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Cancer Research

वाष्पीकरण को कम करने के संस्कृति हालत microtiter प्लेट में बहुकोशिकीय उपगोल गठन के reproducibility बढ़ जाती है

Published: March 7, 2017 doi: 10.3791/55403
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

Summary

microtiter प्लेटों से मध्यम के असमान नुकसान वर्दी बहुकोशिकीय ट्यूमर अंडाकार आकृति गठन के reproducibility प्रभावित करता है। संस्कृति स्थिति में सुधार महत्वपूर्ण मध्यम नुकसान अंडाकार आकृति गठन के reproducibility और तरल-ओवरले तकनीक का उपयोग कर अंडाकार आकृति आधारित assays के परिणामों में सुधार होगा कम करने के लिए।

Abstract

ट्यूमर मॉडल है कि निकट vivo परिस्थितियों में नकल दवाओं की खोज और संभावित कैंसर रोधी दवाओं की जांच के लिए विकास में तेजी से लोकप्रिय होते जा रहे हैं। बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids (MCTSes) को प्रभावी ढंग ठोस ट्यूमर की शारीरिक स्थिति की नकल, उन्हें नेतृत्व अनुकूलन और लक्ष्य सत्यापन के लिए इन विट्रो मॉडल में उत्कृष्ट बना रही है। MCTS संस्कृति के लिए उपलब्ध विभिन्न तकनीकों में से agarose पर तरल ओवरले विधि MCTS पीढ़ी के लिए सबसे सस्ती तरीकों में से एक है। हालांकि, उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए तरल ओवरले का उपयोग कर MCTS संस्कृतियों का विश्वसनीय हस्तांतरण agarose के साथ microtiter प्लेट (सांसद) की कोटिंग और कुओं भर में एक समान MCTS गठन की irreproducibility सहित सीमाओं की एक संख्या है, से समझौता किया जा सकता है। सांसदों काफी प्रभाव है कि थाली के बाहर से मध्यम के अत्यधिक वाष्पीकरण से परिणाम बढ़त होने का खतरा है, दवा के लिए पूरी थाली के प्रयोग को रोकनेपरीक्षण। यह पांडुलिपि तरल ओवरले तकनीक scalability और वर्दी MCTS गठन के reproducibility बढ़ाने के लिए विस्तृत तकनीकी सुधार प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, MCTS के मूल्यांकन के लिए एक सरल, अर्द्ध स्वचालित, और सार्वभौमिक रूप से लागू सॉफ्टवेयर उपकरण पर विवरण के बाद नशीली दवाओं के उपचार में प्रस्तुत किया है सुविधाएँ।

Introduction

ट्यूमर में कैंसर की कोशिकाओं physiologically एक जटिल, 3-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स और बातचीत के दौरान कोशिकाओं से घिरा संरचना में व्यवस्थित कर रहे हैं। के रूप में लगभग ऊतकों में सभी कोशिकाओं को एक 3 डी वातावरण में रहते हैं, और अधिक physiologically विट्रो ट्यूमर मॉडल है कि ट्यूमर के लक्षण नकल में प्रासंगिक के लिए जरूरत के कई 3 डी तकनीक संस्कृति 1, 2, 3 के विकास में हुई है। इन मॉडलों को अब 3 डी 2 में चिकित्सा विज्ञान के लिए मेटास्टेसिस और सेल प्रतिक्रिया पर ट्यूमर microenvironment की भूमिका का अध्ययन करने के लिए मौलिक अनुसंधान उपकरण होते जा रहे हैं। इसके अलावा, 2-आयामी (2 डी) सेल संस्कृतियों 4 की तुलना में, 3 डी मॉडल ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत, जो सेल संकेत दे रास्ते को प्रभावित करने का एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देते हैं।

बहुकोशिकीय ट्यूमर spheroids कैंसर कोशिका लाइनों के (MCTSes) अक्सर 3 डी सेल ग में इस्तेमाल कर रहे हैंulture इन विवो ट्यूमर के लिए उनके रिश्तेदार निकटता के कारण मॉडल। उपयोग में कई तकनीकों से बाहर, agarose में लिपटे प्लेटों पर MCTS पीढ़ी के तरल-ओवरले तकनीक (बहुत) नेतृत्व अनुकूलन और लक्ष्य सत्यापन 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 के लिए महत्वपूर्ण ब्याज का फायदा हुआ है। इस हाल के अध्ययनों से पता है कि सफलतापूर्वक बहुत 6, 7 का उपयोग कर MCTS संस्कृतियों में यौगिक पुस्तकालयों के पायलट स्क्रीन चलाने के लिए सक्षम थे से स्पष्ट है। हालांकि, वाष्पीकरण प्रेरित माध्यम की असमान कमी की वजह से MCTS आकृति विज्ञान और विकास में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता आम बाधाएं है कि बहुत से microtiter प्लेट का उपयोग (सांसद) के साथ कर रहे हैं। नतीजतन, गैर वर्दी MCTSes के गठन के महत्व और प्रासंगिकता समझौताऔषधीय assays 8, 12, 13 से डेटा का। reproducibility के मुद्दों के अलावा, एक और व्यावहारिक समस्या बहुत आधारित उच्च throughput assays प्रभावित करता है जब स्वत: तरल इकाइयों वितरण का उपयोग कर agarose के साथ सांसदों की कोटिंग है। हालांकि वितरण इकाई agarose की बीच बढ़िया तालमेल को रोकने के लिए गर्म रखा जा सकता है, वितरण कैसेट और ट्यूबिंग के clogging रोबोट सिस्टम 6 के लिए एक संभावित चिंता का विषय है।

इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने के लिए, हम हाल ही में MCTS संस्कृति 8 के लिए बहुत कुछ में कुछ संशोधनों तैयार कर लिया है। इन संशोधनों मुख्य रूप से उपकरणों का उपयोग कर सांसदों है कि आमतौर पर उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रयोगशालाओं में पाया जाता है से असमान मध्यम नुकसान को रोकने के लिए संभव तरीके पर आधारित हैं। 3 भर में समान आकार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने MCTSes की पीढ़ी के लिए संशोधित बहुत की एक विस्तृत प्रक्रिया84 अच्छी तरह प्लेटें (WPS) यहां प्रस्तुत किया है। पांडुलिपि भी MCTS आकार के मूल्यांकन के लिए एक अर्ध-स्वचालित दिनचर्या प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से आंशिक रूप से विघटित, दवा इलाज MCTSes कि पार के अनुभागीय क्षेत्र की माप के लिए एक स्पष्ट रूप से परिभाषित सीमा नहीं है में।

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Protocol

1. Agarose में लिपटे प्लेटों की तैयारी

  1. कम पिघलने बिंदु agarose की 0.75 ग्राम वजन और सीरम के बिना 100 के लिए इसे जोड़ने मैककॉय के 5 ए मध्यम एमएल के साथ (या फिनोल लाल के बिना)। एक माइक्रोवेव में समाधान हीट और हर 1-2 मिनट ज़ुल्फ़ पूरी तरह से agarose भंग करने के लिए। यह बाँझ समाधान आटोक्लेव।
  2. के बारे में 70 डिग्री सेल्सियस के लिए agarose autoclaved शांत और एक 500 एमएल, 0.22 माइक्रोन फिल्टर एक लामिना का प्रवाह बॉक्स में निर्वात निस्पंदन द्वारा शीर्ष के माध्यम से फिल्टर। 0.75% फ़िल्टर agarose समाधान (एफएएस) छोटी मात्रा में विभाज्य है, तो एक बार में पूरे समाधान का उपयोग नहीं। एक ठंडे कमरे या 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में यह तैयार करने के लिए उपयोग agarose समाधान aseptically स्टोर।
  3. एक प्लास्टिक या एक कोम्बी अभिकर्मक मशीन और एक प्रवाह बॉक्स में 70% इथेनॉल (EtOH) और फिर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ साथ प्रधानमंत्री कैसेट के लिए धातु की इत्तला दे दी वितरण कैसेट के साथ एक छोटी ट्यूब संलग्न।
  4. उपयोग करने से पहले, एफएएस मैं की संग्रहीत विभाज्य गर्मी n माइक्रोवेव यह पिघला। प्रधानमंत्री agarose समाधान और कोट 384 अच्छी तरह से, टिशू कल्चर (टीसी) के साथ वितरण कैसेट एफएएस के 15 μL के साथ microplates -treated "विशेष"। प्लेट में agarose कोशिकाओं बोने से पहले 15-20 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें। स्टोर agarose में लिपटे प्लेटों aseptically, एक ठंडे कमरे में या 4 डिग्री सेल्सियस पर और दूर प्रत्यक्ष प्रकाश से एक पॉलीथीन बैग में लपेटा।
    नोट: 0.75% एफएएस के दोहराया हीटिंग से बचने के शेयर समाधान में agarose की एकाग्रता में एक परिवर्तन को रोकने के लिए। जब उपर्युक्त शर्तों के तहत संग्रहीत agarose में लिपटे प्लेटों अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है। एफएएस प्लेटों की कोटिंग के दौरान हीटिंग की आवश्यकता नहीं है।
  5. 70-80 डिग्री सेल्सियस बाँझ पानी के साथ यह भड़काना कैसेट सुझाव और ट्यूबों में किसी भी शेष agarose को दूर करने के द्वारा वितरण कैसेट साफ करें।

2. सेल संस्कृति और MCTS गठन

  1. संस्कृति मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा HCT116 कोशिकाओं, पहले से वर्णित के रूप मेंलड़की = "xref"> 8।
  2. के agarose में लिपटे, 384 अच्छी तरह से, microplates कोल्ड स्टोरेज से टीसी इलाज अपेक्षित संख्या निकालें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) के लिए उन्हें संतुलित करना।
  3. 70% EtOH और बाँझ पीबीएस के साथ एक मानक ट्यूब वितरण कैसेट भड़काना द्वारा सेल बोने के लिए कोम्बी अभिकर्मक निकालने की मशीन तैयार करें। आवश्यक μL को बोने की मात्रा और निकालने की मशीन पर मैनुअल सेटिंग बटन का प्रयोग करने के माध्यम के वितरण की गति समायोजित करें।
    नोट: पूरे सेल बोने प्रक्रिया बाँझ शर्तों के तहत और एक लामिना का प्रवाह बॉक्स में किया जाता है।
  4. एक पुनः संयोजक सेल-हदबंदी एंजाइम का उपयोग टिशू कल्चर कुप्पी से पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर देना। पूरा मध्यम विकास के 50 μL में 2.5 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्रति एमएल के घनत्व पर बीज कोशिकाओं के साथ एक बाँझ बीकर में एक सेल निलंबन शेयर करें। जब एक से अधिक 384 WP बोने, उन्हें बीकर के नीचे करने के लिए बसने से रोकने के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कोशिकाओं हलचल।
  5. अनुमति देंप्लेटों आरटी पर 30 मिनट के लिए आराम करने के लिए और उसके बाद 4 x जी 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. इस बीच, एक वाष्पीकरण को कम करने के लिए पर्यावरण ढक्कन लेते हैं और छोटी पक्षों में बाँझ एच के 8 मिलीलीटर 2 हे या 5% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के साथ इसे भरने (बाएं और दाएं) एक 5 एमएल पिपेट (चित्रा 1 ए) का उपयोग। सबसे पहले, बाएं तरफ गर्त में पिपेट टिप धीरे-धीरे ऊपर और नीचे व्यापक द्वारा तरल भरने की 4 एमएल बांटना। सही साइड गर्त के साथ इस चरण को दोहराएँ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि तरल पक्ष नली को जोड़ा ढक्कन के केंद्र में विलय नहीं है, और गैस एक्सचेंज (चित्रा 1 ए) के लिए एक अंतर छोड़ दें। ढक्कन के बाहरी और बाद में 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेटों के बाहरी कुओं में एच की एक अतिरिक्त राशि जोड़ना 2 हे परिणाम एच 2 ओ की टपका में।
  7. बाँझ एच 2 ओ के साथ 384 अच्छी तरह से टीसी थाली के तरल जलाशय भरें और तरल भरा पर्यावरण पलकों के साथ नियमित रूप से प्लेट पलकों की जगह (चित्रा 2A)।
  8. 95% आर्द्रता, 5% सीओ 2, और 20% ओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस रोटरी इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस, और कोशिकाओं 4 दिनों के लिए MCTSes में कुल करने के लिए अनुमति देते हैं। आदेश में अचानक छोड़ने से नमी का स्तर को रोकने के लिए बाद के दिनों में भी लंबे समय के लिए इनक्यूबेटर दरवाजा खोलने से बचें।

3. माध्यम एक्सचेंज एक रोबोट प्रणाली का उपयोग

  1. MCTS गठन के अगले दिन 4 पर, अच्छी तरह से एक स्वचालित microplate वॉशर निकालने की मशीन का उपयोग कर प्रति पूर्व गर्म माध्यम के 30 μL जोड़ें। MCTSes अतिरिक्त 3 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दें। जब तक वे प्रयोग के लिए वांछित आकार पाने मध्यम, नियमित रूप से हर 3 दिन बदलें।
  2. अच्छी तरह से प्रत्येक से मध्यम का एक निर्धारित मात्रा निकालना, अनुभव से वॉशर कई गुना के Z -height समायोजित करें। अच्छी तरह से प्रति माध्यम की महाप्राण 30 μL और ताजा, पूर्व गर्म माध्यम के 30 μL के साथ बदलें।
    नोट: वितरण की गति और जिस गति से कई गुना वॉशर नीचे यात्रा सेटन्यूनतम दर पर कुओं में कुओं में अशांति को कम करने के लिए।

MCTS 4. उच्च सामग्री इमेजिंग और अर्ध-स्वचालित छवि विश्लेषण

  1. छवि एक उच्च सामग्री स्वचालित इमेजिंग प्रणाली एक 4X हवा उद्देश्य का उपयोग करने में MCTS (एनए 16)।
  2. सेट 11 एमएस करने के लिए जोखिम समय और 4 x 4 के लिए binning संख्या और जेड -stacks की रिक्ति और पिक्सेल binning के रूप में प्रयोग अच्छी तरह से प्रति एक पूरे MCTS पर कब्जा करने के लिए वांछित समायोजित करें।
  3. में वर्णित "रीडमी," प्रोग्रामिंग भाषा में लिखा एक घर में दिनचर्या का उपयोग कर के रूप में प्रक्रिया, छवियों चरणबद्ध।
    नोट: मीटर कोड और .txt रीडमी फाइलों अनुपूरक कोड फ़ाइलों (चित्रा 1 बी) के रूप में उपलब्ध हैं। दिनचर्या उपायों 2 डी छवियों से MCTS क्षेत्र, बड़े और छोटे कुल्हाड़ियों, परिधि, और दृढ़ता।

आकृति 1
आकृति 1:पर्यावरण पलकों की तैयारी और अर्द्ध स्वचालित दिनचर्या का एक फ़्लोचार्ट। (ए) एक वाष्पीकरण को कम करने के लिए पर्यावरण सही (बाएं) और अतिरिक्त (दाएं) तरल भरने की राशि (यहां, 5% DMSO) के साथ भरा ढक्कन की छवि। तीर तरल जोड़ने के लिए कम-पक्ष गर्त इंगित करता है। तारांकन DMSO की सही मात्रा के अलावा के बाद ढक्कन के बीच में अंतर को दर्शाता है। (बी) अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण दिनचर्या में शामिल कदम दिखा एक कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

मध्यम के असमान हानि, विशेष रूप से परिधीय कुओं से, छोटे संस्कृति संस्करणों के साथ सांसदों में अक्सर सामना करना पड़ा मुद्दा है। इस तरह अच्छी तरह से नियंत्रित तापमान / आर्द्रीकरण सिस्टम और वाष्पीकरण को कम करने के सांसदों और प्लेट पलकों के साथ इन्क्यूबेटरों के रूप में काफी सुधार संस्कृति की स्थिति, कुओं 8 भर माध्यम की महत्वपूर्ण नुकसान को कम। रिश्तेदार वाष्पीकरण मापने के लिए, ऑरेंज जी (ओग) के बराबर मात्रा में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ा गया था, और 3 दिनों में ओग absorbance में परिवर्तन मानक और रोटरी इन्क्यूबेटरों में नियमित रूप से और पर्यावरण पलकों के साथ प्लेट में दर्ज किया गया था। प्लेट कुओं 6 प्लेट (2A चित्रा) के किनारे से उनकी दूरी के आधार पर समूहों में विभाजित किया गया। समूहों 1-4 में, वहाँ एक महत्वपूर्ण एक मानक इनक्यूबेटर (चित्रा 2 बी) में नियमित रूप से पलकों के साथ प्लेट में समय के साथ ओग के absorbance में परिवर्तन किया गया था। हालांकि वहां भी से ओग absorbance में एक बदलाव किया गया थासमूह पर्यावरण ढक्कन / रोटरी इनक्यूबेटर संयोजन (चित्रा 2 सी) के तहत प्लेटों में 1 कुओं, विभिन्नता का गुणांक (सीवी) एक मानक इनक्यूबेटर (चित्रा 2 डी) में नियमित रूप से पलकों के साथ प्लेटों के उन लोगों की तुलना में काफी कम थे।

वाष्पीकरण प्रेरित माध्यम की असमान नुकसान MCTS आकार और सांसदों 8 में परख readout में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता के लिए संभावित कारणों में से एक है। हालांकि, पर्यावरण ढक्कन / रोटरी इनक्यूबेटर संयोजन के साथ 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेटों कुओं के 6 समूहों (चित्रा 2 ई) में एक समान MCTSes के गठन में हुई। इसके विपरीत, नियमित ढक्कन / मानक इनक्यूबेटर संयोजन के साथ प्लेट में MCTSes आकार और दृढ़ता (चित्रा 3F) में काफी भिन्नता है। दृढ़ता और MCTS गोलाई का एक उपाय है और MCTS के विघटन की डिग्री देता है। एक 2 डी क्षेत्र की दृढ़ता सह में पिक्सल के अनुपात में हैब्याज (आरओआई) के क्षेत्र और nvex पतवार रॉय के उत्तल पतवार के क्षेत्र द्वारा रॉय के क्षेत्र को विभाजित करके निर्धारित किया जाता है। दोनों परिपत्र और अण्डाकार क्षेत्रों 1 के एक दृढ़ता है, और के रूप में MCTS विखंडित, दृढ़ता और कम हो जाती है। क्षेत्र में अंतर पहले से ही दास एट अल में सूचना दी गई है। (2016) 8। मात्रा MCTSes की बड़ी और छोटी कुल्हाड़ियों से गणना की गई।

चित्र 2
चित्रा 2: वृद्धि हुई MCTS reproducibility में कम से कम वाष्पीकरण परिणाम के साथ प्लेट। (ए) एक थाली नक्शा 6 समूहों में कुओं के विभाजन को दिखाने के लिए प्रस्तुत किया है। (बी और सी) वहाँ एक महत्वपूर्ण समय पर निर्भर नियमित पलकों (बी) के साथ एक मानक इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत प्लेटों में समूहों 1-4 में कुओं से ओग के सापेक्ष absorbance में भिन्नता है और समूह 1 हम सेएक रोटरी इनक्यूबेटर (सी) में पर्यावरण पलकों के साथ प्लेट में lls। दिन में 3-5 ओग absorbances दिन 0. (डी) के लिए सामान्यीकृत समूह की ओग absorbance के सीवी दिन 3-5 से 1 कुओं दो थाली ढक्कन / इनक्यूबेटर संयोजन के लिए दिखाए जाते औसत रहे हैं। सीवी 3 स्वतंत्र प्रयोगों के औसत हैं। (ई) पर्यावरण ढक्कन / रोटरी इनक्यूबेटर संयोजन के साथ प्लेट में गठित MCTSes कुओं के 6 समूहों में काफी अलग नहीं किया था। (बी) हालांकि, एक मानक इनक्यूबेटर में नियमित रूप से पलकों के साथ प्लेटों चर आकार की MCTSes का गठन किया। डेटा समूह प्रति n> 60 MCTSes के लिए दिखाए जाते हैं। बक्से और boxplots में बक्से के भीतर क्षैतिज सलाखों, 25 वें और 75 वें शतमक और मंझला प्रतिनिधित्व क्रमश। मूंछ 5 वें और 95 वें शतमक का प्रतिनिधित्व करते हैं, और outliers boxplots में गठबंधन काले डॉट्स द्वारा संकेत कर रहे हैं। Kruskal वालिस विश्लेषण के पी मूल्यों पूर्वी वायु कमान के नीचे प्रस्तुत कर रहे हैंज boxplot। आंकड़ों के अनुसार थाली ढक्कन / इनक्यूबेटर संयोजन कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों से कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दिनचर्या के संभावित प्रयोज्यता का निर्धारण करने के लिए, 7 दिन पुरानी MCTSes 3 अलग सांद्रता में Paclitaxel (PTX), विन्क्रिस्टाईन (वीसीआर), oxaliplatin (OXA), डॉक्सोरूबिसिन (DOX), और 5-flurouracil (5-फू) के साथ इलाज किया गया 4 दिनों के लिए। दवाओं विश्वविद्यालय अस्पताल Olomouc, Palacky विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया। MCTS छवियों तो विश्लेषण किया गया है, और क्षेत्र, बड़े और छोटे कुल्हाड़ियों, परिधि, और इलाज MCTSes की दृढ़ता नियंत्रण (CTLs) की तुलना में थे। बड़ी और छोटी कुल्हाड़ियों ज्यामितीय मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। नशीली दवाओं के उपचार (चित्रा 3) के बाद MCTS क्षेत्र में एक एकाग्रता पर निर्भर कमी और मात्रा नहीं थी। हालांकि 0,001 माइक्रोग्राम / एमएल वीसीआर और 0.4 माइक्रोग्राम / एमएल DOX और 5-फू, मात्रा काफी केवल निम्न वृद्धि की गई थी 0.001 माइक्रोग्राम / एमएल वीसीआर MCTS क्षेत्र में वृद्धि हुई। MCTS परिधि केवल PTX, DOX, और 5-फू है, जो पूरी तरह से MCTS आकार प्रभावित के उच्चतम सांद्रता में काफी अलग था। PTX और 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल और 0.06 माइक्रोग्राम / एमएल और DOX और 100 माइक्रोग्राम / एमएल 5-फू पर वीसीआर दृढ़ता में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप, MCTSes (चित्रा 3) का एक पूरा करने वाली आंशिक विघटन का संकेत है।

चित्र तीन
चित्रा 3: अर्द्ध स्वचालित दिनचर्या द्वारा MCTSes में नशीली दवाओं के प्रभाव के उपाय। (ए) सीटीएल और दवा इलाज MCTSes की छवियाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। स्केल बार 10 माइक्रोन =। माइक्रोग्राम / एमएल में सांद्रता प्रत्येक छवि के लिए दिया जाता है। (बी) बार रेखांकन PTX, वीसीआर, OXA, DOX की एक खुराक पर निर्भर प्रभाव दिखाने के लिए, और 5-फू परक्षेत्र और उपचार के 4 दिनों के बाद 7 दिन पुरानी MCTSes की मात्रा। MCTS परिधि में काफी 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल PTX और 100 माइक्रोग्राम / एमएल DOX और 5-फू निम्नलिखित कम हो गई थी। दवा सांद्रता कि MCTSes की पूरी करने वाली आंशिक विघटन के परिणामस्वरूप काफी सीटीएल की तुलना में MCTS दृढ़ता कम हो। डेटा मतलब ± 3 स्वतंत्र प्लेटों से कम से कम 5 MCTSes के एसडी हैं। * पी <0.001, # पी <0.01, φ पी <सीटीएल बनाम 0.05 दवा इलाज, Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से एनोवा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

छानने agarose के साथ 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेट्स कोटिंग

बहुत कुछ में मानक अभ्यास प्लेटें, जो agarose और / या वितरण इकाई की आवश्यकता है agarose 6 के बीच बढ़िया तालमेल को रोकने के लिए गर्म रखा जाना कोट करने के लिए एक 1-1.5% कम पिघलने बिंदु agarose का उपयोग करने के लिए है। agarose की बीच बढ़िया तालमेल जबकि छोटे ट्यूबिंग व्यास में 0.2 और 0.4 के बीच मिमी लेकर छिद्र के साथ तरल वितरण कैसेट का उपयोग कर एकाधिक प्लेटों की तैयारी कर संभावित चिंता का विषय है। वितरण कैसेट clogging के संभावित मुद्दे पर काबू पाने के लिए, 0.75% एफएएस इस्तेमाल किया गया था, के रूप में यह वितरण के दौरान कोई अतिरिक्त हीटिंग की आवश्यकता है। संयोग से, यह भी देखा गया है कि एक 0.75% एफएएस के रूप में तेजी से अनफ़िल्टर्ड 1-1.5%, या भी 0.75%, agarose समाधान के रूप में जेल नहीं है। 0.75% एफएएस का उपयोग करना, यह कम से कम 35 एस कोट करने के लिए एक पूरे 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेट वितरण कैसेट clogging बिना लेता है। कैसेट गर्म पानी के साथ यह भड़काना अवशिष्ट एक दूर करने के लिए अंत में साफ किया जा सकताgarose है, जो सुझाव दिए रोकना सकता जब कैसेट उपयोग में नहीं है।

पर्यावरण ढक्कन और रोटरी इनक्यूबेटर नियमित थाली ढक्कन और इनक्यूबेटर से अधिक

वाष्पीकरण प्रेरित माध्यम की असमान नुकसान काफी वर्दी MCTS गठन के reproducibility को प्रभावित करता है और फलस्वरूप assays 14 के परिणाम समझौता। हैरानी की बात है, पर्यावरण ढक्कन / रोटरी इनक्यूबेटर संयोजन के तहत 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेटों के समूह 1 कुओं ओग absorbance (चित्रा -2) में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बदलाव दिखाया। हालांकि, समूह 1 कुओं में ओग absorbance के एक कम सीवी इंगित करता है कि पर्यावरण पलकों के साथ रोटरी इनक्यूबेटर में 384 अच्छी तरह से टीसी प्लेटों के बाहरी कुओं में वाष्पीकरण के रूप में MCTS विकास (चित्रा 2 डी) को प्रभावित करने के लिए इतना ज्यादा नहीं है। यह समान रूप से आकार पर्यावरण ढक्कन / रोटरी इनक्यूबेटर संयोजन के साथ प्लेट में समूह 1 कुओं में गठन MCTSes से स्पष्ट है। इसके अलावा, हानि कममध्यम से रोकता 384 अच्छी तरह से टीसी पर्यावरण पलकों 8 के साथ रोटरी इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत प्लेटों से दवा assays में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता।

प्रस्तुत कार्यप्रणाली भी कुछ अन्य कैंसर और गैर कैंसर सेल लाइनों 8 की वर्दी MCTSes के गठन में यह परिणाम है। हालांकि, बाद से सभी कोशिकाओं स्वाभाविक एक गैर पक्षपाती सतह पर MCTSes में कुल नहीं कर सकते हैं, इस विधि नहीं कई अन्य सेल लाइनों है कि वर्दी MCTS गठन के reproducibility के लिए परीक्षण नहीं किया गया था के लिए उपयुक्त हो। इसके अतिरिक्त, ध्यान MCTS गठन के reproducibility बढ़ाने के लिए वाष्पीकरण को कम करने के सांसदों और प्लेट पलकों के साथ संयोजन में एक उन्नत प्रौद्योगिकी इनक्यूबेटर के उपयोग पर मुख्य रूप से किया गया था। एक और सस्ते और आसान समाधान MCTS गठन के reproducibility बढ़ाने के लिए भ्रूण ग्रेड खनिज तेल और सांस के उपयोग हो सकता सील टेप या झिल्ली, जो वाष्पीकरण को रोकने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन सामान्य गैस विनिमय 15। हालांकि agarose अतिरिक्त मोटाई नीचे से, जो उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए एक बाधा हो सकती है थाली करने के लिए कहते हैं, प्रेषित प्रकाश इमेजिंग में एक agarose तल द्वारा बनाई क्षेत्र की गहराई MCTS आकार की प्रतीति में बाधा और नशीली दवाओं के उपचार के बाद आकार नहीं है। इसलिए, प्रस्तुत विधि MCTS संस्कृति के बहुत में reproducibility के मुद्दों का सामना करने के लिए शोधकर्ताओं ने संभावित ब्याज की हो जाएगा।

अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण नियमित

देखते हैं हालांकि अर्द्ध स्वचालित / स्वचालित सॉफ्टवेयर MCTS छवि विश्लेषण के लिए उपलब्ध है, पूरा करने वाली आंशिक रूप से विघटित MCTSes के बाद नशीली दवाओं के उपचार के आकार के माप त्रुटियों 16, 17 की संभावना है। प्रस्तुत दिनचर्या के पहले चरण में, सबसे अच्छा केंद्रित छवि स्वचालित रूप से छवि की ढाल के आदर्श कंप्यूटिंग और सबसे बड़ा 0.999 योग्यता के साथ एक का चयन करके Z -stack छवियों के सेट से चयन किया जाता हैntile। यह अधिकतम की एक मजबूत और शोर-असंवेदनशील उपाय है।

अगले, गहरे रंग की सीमाओं उत्पन्न होते हैं और संसाधित छवियों पोर्टेबल नेटवर्क ग्राफ़िक्स प्रारूप में मूल प्रस्ताव में जमा हो जाती है। यह प्रक्रिया एक पूरे 384 अच्छी तरह से, टीसी इलाज प्लेट इमेजिंग, लगभग 100 एमबी से, 2.5 जीबी से कुल आकार कम कर देता है। बाद में, MCTS के केंद्र उपयोगकर्ता परिभाषित त्रिज्या के एक परिपत्र फिल्टर के साथ एक कनवल्शनफ़िल्टर्स के माध्यम से पाया जाता है (चित्रा 4 ए हम 20 पिक्सल का उपयोग करें)। फ़िल्टर छवि का एक स्पष्ट स्थानीय न्यूनतम केंद्र (चित्रा -4 ए) की स्थिति प्रदान करता है। गाढ़ा annuli में इस केंद्र से चल रहा है, मंझला स्केल मूल्य, एम, प्रत्येक खोल में खोल त्रिज्या के एक समारोह के रूप में गणना की जाती है, आर इसके बाद समारोह एम के संख्यात्मक व्युत्पन्न की पहली (पर्याप्त) अधिकतम (आर) है पाया (चित्रा 4 बी)। इस अधिकतम बिंदु एम ऑप्ट इष्टतम सीमा के रूप में लिया जाता है, और छवि s हैइस स्तर पर thresholding द्वारा egmented।

MCTS छवि का सबसे बड़ा Central क्षेत्र के रूप में पहचान की है। यह प्रक्रिया आम तौर पर मानक thresholding तकनीक की तुलना में बेहतर काम करता है क्योंकि यह बिखरने भागों है कि अक्सर दवा उपचार (चित्रा 4C और 4D) से परिणाम से MCTS कोर को अलग करने में सक्षम है। इसके अलावा, यहाँ दृष्टिकोण अपनाया MCTS की गोलाई की अंतर्निहित उपयोग करता है। सरल thresholding दिनचर्या, या एल्गोरिदम सक्रिय आकृति के आधार पर, एक प्राथमिकताओं ज्ञान एक गोलाकार वस्तु पाया जा सकता है कि शोषण नहीं है। MCTS स्पष्ट रूप से पता चला और चित्रित किया जाता है, अधिकतम एम ऑप्ट स्पष्ट और एकल है। दिनचर्या तो इस तरह के क्षेत्र, बड़े और छोटे कुल्हाड़ियों, परिधि, और फिट अंडाकार की दृढ़ता के रूप में MCTS की विशेषताओं, उपायों और खंडों छवि के एक पूर्वावलोकन बचाता है। अधिकतम, स्पष्ट नहीं है और / या एकाधिक स्थानीय Maxima मौजूद हैं, एक पूर्वसुझाव विभाजन के मद्देनजर एक सुधार फ़ोल्डर में सहेजा गया है।

अंत से पहले चरण में, दिनचर्या स्वयं दहलीज ऊपर या नीचे जा रहा है और ब्याज मुखौटा के संभावित अनावश्यक भागों से कट के एक बहुभुज क्षेत्र का चयन करके सुझाव विभाजन समायोजित करने के लिए सुधार फ़ोल्डर के माध्यम से उपयोगकर्ता चलता है। इस मैनुअल सुधार के बाद, दिनचर्या उपायों और जैसा कि ऊपर वर्णित है, MCTS विशेषताओं की बचत होती है।

चित्रा 4
चित्रा 4: छवि विभाजन की प्रक्रिया का चित्रण। (ए) MCTS के केंद्र में एक हरे रंग asterisk के साथ चिह्नित है। वलय का एक उदाहरण लाल रंग में तैयार की है। (ख) प्रत्येक खोल में मंझला स्केल मूल्य खोल त्रिज्या (नीली रेखा) के एक समारोह के रूप में साजिश रची है। इस वक्र के संख्यात्मक व्युत्पन्न गणना की जाती है (लाल रेखा)। पहले पर्याप्त मासंख्यात्मक व्युत्पन्न की ximum (काला तारांकन) पाया जाता है। (सी) MCTS कोर में छवि के परिणामस्वरूप सही विभाजन और बिखरने MCTS भागों के साथ पृष्ठभूमि। (डी) गलत विभाजन Otsu की विधि द्वारा प्राप्त की। 4X उद्देश्य; स्केल बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम शिक्षा, युवा, और खेल (LO1304) के चेक मंत्रालय और चेक गणराज्य की तकनीकी एजेंसी (TE01020028) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों पर्यावरण पलकों की अभी भी छवियों को लेने के लिए डॉ लक्ष्मण वाराणसी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9414 Low-melting
McCOY's 5A Medium Sigma-Aldrich M8403
“rapid” Filtermax filter TPP 99505 0.22 μm, 500 mL
Multidrop™ Combi Reagent Dispenser  Thermo Fisher Scientific 5840300
Small Tube Dispensing cassette  Thermo Fisher Scientific 24073295 Metal tip 
384-well TC plate  PerkinElmer 6057308 Plate type- CellCarrier
Standard Tube Dispensing Cassette Thermo Fisher Scientific 24072670
MicroClime Environmental Lid Labcyte LLS-0310
DMSO Sigma D4540
Rotary Incubator (SteriStore ) HighRes Biosolutions 23641 Serial No.: D00384
Microplate Washer Dispenser  BioTek Unspecified Model: EL406 
High-Content Imaging System (CellVoyager ) Yokogawa Electric Corporation Unspecified Model: CV7000
Orange G New England Biolabs B7022S
TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent Thermo Fisher Scientific 12604021 Phenol red free

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References

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वाष्पीकरण को कम करने के संस्कृति हालत microtiter प्लेट में बहुकोशिकीय उपगोल गठन के reproducibility बढ़ जाती है
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Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (121), e55403, doi:10.3791/55403 (2017).

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