccate.
NOTA: in genere, una buona concentrazione di partenza è un 50-100 volte superiore alla quantità di antigene considerato sufficiente a 2.6 (ad esempio 50-100 micron). Questo dovrebbe bloccare le cellule B con una elevata affinità per l'antigene non marcato di legarsi all'antigene biotinilato, che viene aggiunto nel passaggio 2.6, consentendo così la conferma della specificità delle cellule arricchito. Questo passaggio può essere completato in combinazione con al punto 2.4. - Aggiungere antigene biotinilato a frazioni A, B, e D. Incubare in ghiaccio per 30 min.
NOTA: concentrazione dell'antigene biotinilato deve essere titolata per determinare la quantità ottimale necessaria per garantire un'adeguata individuazione e la separazione delle cellule vincolante da cellule bystander non specifici. In genere una buona concentrazione di partenza per test è 1-5 micron.
NOTA: per frazioni A e D, questo passo può essere eseguito contemporaneamente al precedente punto 2.4. Per Frazione B, questo passo dovrebbe essere fatto dopo passo 2.5 (lavaggio in betwpassi een non è necessaria). - Omettere antigene biotinilato dalla frazione C, al fine di determinare l'eventuale legame di cellule B ad altri reagenti nel protocollo, come streptavidina tintura far-rosso fluorescente e le sfere magnetiche.
- Lavare le cellule due volte da sospensione di cellule in 1 ml di tampone FACS per 5 x 10 7 cellule e centrifugazione a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Dopo l'ultimo lavaggio, diluire sospensione di cellule concentrato in 1 ml di 2% di formaldeide per 5 x 10 7 cellule e lasciate riposare nel buio in ghiaccio per 5 min.
NOTA: Fixation delle celle a questo punto assicura che l'antigene biotinilato rimane vincolato alla BCR per il restante della procedura. Per le cellule vitali - per l'analisi a valle, come ad esempio in ELISPOTs o trasferimenti adottivi, omettere il passo di fissaggio. - Lavare le cellule due volte con 1 ml di tampone FACS per 5 x 10 7 cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere in 1 ml FACS freddi tampone per 5 x 107 cellule.
- Aggiungere colorante 1-2 mg streptavidina-far-rosso fluorescente / ml e incubare su ghiaccio per 20 minuti al buio. Titolare la quantità di streptavidina per ogni applicazione.
- Lavare le cellule due volte con 1 ml di tampone freddo FACS per 5 x 10 7 cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. preparazione Frazione D è completato a questo punto come non subirà arricchimento con le biglie magnetiche.
NOTA: Questo esempio verrà utilizzato per determinare la frequenza e il numero di cellule B antigene-specifiche nel campione. Questo verrà utilizzato per determinare la resa e piegare-arricchimento raggiunti da arricchimento.
3. Arricchimento nanoparticelle a base di Magnetic
- Risospendere le cellule da campioni AC in 1 ml di tampone a freddo di separazione (PBS + 0,5% BSA + 2mM EDTA) per 5 x 10 7 cellule e passare attraverso un filtro 40 micron per eliminare eventuali grumi che potrebbero ostruire la colonna.
- Aggiungere Anti-Cy5 / Anti-far-rosso-fluorescenti nanoparticelle colorante. for risultati ottimali, la concentrazione di nanoparticelle deve essere titolata per ogni uso, ma un buon punto di partenza è 50 sospensione pl per 5 x 10 7 cellule / ml. Ruotare al buio a 4 ° C per 10 min.
- Lavare due volte con 1 ml di tampone di separazione freddo a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di separazione freddo per 5 x 10 7 cellule.
4. Arricchimento magnetica Utilizzando LS o colonne LD
- Inserire tre LS o colonne LD nel campo magnetico di un separatore magnetico e aggiungere 3 ml di tampone di separazione per bagnare le colonne (vedi descrizione prodotto per determinare quale tipo di colonna è più adatto). Consentire a tutti i 3 ml di passare attraverso la colonna e scartare dopo la raccolta.
NOTA: Sebbene la separazione delle cellule nanoparticelle magnetiche marcato può essere realizzato utilizzando uno qualsiasi dei dispositivi di separazione magnetica che sono disponibili in commercio, il laboratorio ha avuto più successo con l'uso di colonne LS, in terms di rendimento, la purezza e l'efficienza di arricchimento. - Posizionare i tubi tre 15 ml coniche con l'etichetta "Frazione A / (B) / (C) negativo", per le celle selezionate negativamente, sotto la colonna. Aggiungere la particella magnetica cellule marcate alla loro rispettiva colonna e consentire l'intero volume di passare attraverso.
- Aggiungere 3 ml di tampone di separazione freddo sulla parte superiore, e permettere questo di passare attraverso la colonna e ripetere con 2 ml. Raccogliere le cellule negativamente selezionati e mettere da parte in ghiaccio.
- Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionare su di un tubo da 15 ml etichettata "Frazione A / (B) / (C) positivo", per le celle selezionate positivamente.
- Riempire la colonna all'inizio con circa 6 ml di tampone di separazione e subito immergere questo volume attraverso la colonna per raccogliere le cellule che erano legati al campo magnetico usando lo stantuffo disponibile.
- Per aumentare la purezza, le celle selezionate positivamente possono essere ulteriormente arricchito con una seconda colonna pulita, ripetendo il proceDure.
- Spin entrambe le frazioni negativamente e positivamente selezionate a 400 xg per 10 min a 4 ° C e sospendere in volume finale desiderato. Procedere con l'analisi a valle, come ad esempio FACS, ELISPOT o trasferimento adottivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analisi di purezza, la resa, e piegare-arricchimento mediante citometria a flusso
Popolazioni arricchite come sopra descritto inevitabilmente contenere cellule contaminanti che non sono legate colorante streptavidina far-rosso fluorescente, ma sono intrappolati nella matrice. Queste impurità possono essere rimossi da popolazioni arricchito da FACS ordinamento. Per stimare la purezza delle popolazioni arricchiti, cancello su cellule viventi basata su avanti e scatter laterale e / o macchia live / morti e analizzare colorante + cella frequenza di gran lunga-rosso fluorescente. La percentuale all'interno di quest'ultima cancello è indicativa di purezza. Ulteriori analisi della specificità e affinità antigene di queste cellule richiede FACS ordinamento di singole cellule, seguito da clonazione e sequenziamento dei geni espressi immunoglobuline e la produzione di anticorpi ricombinanti e di analisi.
Resa si riferisce al numero di antige isolatocellule B recuperati in Frazione n-binding A rispetto al numero nella popolazione iniziale (Frazione D). Poiché lo stesso numero di cellule erano in Frazione D come Frazione A, si può determinare direttamente la resa (# di cellule B antigene vincolante in Frazione A ÷ # di cellule B antigene vincolante in Frazione D).
Pieghevole arricchimento (E) si riflette la percentuale di cellule colorante + B lontano-rosso fluorescente nella Frazione "positivo" arricchito A rispetto a quello in Frazione D. Questo valore indica l'aumento proporzionale nelle cellule B antigene-specifici ottenuti dal nanoparticelle arricchimento. Il valore può essere trovato utilizzando la seguente equazione:
Per dimostrare questa tecnica, ci mostra risultati rappresentativi ottenuti con tetano-tetanico (Tet-Tox) come modelloantigene di rilevare e arricchire per le cellule B Tet-Tox-reattiva nel sangue periferico di soggetti che sono stati vaccinati contro il tetano a diversi intervalli di tempo. La figura 1 è uno schema del metodo e l'adsorbente antigene. La Figura 2a mostra la frequenza delle cellule B Tet-Tox-reattivi da un individuo che era ultima vaccinati contro il tetano più di un decennio fa. Vengono mostrati il arricchito ( "positivo") e impoverito ( "negativo") le popolazioni di Frazione A e la frequenza di base delle cellule B Tet-Tox-specifici da Frazione D. Quindi, in questo esempio, siamo in grado di arricchire le cellule vincolanti di circa 7 volte e raggiunto una purezza del 4% nella frazione arricchita.
La Figura 2b mostra la specificità della reazione con il sangue da un soggetto che erano stati vaccinati ~ 3 anni prima. Quando abbiamo aggiunto un eccesso di 50 volte (50 micron) di non marcato tetano-tetanico alle cellule prima additioni dell'antigene biotinilato (Frazione B) siamo in grado di bloccare vincolante dell'83%, dimostrando la specificità di antigene vincolante. Quando abbiamo omesso l'antigene biotinilato dalla procedura (Frazione C), un piccolo numero (~ 0,2%) delle cellule B ancora legato; questa piccola frazione di cellule B presumibilmente riflette legame alcuni non-antigene nel adsorbente, come la streptavidina-far-red-colorante fluorescente, l'anticorpo anti-colorante rosso lontano fluorescente o le perline magnetiche.
Per dimostrare l'uso del metodo per analizzare i cambiamenti in Antigen vincolante fenotipo delle cellule a seguito di immunizzazione illustra la Figura 3 la frequenza delle cellule B Tet-Tox-specifici nella ingenua, la memoria, e le popolazioni plasmablast nel sangue disegnate prima e 7 giorni dopo richiamo la vaccinazione di un soggetto sano. Mentre la percentuale di cellule B naive tra cellule totali Tet-Tox vincolanti B è diminuita dal 84% al 64% dopo spinta, la percentuale di memorpopolazioni Y e plasmablast rispetto al totale delle cellule Tet Tox-reattive sono aumentati dal 16% al 36% e 0% al 40%, rispettivamente. La figura 3b mostra i dati rappresentativi ELISPOT da sangue periferico dei 7 giorni successivi alla spinta soggetto sano. L'isolamento delle cellule Tet-Tox vincolanti B ha portato ad un arricchimento di 4 volte della tossina del tetano anticorpi frequenza secernono-cellule.
Figura 1: Metodo di rilevamento e l'arricchimento di tetano (Tet Tox) -di legame cellule B. (A) Protocollo per l'arricchimento e l'isolamento di cellule Tet-Tox vincolanti B. (B) Schema di adsorbente per l'identificazione e arricchire le cellule Tet-Tox vincolanti B. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
n-page = "1"> 
Figura 2: citogrammi rappresentativi che dimostrano l'arricchimento del Tet Tox vincolante cellule B da sangue periferico umano. (A) citogrammi di arricchito e impoverito cellule B Tet Tox-reattiva Frazione A e cellule B Tet-Tox-reattiva totale da Frazione D da un soggetto normale ultimi vaccinati> 10 anni prima. (B) citogrammi dei PBMC dalle popolazioni "positivi" da un soggetto vaccinato ~ 3 anni prima e arricchita come in A (Frazione A), dopo il pre-incubazione con un eccesso di 50 um senza etichetta Tet-Tox (Frazione B), o arricchito con Tet-Tox-biotina omesso durante la procedura (Frazione C). Tutte le analisi sono state gated sul CD19 + linfociti. Le percentuali rappresentano la percentuale di cellule Tet-Tox vincolanti di tutte le cellule B (CD19 +) nella frazione finale.ank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di analisi post-arricchimento di cellule antigene vincolante. (A) Rappresentante analisi di citometria di flusso del fenotipo delle cellule dopo l'arricchimento di cellule Tet-Tox vincolanti B. Citogrammi raffigurano l'identificazione e l'analisi di ingenuo Tet-Tox-reattiva (CD27 -), memoria (CD27 +), e plasmablasts (CD27 ++ CD38 ++) in sottopopolazioni di cellule B di un soggetto prima e 7 giorni dopo la vaccinazione di richiamo contro il tetano. Tutte le cellule sono state gated sul CD19 + linfociti dalle popolazioni arricchite "positivi". (B) Analisi Rappresentante ELISPOT di anticorpo che secernono le cellule arricchite, impoverito, e le frazioni totale delle cellule B non modificate dal sangue periferico di un soggetto sano 7 giorni dopo boost. Per il saggio ELISPOT, pozzetti di una piastra da 96 pozzetti sono stati rivestiti con una soluzione / ml 10 mg di tossoide tetanico-. diluizioni seriali duplice sospensioni cellulari sono state effettuate in pozzi (attraverso la piastra) a partire con le cellule a parità di concentrazione dalle arricchiti, impoverito, e totali frazioni non modificate. Anti-tetano cellule secernenti anticorpi sono stati rilevati con biotinilato anti-IgG umane (H & L), seguita da streptavidina-AP. La piastra è stata sviluppata con tampone sviluppo ELISPOT e la reazione è stata interrotta mediante lavaggio della piastra di tre volte con bidistillata H 2 O. Il numero di punti in una diluizione cella nell'intervallo lineare è stato determinato, ed è stato calcolato il numero di ASC. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui si descrive un nuovo metodo per realizzare l'isolamento e arricchimento delle cellule B antigene vincolante da sangue periferico umano. Il metodo è facilmente applicabile a topi e ad altri tessuti, come i milza e nei linfonodi, ed è compatibile con l'analisi post-arricchimento del fenotipo cellulare e funzione (manoscritto in preparazione).
L'utente deve essere a conoscenza di un certo numero di variabili che possono influenzare il successo di questa procedura. Per esperienza le cellule morte tendono ad attaccarsi alle sfere magnetiche e "prendere" coloranti fluorescenti, come la tintura Streptavidina-far-rosso fluorescente, che porta a non specifico maggiore di fondo. E 'fondamentale per rimuovere il maggior numero di cellule morte da campioni come possibile prima di iniziare questa procedura. L'uso di macchie che consentono vivo discriminazione / morti per escludere le cellule morte dalla analisi può essere utile, ma la presenza di cellule morte può compromettere l'interpretazione dei dosaggi di anticorpi che secernono la frequenza delle cellule eseguente funzione di trasferimento adottivo.
Inoltre, abbiamo scoperto che un'attenta titolazione dell'antigene biotinilato aggiunto è essenziale per distinguere antigene-specifica e legame non specifico. L'utilizzo di troppo poco antigene porterà alla sottostima della frequenza di cellule antigene-binding, mentre troppo antigene può causare falsi positivi rilevamento / arricchimento. L'uso di concentrazioni di antigene che sono troppo elevata può può essere indicata da apparente legame alle cellule non-B nei campioni. Inoltre, il rilevamento apparente di una frequenza troppo elevata (> 1%) di antigene cellule reattive può essere un'indicazione di legare problema specificità. L'obiettivo finale per determinare la quantità ottimale di antigene da utilizzare è quello di aggiungere un po 'più di antigene è presente a concentrazioni fisiologiche, tale che la maggior parte dei recettori delle cellule B con un'affinità di <10 -6 M, per esempio, per l'antigene sono saturi. Questo assicura che le cellule B antigene-specifiche sono being rilevato con un'affinità che ha un potenziale patogeno. L'aggiunta di troppo poco antigene, cioè pari o inferiore a concentrazioni fisiologiche, può portare a rilevazione di pochissime cellule B antigene-specifiche a causa di una diminuzione antigene occupazione delle BCRs. D'altra parte, l'aggiunta di troppo antigene, superando di gran lunga concentrazioni fisiologiche, può portare ad un aumento non specifico vincolante che includono cellule B con una bassa affinità per l'antigene (> 10 -6 M) e sono in realtà ignorano dell'antigene in vivo. Quindi, è di vitale importanza per titolare prima l'antigene biotinilato attraverso alcuni tronchi in modo da essere sicuri che solo i veri cellule B antigene-reattiva vengono rilevati. Analogamente, abbiamo trovato che l'uso di troppa dye streptavidina-far-rosso fluorescente può aumentare background.
E 'anche importante notare che biotinilazione di antigene può influenzare la disponibilità di epitopi antigenici. Quindi, l'ottimizzazione usando biotinilazione diverso incontratohods possono essere importanti. Alternativamente biotina può essere accoppiato alle ammine primarie, ammine terziarie, sulfidrili, o gruppi carbossilici. L'utilizzo di lunghezze del braccio distanziatori prolungati può migliorare la disponibilità epitopi riducendo sterico.
Uno dei limiti di questa tecnica è la sua efficacia ridotta per l'arricchimento delle cellule B antigene vincolante da crioconservati rispetto alle cellule fresche. Questo potrebbe riguardare una maggiore morte cellulare e associati "viscosità" di campioni congelati. Tuttavia, il metodo può essere applicato a campioni congelati ma probabilmente è importante non confrontare direttamente i risultati di arricchimento e l'analisi di cellule fresche e congelati. Un'altra limitazione è la purezza delle cellule B antigene-specifiche nel campione arricchito. Per esperienza, ci sono sempre alcune cellule che "tag along", che comprende sia le cellule B non-specifici e cellule T. Questo è da aspettarselo data la rarità della popolazione di cellule su sta cercando di arricchire. Tuttavia, la purezza di tlui cellule possono essere aumento assicurando che una singola sospensione cellulare viene ottenuta prima di aggiungere le cellule alla colonna, arricchendo una seconda volta su una nuova colonna, o FACS ordinamento delle cellule B antigene-specifiche. A seconda del tipo di studio, il ricercatore può decidere quale opzione è migliore e se è necessario.
Come abbiamo ottimizzato questa tecnica abbiamo immaginato che sarebbe suscettibile di discriminazione di alta affinità contro le cellule antigene-reattiva bassa affinità basate su titolazione antigene o l'intensità di colorazione. Tuttavia, in uno studio precedente, abbiamo mostrato cellule B antigene-reattiva fino a una differenza di 1000 volte in affinità al loro antigene erano ugualmente arricchito con questo metodo 7. Quindi, la misurazione convenzionale dell'affinità delle cellule arricchite con superficie analisi risonanza plasmonica di recettori antigeni ricombinanti espressi è necessaria se la conoscenza dell'affinità è pertinente allo studio.
Inerente a questa tecnica è la limitazione che aggiunta di antigene biotinilato e streptavidina può attivare le cellule mediante reticolazione BCR. Questo potrebbe rappresentare un problema per particolari test funzionali a valle, come quelli che cercano di confrontare cellule stimolate a un controllo di riposo. Questo problema può essere attenuato mantenendo campioni di controllo fredde per impedire trasduzione di segnali. E 'anche possibile che i segnali BCR potrebbero influenzare una risposta biologica corso. Dall'esperienza cellule antigene-arricchita mantengono la loro capacità di secernere anticorpi, come indicato da analisi ELISPOT (Figura 3b) e funzionare come cellule presentanti l'antigene alle cellule T in vitro e dopo trasferimento adottivo in topi (dati non mostrati). Un ultimo limite di questa tecnica è l'uso di anticorpi anti-fluorochome per realizzare nanoparticelle legarsi alle cellule antigene adsorbito. Anti-dye far-rosso fluorescente cross-reagisce con alcuni fluorocromi strutturalmente affini, tra cui Cy7 e Cy5.5. Questo può limitare le opzioni oconiugati anticorpo f disponibili per la misurazione di marcatori fenotipici. Tuttavia, con una maggiore disponibilità di nuovi fluorocromi, questo sta diventando un problema minore.
Usando questo metodo di rilevamento e arricchimento, è possibile identificare facilmente cellule B antigene vincolante in ex vivo sangue periferico, milza, o di altri tessuti. Questo metodo è particolarmente utile nello studio della risposta immunitaria di cellule reattive antigene seguito di immunizzazione o di esposizione agli antigeni estranei e nel contesto della malattia autoimmune. Sebbene nessun metodo per rilevare le cellule B antigene-reattiva è dimostrata priva di difetti, questo metodo è veloce, semplice, e produce una relativamente elevata purezza, rendimento e arricchimento delle cellule antigene-reattivo che può essere accoppiato ad una varietà di downstream saggi. Inoltre, a causa dei principi fondamentali del metodo, questa procedura potrebbe facilmente essere adattato alle diverse esigenze sperimentali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA) | |||
| 50 ml conical tubes | |||
| 15 ml conical tubes | |||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
