Summary
Deux algorithmes d'analyse d'images, « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été créés, pour quantifier automatiquement neuf caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire drosophile (NMJ).
Abstract
morphologie synaptique est étroitement liée à l'efficacité synaptique, et dans de nombreux cas des défauts synaptiques morphologiques conduisent finalement à un mauvais fonctionnement synaptique. La jonction neuromusculaire des larves de drosophile (NMJ), un modèle bien établi pour synapses glutamatergiques, a été largement étudié depuis des décennies. L'identification de mutations provoquant des défauts morphologiques NMJ a révélé un répertoire de gènes qui régulent le développement des synapses et de la fonction. Un grand nombre d' entre eux ont été identifiés dans des études à grande échelle axés sur des approches qualitatives pour détecter des anomalies morphologiques du NMJ drosophile. Un inconvénient des analyses qualitatives est que de nombreux acteurs subtils qui contribuent à la morphologie NMJ restent probablement inaperçues. Alors que les analyses quantitatives sont nécessaires pour détecter les différences morphologiques plus subtiles, ces analyses ne sont pas encore courante, car ils sont laborieux. Ce protocole décrit en détail deux algorithmes d'analyse d'image "drosophile drosophile NMJ Bouton Morphometrics », disponible sous forme de macros Fidji compatibles, pour l' analyse morphométrique quantitative, précise et objective de la NMJ drosophile. Cette méthodologie est développée pour analyser les terminaux NMJ immunomarquées avec les marqueurs couramment utilisés Dlg-1 et . Brp de plus, son application plus large à d'autres marqueurs tels que Hrp, Csp et Syt est présenté dans ce protocole Les macros sont en mesure d'évaluer neuf caractéristiques NMJ morphologiques:. zone NMJ, périmètre NMJ, le nombre de boutons, longueur NMJ, NMJ branche la plus longue longueur, le nombre d'îles, le nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives dans le terminal NMJ.
Introduction
Les troubles cognitifs tels que la déficience intellectuelle, troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont souvent caractérisées par la fonction synaptique anormale 1, 2, 3. la morphologie et la fonction des synapses sont étroitement imbriquées; défauts morphologiques peuvent provoquer un dysfonctionnement synaptique et, inversement, la transmission synaptique aberrante aura un impact sur la maturation synaptique et de la morphologie 4, 5, 6.
Un certain nombre d'organismes modèles ont été utilisés afin de mieux comprendre la biologie des synapses et faire la lumière sur la façon dont les changements affectent synaptiques le fonctionnement du cerveau dans la santé et la maladie 7, 8, 9. Le NMJ Drosophila est un largement étudiée et bien établie dans le modèle in vivo pour glutamatergique synapse biologie 10, 11. Au cours des dernières décennies, ce modèle a été utilisé pour des études physiologiques et génétiques concentré, ainsi que pour les écrans génétiques à grande échelle, dans le but de détecter des différences morphologiques entre NMJs. En particulier, les écrans génétiques avant ont identifié de nombreux organismes de réglementation et des mécanismes sous - jacents cruciaux le développement des synapses et la fonction 12, 13, 14, 15, 16. Cependant, la plupart de ces écrans se est fondé sur une évaluation visuelle de la morphologie terminale NMJ et sur la détection qualitative des anomalies synaptiques ou notation semi-quantitative de quelques caractéristiques morphologiques. En conséquence, plutôt subtiles anomalies morphologiques synaptiques qui ne sont pas visibles à l'œil humain sont facilement passer inaperçus. Afin de pouvoir détecter globalement des différences quantitatives, lesNMJ doit être évaluée avec précision par quantification systématique des paramètres morphologiques d'intérêt. La mesure des caractéristiques NMJ manuellement est laborieuse, en particulier lorsqu'il y a plusieurs caractéristiques NMJ d'intérêt et / ou lors de l'exécution des projections génétiques à grande échelle. Afin de soutenir multiparamétrique, analyse morphologique à haut débit et d'atteindre la quantification objective, deux macros « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été développés 17. Les deux macros fonctionnent dans le logiciel d'analyse d'images open source Fidji 18, et peuvent quantifier les images confocale et nonconfocal.
"Drosophila NMJ morphométrie" mesures bornes NMJ immunocolorées avec le disque de marqueur postsynaptique grand-1 (DLG-1) ou la peroxydase de raifort présynaptique (HRP), co-marquées avec le marqueur de zone active Bruchpilot (Brp). Il quantifie neuf Paramé morphologiqueTER (décrit plus en détail ci - dessous): Surface de la jonction neuromusculaire, le périmètre NMJ, le nombre de boutons, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre d'îles, le nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives dans le terminal synaptique (figure 1) . Bien qu'un algorithme pour déterminer le nombre de boutons est présent dans cette macro, il ne répondait pas aux critères de précision 17. Pour évaluer correctement le nombre de boutons, il est nécessaire d'utiliser la macro « drosophile NMJ Bouton Morphometrics », qui est spécialement conçu pour quantifier boutons à l' aide de préparations NMJ immunocolorées par anti-Synaptotagmin (SYT) ou de la protéine de chaîne anti-Cystéine (Csp), et co-immuno avec Brp. La macro « drosophile NMJ Bouton Morphometrics » quantifie les paramètres suivants: nombre de boutons, zone NMJ de bouton, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre d'îles, nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zo actifnes (Figure 2).
Les macros sont constituées de trois sous-macros: (I) « Autre empiler » identifie tous les fichiers d'image disponibles et crée Z-hyperstacks et les projections d'intensité maximale des deux canaux. En sortie, cette macro va générer deux nouveaux fichiers par synapse appelé « stack_image_name » et « flatstack_image_name ». II) « Définir ROI » ouvrira toutes les images de projection maximale de « flatstack_image_name » consécutivement et les présenter à la demande de définir manuellement la région d'intérêt (ROI) dans laquelle le terminal synaptique spécifique d'intérêt est présent. Ceci a été mis en œuvre pour permettre à l' exclusion des synapses reliant les muscles adjacents et / ou d' autres types de terminaux synaptiques (comme 1s) qui peuvent être présents dans les images 11. (III) « Analyse » applique une analyse entièrement automatisée pour toutes les régions des images à l'intérieur de la ROI. Commeà la suite de cette étape, l'utilisateur obtiendra deux nouveaux fichiers: « Results.txt » où toute la mesure numérique sera annotées et un « res_image_name.tif » où les segmentations d'images sous-jacentes produites par la macro seront illustrées. Au cours de l'analyse d'image de trois structures sont dérivées de chaque terminal synaptique: le contour NMJ, le squelette NMJ, et le nombre de zones actives Brp-positives. Le contour NMJ est utilisé pour déterminer la zone NMJ et son périmètre et une séparation des bassins versants après indique le nombre de boutons. À partir du squelette, cinq caractéristiques NMJ sont déduits: la longueur totale NMJ, la somme de la longueur du plus long trajet continu reliant les deux points d'extrémité (longueur plus longue branche), le nombre de compartiments non connectés par NMJ (dénommé « îlots » ), le nombre de branches, et le nombre de points de ramification (un point de dérivation relie trois branches ou plus). Le nombre de zones actives est déterminée dans le canal en comptant Brptaches Brp positives. Le contour NMJ annoté (ligne jaune), le squelette NMJ (ligne bleue), et le nombre de zones actives Brp-positives (indiqués par les foyers blanc) sont affichés dans un tableau de résultats et les mesures des paramètres sont traités à un (. txt) du fichier de sortie (figure 3).
Drosophila NMJ Morphometrics » et "drosophile NMJ Bouton Morphometrics" ont d' abord été décrits et largement validés par Nijhof et al. 17. Ce manuscrit se concentre sur la méthodologie pour analyser la morphologie NMJ à l' aide des macros "drosophile NMJ Morphométrie" et "drosophile NMJ Bouton Morphométrie". Néanmoins, avant analyses macro assistée, dissections NMJ et immunomarquages doivent être effectuées. Ce sont des étapes cruciales, et la combinaison de marqueurs utilisés pour l'immunohistochimie doit convenir à des analyses macro. Ces étapes sont brièvement mentionnées en soiction 1 de ce protocole et diriger l'utilisateur vers des références décrivant en détail les protocoles d'exécuter ces procédures.
Protocol
1. Conditions préalables au traitement de l'image
- Effectuer la drosophile préparations livre ouvert de troisième larves errant stade larvaire (L3), comme décrit précédemment 19.
- Co-immunolabel terminaux Drosophila NMJ utilisant une combinaison de deux marqueurs: DLG 1 ou Hrp avec Brp pour l' analyse par "Drosophila NMJ Morphometrics", et Syt ou Csp avec Brp pour l' analyse par "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" 20.
NOTE: Les anticorps de la même espèce peuvent être combinés par une pré-marquage avec un kit de conjugaison d'anticorps tels que l'étiquetage Alexa Zenon Kits 17. - Image bornes NMJ à l' aide d' un microscope de choix, par exemple, la fluorescence (avec ou sans ApoTome) ou microscopie confocale.
- L'acquisition d'une pile d'images 2-canal du terminal NMJ.
- Ajuster les réglages du microscope de façon que le canal 1acquiert le terminal NMJ immuno avec Dlg-1 (ou Hrp, Syt, Csp) et le canal 2 du terminal NMJ immuno avec Brp.
- Eventuellement, une analyse des images à canal (de synapses immunomarquées avec un anticorps simple) avec les macros. NMJs image immunomarquées unique avec Dlg-1 ou Hrp pour l' analyse avec "Drosophila NMJ Morphometrics", ou Syt ou Csp pour "drosophile NMJ Bouton Morphometrics".
REMARQUE: Il est impossible d'analyser synapses immunocolorées avec seulement anti-Brp.
- Exporter les images obtenues sous forme de fichiers « .tiff individuels. Inverser l'ordre de canal avant d'exécuter les macros si non acquises comme indiqué.
- L'acquisition d'une pile d'images 2-canal du terminal NMJ.
2. Configuration logicielle requise et installation
- Télécharger les macros: « drosophile NMJ Morphometrics » et « drosophile NMJ Bouton Morphometrics » du site Web suivant: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- Déplacez le curseur sur le dossier « de mise à jour des macros 1 », puis cliquez sur l'option qui apparaît « vue ». Une liste avec le contenu de ce dossier apparaît. Le dossier contient les macros « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie ».
REMARQUE: Les deux macros sont compatibles avec les versions 1.4 Fidji, qui est également fourni dans le même dossier. Les macros ne peuvent pas fonctionner sur les versions récentes. S'il vous plaît utiliser la version fournie 1.4. Il ne pose aucun problème pour commencer cette version, même sur les ordinateurs avec une version plus récente Fidji disponible.- Cliquez sur « Télécharger tout ». Le contenu du dossier sera téléchargé sur l'ordinateur sous forme de fichier .zip. Décompressez le fichier téléchargé.
- Copiez les fichiers _NMJ_Morphometrics.ijm drosophile et la drosophile _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm dans le répertoire Fiji.app/plugins/. Lors du redémarrage du programme, les macros apparaîtront au bas de la Pluginsmenu déroulant.
- Déplacez le curseur sur le dossier « de mise à jour des macros 1 », puis cliquez sur l'option qui apparaît « vue ». Une liste avec le contenu de ce dossier apparaît. Le dossier contient les macros « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie ».
3. Exécuter sous-macro "Convertir Stack" pour créer des projections Z et Hyperstacks des Images NMJ
- Démarrez l'interface graphique en sélectionnant Plugins dans la barre d' outils et choisissez dans le menu déroulant « Drosophila NMJ Morphometrics ».
- Définir le paramètre « String fichier unique » dans l'interface graphique de la macro.
REMARQUE: Le logiciel de microscope utilise une signature d'identification pour organiser des plans et des canaux pour le stockage des piles sous forme de fichiers « .tiff individuels. Le réglage de la chaîne de fichier unique entré doit spécifier la signature attribuée par le logiciel au premier plan du premier canal (important: plan le plus bas et le numéro de canal doit être indiqué). - Sélectionnez uniquement la sous-macro « Convertir en pile » et cliquez sur « ok » et sélectionnez le dossier dans lequel se trouvent les images. Si un répertoire principal avec plusieurs sous-dossiers est sélectionnée, tous les fichiers individuels » .tiff dans lesle répertoire principal et sous-dossier correspondant aux critères de chaîne de fichiers uniques seront traitées.
- Si le z-stack ne contient qu'un seul canal, sélectionner la case « Channel 1 seulement ».
- Notez que deux nouveaux fichiers par image NMJ, par défaut nommé comme stack_image_name et flatstack_image_name apparaîtront. Ne conserver que ces pile et flatstack pour une analyse ultérieure. La série de fichiers .tiff peut être supprimé à ce stade, ce qui réduit les capacités de stockage nécessaires et d'éviter les sources d'erreurs potentielles.
4. Exécuter sous-macro « Définir le retour sur investissement » pour Délimiter le terminal d'intérêt NMJ
- Démarrez l'interface graphique de « drosophile NMJ Morphometrics ».
- Sélectionnez uniquement la case à cocher « Définir le retour sur investissement » et appuyez sur « OK » et sélectionnez le répertoire principal où les images sont stockées droit flatstack_name et appuyez sur « Sélectionner ». Le sous-macro « Définir le retour sur investissement » recherche automatiquement tous les sous-dossiersdans le répertoire principal sélectionné.
- Comme la première projection s'ouvre, sélectionnez l'outil « sélections Freehand » dans la barre d'outils. En utilisant la souris dessiner une sélection qui contient exclusivement le terminal NMJ complet d'intérêt et cliquez sur « OK » dans la fenêtre « Définir borne ». La macro procédera à la projection suivante.
- Délimiter le prochain retour sur investissement et répéter jusqu'à ce que tous sont définis ROIs. Le fichier image de la ROI, nommé « roi_image_name », sera stocké dans le même répertoire que la pile précédemment générées et des images de projection pour chacune des images traitées. La sortie de ce sous-macro est une image binaire de la ROI en blanc sur un fond noir.
5. Exécuter sous-macro « Analyse » à Quantifier NMJ Caractéristiques Terminal
- Aller à la barre d'outils, sélectionnez « Plugins » et utilisation:
"Drosophila _NMJ_Morphometrics" lors de l' analyse des synapses immunomarquées avec un anticorps anti-PC-1 ou anti-HRP (canal 1) , ainsi queavec des anti-Brp (canal 2), ou "_NMJ_Bouton_Morphometrics Drosophila" lors de l' analyse des synapses immunomarquées avec un anti-Syt ou anti-Csp (canal 1) conjointement avec Brp (canal 2).- Quand une des piles d'images du canal sont à analyser (le canal structural DLG 1 ou HRP pour « Drosophila_ NMJ_Morphometrics », ou Syt ou DSP pour « _NMJ__Bouton_Morphometrics Drosophila »), sélectionner la case « Channel 1 seulement ».
- Réglez l'échelle correspondant aux images à analyser. Si un pixel de l'image correspond à 2,5 pm, indiquer Scale-pixels = 1, échelle de distance en pm = 2,5. Dans le cas où les deux paramètres sont laissés à 0, la zone NMJ, le périmètre, la longueur et la plus grande longueur de la branche seront exprimés en nombre de pixels.
- Si nécessaire, réglez les paramètres d'analyse par défaut de la macro. Effectuez les réglages que si le sous-macro « Analyze » (cette section avec des résultats peu satisfaisants, et determined meilleurs réglages dans la section 6) a été exécuté.
- Cochez les cases « Analyser » et « Wait » et appuyez sur « OK ».
- Sélectionnez le « Wait » case à cocher lors de l'exécution de la sous-macro « Analyse » sur 2 images de canal. Sinon, des erreurs dans le comptage de zone active peuvent se produire en raison de capacités informatiques limitées.
- Comme une nouvelle fenêtre « Choisissez un répertoire » ouvre, sélectionnez le répertoire dans lequel les images se trouvent et appuyez sur « sélectionner ». La macro analysera toutes les images stockées dans le répertoire principal et, le cas échéant, les dossiers suivants (en utilisant les trois fichiers d'exécution des sous-macros précédentes: stack_image_name, flatstack_image_name et roi_image_name). Les processus macro chaque image individuellement et consécutivement. Cela peut prendre plusieurs minutes par pile d'images (en fonction de la capacité de l'ordinateur).
- Après avoir exécuté la macro, notez qu'un nouveau fichier image nommée res_image_name pour chaque analyse synapse stocké sera created dans le dossier des parents. Les mesures quantitatives seront stockées sous forme de fichier « results.txt ».
- Inspecter toutes les images de résultat pour détecter et exclure des photos avec des erreurs de segmentation. Les erreurs de segmentation possibles sont décrits dans le tableau 3, ainsi que des conseils sur la façon d'ajuster les paramètres pour contourner ceux - ci. Images de résultat avec de telles erreurs de segmentation sont fournies à titre d' exemple de la figure 4.
REMARQUE: Lorsque vous exécutez la macro avec les paramètres par défaut observés dans l'interface utilisateur, il y avait une précision d'environ 95% lors de l' évaluation macro a été comparée à l' évaluation manuelle 17.
6. Réglez les paramètres macro aux images
- Lorsque plus de 5% des images montrent des erreurs de segmentation, d'explorer les différents algorithmes pour définir / choisir les paramètres macro les plus appropriés pour les images.
- Ajuster la valeur de roulement de rayon de la bille
REMARQUE: Le rayon de roulement à billesfonction soustrait l'arrière-plan de l'image. Cette fonction est d'une importance cruciale lorsque l'on travaille avec des images acquises sur des microscopes à fluorescence et / ou lorsque les images ont le bruit de fond. La soustraction de l'arrière-plan aidera les étapes auto-seuillage de la macro pour produire une segmentation adéquate des terminaux NMJ.- Sélectionner trois saillies en Z (NMJ images flatstack_image_name générés par la sous-macro « Autre empiler ») qui sont représentatives de l'ensemble de données d'image.
- Dans la barre d'outils, sélectionnez Image | couleur | canaux Split. Deux images seront créés, l'un représentant le canal 1 et l'autre canal 2.
- Conserver uniquement l'image appartenant au canal 1 ouvert, correspondant à Dlg-1, Hrp, Syt ou Csp immunomarquage, et jeter l'image de canal Brp en fermant l'image.
- Exécutez le filtre « arrière-plan Soustraire » en sélectionnant « processus » dans la barre d'outils puis « Arrière-plan Soustraire ... » dans le menu déroulant.
- Cliquer sur la case de visualisation dans la fenêtre contextuelle et ajuster le rayon de roulement à billes à la valeur qui augmente le contraste entre la synapse et le fond comme dans le panneau (Figure 5A).
REMARQUE: Voir la figure 5 pour un exemple. Dans Figure5A, des parties de la synapse montrent les mêmes niveaux de gris que l'arrière - plan, alors que sur la figure 5A » le « rayon de roulement bille » réglé sur 500 génère un fort contraste entre la synapse et l'arrière - plan. - Lorsque la valeur appropriée pour le rayon de la bille roulante est définie, exécuter le « fond Soustraire » algorithme sur les saillies de Z-sélectionnés ayant la même valeur de roulement de rayon de la bille et de les enregistrer (dans un répertoire).
Remarque: la valeur de rayon de roulement à billes pendant 8 bits ou des images RGB doit être au moins aussi grand que le rayon du plus grand objet dans l'image qui ne fait pas partie de l'arrière-plan. Pour 16 bits et les images 32 bits devrait être inv le rayonersely proportionnelle à la plage de valeurs de pixel 22.
- Déterminer les différents seuils d'auto-qui seront utilisés
- Ouvrez les projections Z-enregistrées à l'étape précédente (6.2.6) et Sélectionner une image | ajuster | AutoThreshold | Essayez tous.
- Comme une image de résultat binaire seuillée apparaît avec tous les différents algorithmes de seuil automatique, déterminer l'algorithme le plus approprié pour les images.
- Lors de l'exécution de la macro plus tard, changer le seuil dans les paramètres macro en conséquence.
- Utiliser des seuils plus restrictifs tels que « RenyiEntrophy » ou « Moments » en tant que le seuil de contours NMJ et des seuils plus permissives telles que « Li » pour déterminer le squelette NMJ et « Huang » pour déterminer les zones actives. Lorsque les images sont très tranchantes avec peu ou pas de fond, utiliser « Huang » comme » seuil de contour NMJ. Dans le cas contraire des parties de la synapse pourraient être portées disparues après la segmentation d'images.
- Voir la figure 5B pour un exemple. segmentation appropriée de la synapse est obtenue avec auto-seuils mis en évidence par des boîtes vertes. Voici quelques exemples de seuils non appropriés sont mis en évidence par des boîtes rouges (vérifier synapses à fort grossissement). Dans ce dernier, que ce soit des parties de la synapse sont des pièces manquantes ou de l'arrière-plan sont inclus. Voir référence 23 pour plus d'informations.
- Déterminer la taille maximale des petites particules
NOTE: Cette fonction exclut toutes les particules détectées par le seuil de contour NMJ et le seuil Skeleton qui sont inférieures à la valeur définie dans le « petit paramètre particules » de l'analyse. Cette valeur est définie en pixels. Cette fonction sert de filtre de bruit et est très utile lorsque des taux élevés d'arrière-plan non uniforme (tels que les cristaux / poussière) sont présents dans les images obtenues.- Ouvrez les projections Z-enregistrées à l'étape 6.2.6. et définirl'échelle pour détecter le nombre de pixels par Analyse | Définir l'échelle. Appliquer les paramètres suivants: distance en pixels = 1, la distance connue = 1, le rapport d'aspect de pixel = 1, l'unité de longueur = pixel et appuyer sur "OK". Cliquez sur l'outil « Sélection ovale » dans la barre d'outils.
- En utilisant la souris dessiner une sélection entourant étroitement les particules individuelles qui sont présentes dans le immunomarquage mais ne font pas partie du NMJ. Appuyez sur Ctrl + m pour un utilisateur Windows ou Cmd + m pour les utilisateurs Mac. Une fenêtre de résultat est ouvert, ce qui indique la zone des particules sélectionnées en nombre de pixels.
- Répétez l'étape précédente à plusieurs reprises avec plusieurs artefacts présents dans les images pour déterminer la plus grande zone de particules contaminantes / artefact. Ce sera la valeur définie dans le réglage lors de l'exécution de la macro plus tard. Lors de l'exécution de la macro régler la « petites particules Taille » comme la plus petite taille des particules du pus observé une marge de 25%.
- Voir la figure 5D pour un exemple. Le plus grand cristal détectered a une superficie de 112 pixels. La « Petite taille des particules » réglage, lors du traitement de cette image avec la macro, doit être réglée à 125 - 150.
- Déterminer la taille minimum de bouton
NOTE: Cette fonction exclut tous détectés par le boutons seuil de contour NMJ qui sont inférieures à la valeur définie de l'analyse. Cette valeur est définie en pixels.- Suivez les mêmes étapes que décrites à la section 6.4, mais dans ce cas dessiner une sélection entourant les plus petits présents dans boutons du terminal NMJ. Choisissez la plus petite zone correspondant au plus petit de ceux bouton mesurés. Ceci est la valeur définie dans le réglage de la taille du bouton minimum lors de l'exécution de la macro plus tard.
- Définir la valeur « Trouver la tolérance au bruit maxima »
- Utilisez les Z-hyperstacks sélectionnés dans la section 6.2.1.
- Dans la barre d'outils, sélectionnez Image | couleur | canaux Split à create 2 piles (pour le canal 1 et le canal 2) et conserver l'image correspondant au canal Brp ouvert. Jeter l'autre image de canal en la fermant.
- Accédez à l'onglet plugins dans le menu contextuel, sélectionnez Processus | Maximum (3D), et lorsque le maximum_image_name apparaît (ce qui peut prendre quelques minutes), fermez la pile d'images d'origine.
- Sélectionnez le maximum ... image_name (la pile d'image obtenue) et sélectionnez Plugins | processus | Minimum (3D), fermer le maximum ... pile image_name.
- Dans la barre d'outils, sélectionnez Processus | Trouvez maxima .... Une nouvelle fenêtre « Trouver maxima ... » ouvrira ses portes. Cochez la case « Sélection du point Aperçu ... » et remplissez la case « tolérance au bruit » avec le réglage par défaut macro 50. Les points de maxima seront indiqués dans l'image que de petites croix.
- Augmenter la valeur de « tolérance de bruit » si l' observation d' un excès de zones actives annotés, à savoir les croix qui ne sont pas au - dessus des zones actives qui sontmettre l'accent sur le plan de la pile sélectionnée, ou fausses zones actives qui sont détectés dans le fond.
- D'autre part, si incomplètement observant annotée zones actives, à savoir les zones actives au foyer ne sont pas étiquetés reconnu, diminuer la valeur « de tolérance au bruit ». Continuez à essayer différentes valeurs suivant cette procédure jusqu'à ce que les croix étiquettent correctement les zones actives au point. Remplir le « Trouver la tolérance au bruit des maxima » avec cette valeur.
- Voir la figure 5C pour un exemple. sont détectés trop de zones actives. Sur la figure 5C » ne sont détectés les zones actives au point.
- Augmenter la valeur de « tolérance de bruit » si l' observation d' un excès de zones actives annotés, à savoir les croix qui ne sont pas au - dessus des zones actives qui sontmettre l'accent sur le plan de la pile sélectionnée, ou fausses zones actives qui sont détectés dans le fond.
- Exécutez la sous-macro « Analyze » pour les images représentatives sélectionnées à l'étape 5.1, avec les paramètres définis dans les toutes les étapes précédentes.
- Ajuster inférieure et limite supérieure Brp-puncta
- Notez qu'un nouveau fichier sera apparaît après l'exécution du macro selon l'étape 6.6, appelé 2_active_zone_stack_image_name. Dans cette image empiler les zones actives détectées par la fonction « Rechercher maxima » sont indiquées par des points blancs dans chaque plan.
- Ouvrez ce fichier par glisser-déposer dans la barre d'outils et sélectionnez Image | Stack | Zproject | Type de projection = tranches Somme. Une projection de la 2_active_zone_stack_image_name sera obtenu.
- Sélectionner une image | ajuster | Seuil. Une nouvelle fenêtre « Seuil » ouvrira. Faire glisser la barre supérieure pour sélectionner une valeur de seuil où, tous les foyers souhaité / spots Brp-positifs sont visualisés en rouge.
NOTE: Si le seuil est trop bas, un excès de zones actives sera compté. Si la valeur est trop élevée, une fraction des zones actives manquera.- Voir Figure 5E pour un exemple. Lorsque le seuil est fixé à 400, la plupart des zones actives (symbolisée comme foyers de 1 pixel) ne sont pas inclus dans la segmentation, puisqu'ils ne sont pas mis en évidence en rouge (Figure 5E). Lorsque le seuil est réglé à une valeur de 50 toutes les zones actives sont mises en évidence en rouge (Figure 5E).
- Définir cette valeur comme seuil minimum. Laisse « Seuil supérieur de lacrymaux » sur la valeur maximale.
- Réexécutez la sous-macro « Analyser » pour les images représentatives avec les paramètres définis dans toutes les étapes précédentes de la présente section. Évaluer de manière critique les fichiers d'image résultant et assurez-vous que la segmentation se fait correctement. Si ce n'est pas le cas réajuster les réglages en fonction de la nature des erreurs de segmentation (figure 4, tableau 3).
Representative Results
Le fichier de résultats de texte apparaît dans le répertoire principal. Il résume tous les paramètres mesurés par image. Les résultats sont liés au nom de fichier et les paramètres sont ensuite résumées dans l'ordre indiqué dans les tableaux 1 et 2.
Res_image_name est un empilement à trois images. La première image montre le contour et le squelette du terminal NMJ déterminé par la macro sur la base de la voie 1 (immunomarquage DLG 1, HRP, Syt ou Csp). La seconde image est une copie de la première image et montre en outre les spots BRP-positifs identifiés qui sont détectés dans le canal 2 comme schématisé foyers. La troisième image fournit la saillie maximale du second canal en même temps que des foyers identifiés Brp-positifs.
Le seuil de contour NMJ est représenté en jaune dans l'image résultat de sortie macro. zone NMJ, PerimEter et le nombre de boutons sont déduites de ce seuil.
Le seuil de squelette NMJ est représentée en bleu dans l'image de résultat de sortie macro. longueur NMJ, la longueur de la branche la plus longue, le nombre de branches, points de ramification et les îles sont déduites de ce seuil.
Le seuil des zones actives NMJ est pas représentée dans l'image résultat de sortie macro. Ce seuil détermine la zone où pourrait se rencontrer potentiellement les foyers Brp positifs par la macro. Il est destiné à créer une zone NMJ qui est légèrement plus grand que celui défini par le seuil de contour NMJ. Lorsqu'un seuil trop restrictif est sélectionné, les foyers Brp positif situé sur le bord de la synapse peut être exclue. Lorsque le seuil est trop permissive, le bruit de fond peut être considéré comme positif taches Brp (Figures 1 - 2).
pour validate la performance de la macro « drosophile NMJ Morphometrics », trois conditions mutantes qui ont déjà été décrits pour présenter des défauts synaptiques dans différents paramètres NMJ ont été testés. Chaque défaut a été détecté par une méthode de segmentation d'image différente effectuée par la macro (NMJ contour, les zones actives ou squelette, respectivement 17). Après avoir ciblé les trois gènes d'intérêt par ARNi inductible et du spectacle dissections et NMJ immunomarquage des larves L3, la macro a été exécutée. Les mesures morphologiques NMJ obtenues ont été ensuite deux à deux (ARNi par rapport à son témoin) par rapport au moyen d'un test t. Dans les trois cas, les différences statistiques ont été trouvées entre les mutants et les contrôles affectant les paramètres qui sont en accord avec les défauts morphologiques rapportés précédemment. Cela confirme que les macros sont en effet capables d'identifier correctement les défauts décrits précédemment au NMJ drosophile.
Ankyrin 2 (ANK2, CG42734) mutants sont connus pour présenter des défauts de morphologie synaptiques, y compris les boutons condensés et NMJs plus petites. Ces défauts ont été observés pour les mutants ANK2 24, 25 et 26 knockdown ANK2 mouches. NMJ bornes de knock - down pan-neuronales Ank2- ARNi mouches (w; UAS-Dicer-2 / UAS-ANK2 ARNi KK107238; elav-Gal4 / +) ont montré significativement plus petite zone NMJ (moyenne = 339,25 pm 2; t-test p = 2,18 x 10 -8) et de périmètre (moyenne = 238,24 pm; t-test p = 1,82 x 10 -3), par rapport à l'ensemble de données de commande d'arrière - plan génétique (w; UAS-Dicer-2 / UAS-KK60100; elav-Gal4 / + ) (moyenne = 451,95 pm 2 et moyenne = 288,62 pm, respectivement) après l' exécution de "Drosophila NMJ Morphometrics" (figures 6A et 4B).
Le GTPase Rab3 (CG7576) est nécessaire pour une bonne répartition de Bruchpilot et le mutant rup présente un nombre significativement réduit de zones actives 27. Une diminution significative du nombre de zones actives a été observée lors de la mesure des foyers Brp positif par la "Drosophila NMJ Morphometrics" macro dans les terminaux NMJ de mouches knockdown Rab3 pan-neuronales (w; UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi KK100787; elav -Gal4). Le nombre moyen de zones actives par terminal NMJ dans Rab3 -RNAi était de 138 par opposition à 290 détectée dans l'ensemble de données de commande (/ +) t-test p = 4,43 x 10 -29) (figures 6A et 4C).
Highwire (hiw, CG32592) est un régulateur important de la croissance NMJ; des mutations dans des gènes de plomb hiw à proliférer et étendues de ramification des bornes NMJ 28. Mesure de bornes de ligne de NMJ knockdown Hiw pan-neuronal -RNAi (w; UAS-Dicer-2 / UAS-RNAi-GD36085; elav-Gal4 / +) avec "Drosophila NMJ Morphometrics", des différences significatives ont été observées dans les paramètres dérivés squelettiques: longueur (moyenne = 147,36 pm, le contrôle signifie = 122,07 pm; t -test p = 7,31 x 10 -7), la plus grande longueur de la branche (moyenne = 122,19 pm; contrôle moyenne = 105,65 pm; t-test p = 4,62 x 10 -4) le nombre de branches (moyenne = 7,69; contrôler moyenne = 5,74; t-test p = 2,52 x 10 -2) et le nombre de points de ramification (moyenne = 2,73; contrôler moyenne = 1,79; t-test p = 3,31 x 10 -2). Tous ces paramètres ont été significativement augmentés (120-180%) par rapport aux contrôles d'arrière - plan génétique (W; UAS-Dicer-2 / UAS-GD60000; elav-Gal4 / +) (figures 6A et 4D).
Figure 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics mesure 9 Paramètres du Drosophila NMJ. A gauche sont Dlg-1 et Brp immunomarquées terminaux NMJ, imagées sur un microscope à fluorescence avec ApoTome. A droite sont des images de résultats après l' exécution « Drosophila NMJ Morphometrics ». zone Paramètres, périmètre et sont représentés par boutons le contour jaune annoté macro-indiqué. longueur des paramètres, la longueur de la branche la plus longue (LBL), des branches, des points de ramification, et les îles sont présentées par le contour bleu annotée macro. foyers Brp-immunomarquées (zones actives) sont représentées par la macro comme des taches blanches dans les images de résultats. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Drosophila NMJ Bouton Morphometrics mesure 8 Paramètres de la NMJ Drosophila. Sur la gauchesont Syt-1 et Brp immunomarquées borne NMJ, imagée sur un microscope à fluorescence avec ApoTome. A droite sont des images de résultats après l' exécution « drosophile NMJ Bouton Morphometrics ». Paramètres zone et boutons sont représentés par bouton le contour jaune annoté macro. longueur des paramètres, la longueur de la branche la plus longue (LBL), des branches, des points de ramification, et les îles sont présentées par le contour bleu annotée macro. foyers Brp-immunomarquées (zones actives) sont représentées par la macro comme des taches blanches dans les images de résultats. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: organigramme représentant la drosophile NMJ Morphometrics et Drosophila NMJ Bouton Morphometrics macros. Le premier sous-macro « Convertir to pile » crée des projections et hyperstacks des NMJs imagées. Le second sous-macro « Définir ROI » nécessite la saisie manuelle définissant l'emplacement du terminal NMJ d'intérêt. Sous-macro trois, « Analyse », des mesures de tous les paramètres NMJ. Un texte fichier contenant les valeurs quantitatives et un fichier image résultat représentant la délimitation des paramètres sont créés pour aider l'évaluation de l'utilisateur de la performance macro. Lorsque les images sont acquises dans des conditions différentes, les paramètres macro doivent être testés et ajustés pour assurer une analyse précise. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Exemples de résultats Segmentation Macro inappropriée. Images de résultat après l' exécution "drosophile NMJ Morphometrci » ou « Drosophila NMJ Bouton Morphometrics ». Des parties de la borne synaptique ne sont pas inclus dans la liste jaune (A). Des parties de l'arrière - plan sont inclus dans le terminal synaptique par le contour de couleur jaune (B). ligne d'ossature bleu se prolonge au - delà de la terminale synaptique. (C - D) Trop de zones actives sont détectées (E - E '). Certaines zones actives ne sont pas détectées par l'analyse (G - G'). zones actives sont détectées en dehors de la synapse (F) de segmentation de bouton incorrect. (applicable uniquement lors de l' exécution de Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutons sont en absence (H) ou trop de boutons sont détectés par la segmentation (I). les particules un tel cristaux ou particules qui font partie de l'arrière - plan sont inclus dans la segmentation (J) . Informations comment modifier les paramètres pour éviter ces erreurs sont fournies dans le tableau 3 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Exemples de réglages macro-réglage et leurs conséquences pour la segmentation d'images. (A) l Soustraire de fond d'une DLG une immuno - synapse, imagée sur un microscope à fluorescence avec ApoTome, lorsque "roulant rayon de la bille" est réglé sur 20 (A) ou 500 (A »). (B) images de sortie obtenues après l' exécution de l' image | ajuster | Auto-Seuil | Essayez toute l'image illustre segmentations d'images obtenues par les 16 différents algorithmes de seuil automatique. (C) l "Rechercher Maxima" lors de la configuration "tolérance de bruit" à 50 (C) et 500 (C »); Aczones tives qui sont détectés par la segmentation sont marquées par une petite croix. (D) Mesure de la « petites » particules apparaissant dans l'arrière - plan d'image d'une synapse avec des anti-immuno - Hrp, imagée sur un microscope confocal. (E) projection "Somme des tranches" obtenu à partir du 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Le seuil est fixé à 400 (E) et à 50 (E »). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Évaluation macro et Quantification des NMJs sur le muscle 4. (A) images de résultat après l' exécution de macro "drosophile NMJ Morphometrics" DLG-1 et Brp immunomarquées terminaux NMJ. zone Paramètres, périmètre et boutons sont représentés par le contour jaune macro-annoté. longueur des paramètres, la longueur de la branche la plus longue (LBL), des branches, des points de ramification, et les îles sont présentées par le contour bleu annotée macro. foyers Brp-immunomarquées (zones actives) sont représentées par la macro comme des taches blanches dans les images de résultats. La barre d'échelle indique 20 um. (B) Ankyrin2 ARNi exposition knockdown une zone plus petite NMJ et le périmètre par rapport à des contrôles de fond génétique. (C) Rab3 effet de choc a donné lieu à NMJs avec un nombre inférieur de zones actives Brp-positives par rapport à des contrôles de fond génétique. (D) knockdown Highwire entraîné plus, la longueur de branche supérieure la plus longue, plus ramifié et plus avec des points par ramification terminaux NMJ par rapport à NMJs de contrôle d'arrière - plan génétique. Les barres d'erreur indiquent SEM, ** p <0,01, deux T-tailed test. S'il vous plaît cliquer sur ilre pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Paramètre | Structure NMJ | Explication |
| Zone (um2) | contour NMJ | La zone de la NMJ complète étiquetée |
| Périmètre (pm) | contour NMJ | Le périmètre appartenant à la zone |
| #Boutons | contour NMJ | Le nombre de boutons synaptiques ( « perles sur une chaîne ») du NMJ |
| Longueur (pm) | Squelette | La longueur totale du terminal NMJ complet |
| longueur de la branche la plus longue (um) | Squelette | La somme de la longueur de la plus longue trajectoire continue reliant les deux extrémités de la NMJ |
| #Branchees | Squelette | Le nombre total de branches |
| les points #Branching | Squelette | Le nombre de points de ramification (plusieurs branches peut dériver d'un point de ramification) |
| #Îles | Squelette | Le nombre de compartiments non connectés synaptiques DLG1-positifs (ou toute autre coloration) |
| zones #Active | taches Brp positif | Le nombre de zones actives, en fonction de coloration Brp |
Tableau 1: NMJ paramètres mesurés par "drosophile NMJ Morphometrics". Les paramètres mesurés NMJ par la macro « drosophile NMJ Morphometrics » apparaissent sous la forme d' une liste dans le fichier texte obtenu, suivant l'ordre décrit dans ce tableau. Ce tableau est tiré à part Nijhof et al. 17
| Paramètre | Structure NMJ | Explication |
| boutons | contour NMJ | Le nombre de boutons synaptiques ( « perles sur une chaîne ») du NMJ |
| zone Bouton | contour NMJ | La superficie totale de tous les boutons |
| Longueur (pm) | Squelette | La longueur totale du terminal NMJ complet |
| longueur de la branche la plus longue (um) | Squelette | La somme de la longueur de la trajectoire continue la plus longue reliant deux points d'extrémité de la JNM |
| #Branches | Squelette | Le nombre total de branches |
| les points #Branching | Squelette | thnombre e de points de ramification (plusieurs branches peut dériver d'un point de ramification) |
| #Îles | Squelette | Le nombre de compartiments non connectés synaptiques DLG1-positifs (ou toute autre coloration) |
| zones #Active | taches Brp positif | Le nombre de zones actives, en fonction de coloration Brp |
Tableau 2: NMJ paramètres mesurés par "drosophile NMJ Bouton Morphometrics". Les paramètres mesurés NMJ par la macro « drosophile _Bouton_NMJ_Morphometrics » apparaissent sous la forme d' une liste dans le fichier texte obtenu, suivant l'ordre décrit dans ce tableau. Ce tableau est tiré à part Nijhof et al. 17
| Segmentation | Exemple | Les ajustements nécessaires | ||
| NMJ Aire et périmètre (Représenté par contour jaune dans l'image résultat) | Les parties du terminal synaptique sont soit pas inclus dans le contour jaune ou une partie de l'arrière-plan sont inclus dans le terminal synaptique en jaune. | La figure 5A-B | Régler la valeur "à bille roulante Rayon. Voir la section 6.1. | Réglez «seuil de contour NMJ. Voir la section 6.2. |
| longueur NMJ paramètres liés (représenté par la ligne d'ossature bleu dans l'image du résultat) | ligne d'ossature soit bleu va au-delà ou ne sont pas présents le long de la totalité de la borne synaptique. | La figure 5C-D | Régler la valeur "à bille roulante Rayon. Voir la section 6.1. | Réglez «seuil de contour NMJ. Voir la section 6.2. | </ Tr>
| puncta Brp positif (représenté par des points dans les résultats image) | sont détectés trop de zones actives. | Figure 5E-E » | Diminuer la valeur «Trouver la tolérance au bruit des maxima. Voir la section 6.5. | |
| puncta Brp positif (représenté par des points dans les résultats image) | zones actives sont manquées par l'analyse. | Figure 5G-G » | Augmentez la valeur «Trouver la tolérance au bruit des maxima. Voir la section 6.5. | Diminuer "seuil inférieur Brp-lacrymaux. Voir la section 6.6. |
| puncta Brp positif (représenté par des points dans les résultats image) | artefacts de zone active sont détectées à l'extérieur du terminal synaptique. | Figure 5F | Régler la section 'Zone de seuil active' 6.2. | Augmenter "seuil inférieur Brp-lacrymaux. Voir la section 6.6. |
| Les petites particules | Particules un tel cristaux ou de poussières qui font partie de l'arrière-plan semblent être inclus dans la segmentation. | Figure 5J | Cochez la case «Supprimer les petites particules. Voir la section 6.3. | Déterminer de petites particules de taille maximale. Voir la section 6.3. |
| segmentation Bouton | la segmentation incorrecte bouton (uniquement applicable à la drosophile NMJ Bouton Morphometrics, ne pas utiliser la drosophile NMJ Morphometrics pour la segmentation de bouton). | Figure 5H-I | Réglez «seuil de contour NMJ. Voir la section 6.1. | Déterminer «taille minimale de bouton. Voir la section 6.4. |
Tableau 3: Guide de dépannage pour les différents types d'erreurs dans la segmentation d'image qui peut être produit par les macros. Ce tableau décrit les différents types deLes erreurs de segmentation d'images produites par les macros. Ceux-ci peuvent être facilement détectés dans les images de résultats. Des exemples de chaque type d'erreur sont représentés sur la figure 4. Dans la section « ajustements » de la table, les paramètres qui doivent être ajustées sont mises en évidence, et l'utilisateur est appelé à la sous-étape critique de l'article 6, qui décrivent comment régler ces paramètres.
Discussion
« Drosophile NMJ Morphometrics » et « drosophile NMJ Morphometrics bouton » sont de puissants outils pour les chercheurs intéressés à évaluer la morphologie des synapses. évaluation manuelle des paramètres NMJ est laborieuse; on estime que les macros économiseraient un chercheur expérimenté jusqu'à 15 min / NMJ consacré à la segmentation d'images manuel. Avec une à deux douzaines de synapses évaluées par état ou génotype, cela résume rapidement à des quantités considérables de temps économisé, même dans les études à petite échelle. Lorsque vous effectuez de grands écrans, le gain en utilisant l'analyse à haut débit, par rapport à l'évaluation et la quantification manuelle, peut être immense. En plus de l'augmentation du débit, les macros fournissent facilement une analyse objective; ils excluent les préjugés personnels qui s'y opposent des expériences aveuglés ainsi que les différences interpersonnelles qui se produisent lorsque plusieurs chercheurs sont impliqués dans l'analyse. Enfin, les macros sont un sensible et précisaly des caractéristiques NMJ, permettant l'identification des régulateurs synaptiques qui causent plutôt subtiles que des défauts NMJ dramatiques et ont jusqu'à présent restés incompris par l'œil du chercheur. Des informations détaillées sur les procédures de validation et les algorithmes utilisés dans les macros se trouvent dans la publication Nijhof et al. 17.
La fonctionnalité des macros a été validé pour mesurer de manière appropriée les caractéristiques morphologiques de Drosophila melanogaster NMJs au muscle 4. Ensuite, on a démontré que les macros sont également appropriés pour analyser synapses à d' autres muscles de cet organisme. Il est probable que les macros peuvent également être utilisés pour mesurer les paramètres morphologiques de NMJ avec une structure similaire dans d' autres espèces, y compris d' autres espèces de drosophiles et les insectes autres. Même NMJs très éloignés dans l' évolution, par exemple, NMJs de souris, montrent une conformation structurelle assez similaire 29. Les macros n'ont pas été testées sur des préparations NMJ d'autres espèces, mais les utilisateurs potentiels sont encouragés à tester les macros à ces fins.
Il est très important que l'utilisateur explore les différents seuils d'auto-et algorithmes pour définir / choisir les paramètres macro les plus appropriés pour les images. Avec ces paramètres, on obtient une précision d'environ 95% lors de l'évaluation macro a été comparée à l'évaluation manuelle. Réglage des paramètres macro correctement pour le segment 100% des images peut être une procédure très laborieuse, voire impossible. Par conséquent, l'exclusion des images pas correctement segmentés est recommandée si leur nombre est inférieur à 5%. De toute évidence, si la qualité des images est faible, les macros génèrent des rapports plus élevés de segmentations d'image non satisfaisantes. images de faible qualité influenceront de la même évaluation manuelle et ne peuvent donc pas être lié à la performance des macros. Néanmoins, les macros sont assez robustes car ils ont été conçus pour l'images généré sur un microscope à haute teneur (un microscope à fluorescence automatisé qui permet l' imagerie d' un grand nombre d'échantillons) 17.
Un point critique est que l'utilisateur inspecte visuellement toutes les images de résultats générés par les macros. Cela permettra de détecter et d'exclure des images avec une segmentation peu satisfaisante. Dans l'article 6 de ce protocole, l'utilisateur est guidé comment ajuster les paramètres pour la segmentation d'image correcte lors de l'exécution de la sous-macro « Analyser ». Pour familiariser rapidement avec les exigences des macros et comment régler les paramètres macro un dossier appelé « Examples_adjusting paramètres macro » est inclus dans le référentiel macro https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Treize sous-répertoires, chacun avec des exemples d'images obtenues à différentes plates-formes de microscopie (microscope à haute teneur / confocale / fluorescence) et des différentes immunomarquages, sont fournis. Un PDF intitulé « Guide des exemples » est inclus dans le mêmedossier dans lequel les paramètres requis pour chaque exemple sont fournis, ainsi que d'un document de texte fournissant les résultats attendus et des images de résultats.
Les macros ont été conçues pour traiter les images enregistrées en tant que fichiers séparés .tiff, néanmoins certains utilisateurs ont sauvé leurs images dans un format différent. Le site Web suivant https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 contient un dossier nommé « drosophile NMJ » où trois exemples de fichiers (exemple 1 - 3) et le document « Guide des exemples » avec des instructions détaillées comment importer des images dans la macro sinon stockées sous forme de fichiers .tiff séparés peuvent également être trouvés dans le même dossier.
Ensemble, "drosophile NMJ Morphometrics" et macros "drosophile NMJ Morphométrie" quantifient bouton dix caractéristiques différentes NMJ: zone NMJ, périmètre NMJ, le nombre de boutons, zone NMJ de bouton, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre de islaPDN, nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives. Cela donne un grand avantage sur les outils disponibles à ce jour qui permettent d' évaluer seulement un ou quelques caractéristiques synaptiques 30, 31. Analyse quantitative multiparamétrique porte un grand potentiel pour de nouvelles découvertes, par exemple, pour identifier les régulateurs de nouvelles qui contrôlent un à de nombreux aspects de la biologie des synapses. Il fournit également la résolution requise pour déterminer les gènes qui coregulate exactement les mêmes caractéristiques NMJ ou qui se chevauchent et sont donc susceptibles d'opérer dans les voies moléculaires communes. Enfin, il ouvre la possibilité d'étudier comment les différents paramètres synaptiques sont corrélés entre eux dans des conditions non perturbées 17 et dont les gènes assurent ces corrélations morphométriques coordonnées.
Pris ensemble, ce protocole illustre comment utiliser les deux macros « drosophile NMJ Morphometrics » et« Drosophila NMJ Bouton Morphometrics », qui effectue une quantification objective et sensible de dix caractéristiques morphologiques NMJ d'une manière à haut débit.
Disclosures
Les auteurs ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le centre boursier drosophile Drosophila Resource Center Vienna et Bloomington (NIH P40OD018537) pour fournir des souches de drosophile. Nous remercions Jack Fransen du Centre d'imagerie Microscopie pour le soutien d'experts en imagerie. Cette étude a été soutenue par des subventions et VIDI TOP (917-96-346, 912-12-109) de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), par deux DCN / Université Radboud de bourses de doctorat du Centre médical, par le Réseau arriération mentale allemand financé par le programme NGFN + du ministère fédéral allemand de l'éducation et de la recherche (BMBF) et par la grande échelle de l'Union européenne du 7e PC Gencodys réseau intégré (SANTÉ-241995) à l'AS. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
- Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
- van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
- Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
- Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
- Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
- Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
- Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
- Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
- Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
- Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
- Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
- Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
- Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
- Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
- Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
- Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902 (2013).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
