Summary
Den ujevne tap av medium fra mikrotiterplater påvirker reproduserbarheten av ensartet flercellet tumorcelleklump formasjonen. Forbedring av kulturbetingelser for å redusere betydelig medium tap vil forbedre reproduserbarheten av sfæroide formasjon og resultatene av sfæroide baserte analyser ved hjelp av væske-overlegg teknikk.
Abstract
Tumormodeller som tett etterligne in vivo forhold blir stadig mer populært i medisiner og utvikling for screening av potensielle anti-kreft narkotika. Flercellede tumor kuler (MCTSes) effektivt etterligne de fysiologiske betingelsene for solide tumorer, noe som gjør dem utmerket in vitro modeller for bly optimalisering og målet validering. Ut av de forskjellige teknikker som er tilgjengelige for MCTS kultur, væske-overlegg metoden på agarose er en av de mest rimelige metoder for MCTS generasjon. Imidlertid kan pålitelig overføring av MCTS kulturer ved hjelp av væske-overlegg for high-throughput screening bli svekket av en rekke begrensninger, blant annet belegg av mikrotiterplater (MPS) med agarose og ureproduserbarhet av ensartet MCTS formasjon på tvers av brønner. MP'er er vesentlig utsatt for kanteffekter som følge av overdreven fordampning av medium fra utsiden av platen, noe som forhindrer bruken av hele platen for medikamenttester. Dette manuskriptet inneholder detaljerte tekniske forbedringer i væske overlegg teknikk for å øke skalerbarhet og reproduserbarhet av uniform MCTS formasjon. I tillegg detaljer om en enkel, semi-automatisk, og universelt anvendelig verktøy for evaluering av MCTS har etter behandling er presentert.
Introduction
Kreftceller i tumorer er fysiologisk anordnet i en kompleks, 3-dimensjonal (3D) struktur omgitt av ekstracellulær matriks og samvirkende celler. Da nesten alle celler i vev befinner seg i et 3D-miljø, har behovet for mer fysiologisk relevant in vitro tumormodeller som etterligner tumor trekk resulterte i utviklingen av flere 3D-kulturteknikker 1, 2, 3. Disse modellene blir nå de grunnleggende forskning verktøy for å studere rollen til svulsten mikromiljøet på metastase og celle respons på terapeutika i 3D-2. Videre, sammenlignet med to-dimensjonale (2D) cellekulturer 4, 3D-modeller gir mulighet for en bedre forståelse av tumor-stroma interaksjoner, som påvirker cellesignalveier.
Flercellede tumor kuler (MCTSes) av kreftcellelinjer brukes ofte i 3D-celle cruk modeller på grunn av deres relative nærhet til in vivo-tumorer. Ut av flere teknikker som er i bruk, har det væske-overlegg teknikk (LOT) av MCTS generasjon på agarose-belagte plater fått betydelig interesse for bly optimalisering og target validering 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Dette fremgår av de nyere studier som var vellykket i stand til å kjøre pilot skjermer av sammensatte bibliotekene i MCTS kulturer som bruker LOT 6, 7. Men vel å bra variasjon i MCTS morfologi og vekst som følge av fordampning-indusert ujevn tap av medium er vanlige hindringer som følger med MYE hjelp mikrotiterplater (MPS). Følgelig dannelsen av ikke-uniform MCTSes kompromitterer betydning og relevansav data fra farmakologiske forsøk 8, 12, 13. I tillegg til de problemer reproduserbarhet, et annet praktisk problem som påvirker LOT-baserte high-throughput-analyser er belegning av MPS med agarose ved bruk av automatisk væskedispenseringsenheter. Selv om doseringsenheten kan holdes oppvarmet for å hindre gelering av agarose, er tilstopping av tappe kassetten og slangen et potensielt problem for robotsystemer 6.
For å overvinne noen av disse utfordringene, har vi nylig utviklet noen modifikasjoner i mye for MCTS kultur åtte. Disse endringene er i hovedsak basert på mulige måter å forebygge ujevn medium tap fra parlamentsmedlemmene ved bruk av instrumenter som vanligvis finnes i high-throughput screening laboratorier. En detaljert fremgangsmåte av den modifiserte LOT for generering av jevn størrelse og reproduserbare MCTSes på tvers av tre84-brønners plater (WPS) er presentert her. Manuskriptet presenterer også en semi-automatisert rutine for evaluering av MCTS størrelse, særlig i delvis desintegrerte, medikamentbehandlede MCTSes som ikke har et klart definert grense for måling av tverrsnittsarealet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av agarose-belagte plater
- Vei 0,75 g lavt smeltepunkt agarose og legge den til 100 ml McCoys 5A medium (med eller uten fenol rødt) uten serum. Varm løsningen i en mikrobølgeovn og virvle hvert 1-2 min for å løse opp agarose. Autoklaver løsningen å sterilisere den.
- Avkjøl autoklavert agarose til ca. 70 ° C og filtrerer den gjennom en 500 ml, 0,22 um filter topp ved vakuumfiltrering i en laminær strømning boksen. Alikvoter på 0,75% agarose filtrerte oppløsning (FAS) i mindre volumer hvis ikke bruker hele løsningen på en gang. Oppbevar denne klar til bruk agarose løsning aseptisk i et kaldt rom eller 4 ° C kjøleskap i inntil fire uker.
- Fest et lite rør med en plast- eller metall-avsluttet dispensering kassett til en Combi reagentutdeler og prime kassetten med 70% etanol (EtOH) og deretter med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) i en strømning boksen.
- Før bruk varme et lagret delmengde av FAS i n mikrobølgeovn å smelte det. Prime utleverings kassetten med agarose løsning og frakk 384-brønnen, vev kultur (TC) -behandlet "spesielle" mikro med 15 mL av FAS. Tillat agarose i platen avkjøles i 15-20 minutter før utsåing av cellene. Oppbevar agarose-belagte plater aseptisk, innpakket i en polyetylen pose i et kaldt rom eller ved 4 ° C og vekk fra direkte lys.
MERK: Unngå gjentatt oppvarming av den 0,75% FAS for å hindre en endring i konsentrasjonen av agarose i stamløsningen. Agaroseplater-belagte platene kan lagres i opp til 2 uker når den lagres under de ovennevnte betingelser. FAS ikke krever oppvarming under belegging av platene. - Rens utleverings kassetten ved priming med det 70-80 ° C sterilt vann for å fjerne eventuelle gjenværende agarose i kassett tips og rør.
2. Cellekultur og MCTS Formation
- Kultur human colorectal carcinoma HCT116-celler, som beskrevet tidligerelass = "xref"> 8.
- Fjerne det nødvendige antall agarose-overtrukket, 384-brønners, TC-behandlede mikroplater fra kald lagring og likevekt dem til romtemperatur (RT) i 15 minutter.
- Klargjør Combi reagensdispenseren for celle seeding ved priming en standard tube dispense kassett med 70% EtOH og steril PBS. Juster seeding volumet til ønsket mL og utlevering hastigheten til medium ved hjelp av de manuelle innstillingsknappene på dispenseren.
MERK: hele cellen poding prosessen blir utført under sterile betingelser og i en laminær strømning boksen. - Dissosiere adherente celler fra vevkultur-kolbe ved anvendelse av en rekombinant celle-dissosiasjon enzym. Lage en cellesuspensjon lager i et sterilt begerglass med frø-celler ved en tetthet på 2,5 x 10 4 celler / ml per brønn i 50 ul komplett vekstmedium. Ved poding mer enn en 384-WP, røres cellene ved hjelp av en magnetisk rører for å hindre dem i å feste seg til bunnen av begerglasset.
- Tillatplater til hvile i 30 minutter ved romtemperatur og deretter sentrifuger i 15 minutter ved 4 x g.
- I mellomtiden ta en fordampning-reduserende miljø lokk og fylle det med 8 ml sterilt H2O eller 5% dimetylsulfoksyd (DMSO) i kortsidene (venstre og høyre) ved hjelp av en 5 ml pipette (figur 1A). Først dispensere 4 ml fylling væske inn i den venstre side trau ved feiing pipettespissen langsomt opp og ned. Gjenta dette trinnet med den høyre trau.
MERK: Kontroller at væsken lagt til sidedalene ikke flette på midten av lokket, og la et gap for gassutveksling (figur 1A). Tilsetning av et overskudd av H 2 O resulterer i fullstendig fritt for H 2 O til utsiden av lokket og deretter inn i de ytre brønnene på 384-brønners plater TC. - Fylle væskereservoar av den 384-brønners plate TC med sterilt H2O og erstatte den vanlige plate lokkene med de væskefylte miljø lokk (figur 2A).
- Plassere platene i en 37 ° C inkubator roterende med 95% fuktighet, 5% CO2 og 20% O 2, og tillate cellene å samle inn MCTSes i 4 dager. Unngå å åpne døren inkubator for lenge i de påfølgende dager for å forhindre at luftfuktigheten faller brått.
3. Medium Veksling Bruke en Robotic System
- På dag 4 etter MCTS formasjon, legge til 30 mL av forvarmet medium per brønn med en automatisert mikrotiterplatevasker dispenser. La de MCTSes å vokse for ytterligere 3 dager. Bytt medium regelmessig hver 3 dager, før de oppnår ønsket størrelse for eksperimentering.
- Til å suge et definert volum av medium fra hver brønn, empirisk justere z -Høyde av skiven manifolden. Sug 30 mL av medium per brønn og erstatte den med 30 mL av fersk, forvarmet medium.
MERK: Sett dispenserhastigheten og hastigheten som vaskemaskinen manifold reiser nedoveri brønner på den laveste satsen for å minimere turbulens i brønnene.
4. Høy innhold Imaging av MCTS og semi-automatisert bildeanalyse
- Bilde MCTS i et høyt innhold automatisert bildesystem ved hjelp av en 4X luft objektiv (NA 16).
- Still eksponeringstiden til 11 ms og binning til 4 x 4. Juster antall og avstanden mellom z -stacks og pixel binning som ønsket for forsøket å fange en hel MCTS per brønn.
- Behandle bilder trinnvis, slik det er beskrevet i "readme" ved hjelp av en in-house rutine skrevet i programmeringsspråket.
MERK: BFD kode og .txt readme-filer er tilgjengelig som tilleggskode filer (Figur 1b). De rutinemessige tiltak MCTS området, store og små økser, perimeter, og soliditet fra 2D-bilder.
Figur 1:Fremstilling av miljø lokk og et flytskjema over den semi-automatiske rutine. (A) Bilde av en fordampning reduserende miljø lokk fylt med riktig (til venstre) og overskudd (til høyre) mengde fylle væske (her, 5% DMSO). Pilen angir kortside trau for tilsetning av væske. Stjernen viser hull i midten av lokket etter tilsetning av riktig mengde DMSO. (B) En arbeidsflyt som viser trinnene som er involvert i den semi-automatisert bildeanalyse rutine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ujevne tap av medium, særlig fra perifere brønner, er en ofte spurte spørsmål i parlamentsmedlemmer med små kulturvolumer. Vesentlig forbedrede dyrkningsbetingelser, som for eksempel inkubatorer med godt kontrollert temperatur / fuktesystemer og fordampning reduserende MP'er samt tallerken lokk, reduserer signifikant tap av medium på tvers av brønner 8. For å måle den relative fordamping, ble like volumer av Orange G (OG) tilsatt til hver brønn, og forandringen i absorbans OG over 3 dager ble tatt opp i plater med regelmessige og miljømessige lokk i standard og roterende inkubatorer. Plate brønner ble delt inn i 6 grupper, basert på deres avstand fra kanten av platen (figur 2A). I grupper 1-4, var det en signifikant endring i absorbansen til OG over tid i form av plater med vanlige lokk i en standard inkubator (figur 2B). Selv om det var også en variasjon i OG absorbans fragruppe 1 brønner i plater under miljø lokket / rotasjonsinkubator kombinasjon (figur 2C), er variasjonskoeffisient (CVS) var mye lavere sammenlignet med de av platene med vanlige lokk i en standard inkubator (figur 2D).
Fordampningen-indusert ujevn tap av medium er en av de mulige årsaker til godt å vel variasjon i MCTS størrelse og analyse avlesning i parlamentsmedlemmer 8. Imidlertid 384-brønns plater med TC miljø lokk / rotasjonsinkubator kombinasjonen resulterte i dannelsen av ensartede MCTSes på tvers av de 6 gruppene av brønner (figur 2E). I kontrast, MCTSes i plater med vanlig lokk / standard inkubator kombinasjon varierer betydelig i størrelse og (figur 3F) soliditet. Soliditet er et mål på MCTS sphericity og gir graden av oppløsningen av MCTS. Soliditet av en 2D-regionen er andelen av pikslene i convex skrog av regionen av interesse (ROI) og bestemmes ved å dividere arealet av avkastningen ved arealet av den konvekse skroget av ROI. Både runde og elliptiske regioner har en soliditet på 1, og som MCTS går i oppløsning, reduserer soliditet. Forskjellen i areal allerede er blitt rapportert i Das et al. (2016) 8. Volumet ble beregnet ut fra de store og små akser MCTSes.
Figur 2: Plater med minimal fordampning resultat i økt MCTS reproduserbarhet. (A) En plate kart er presentert for å vise fordelingen av brønner inn i 6 grupper. (B og C) det er en betydelig tidsavhengig variasjon i den relative absorbansen OG fra brønner i gruppene 1-4 i form av plater dyrket i en standard inkubator med vanlige lokk (B) og fra gruppe 1 vills i form av plater med miljø lokk på en rotasjonsinkubator (C). Dag 3-5 OG absorbansen er normalisert til dag 0. (D) i gjennomsnitt CV OG absorbans av gruppe 1 brønner fra dagene 3-5 er vist for de to platelokk / inkubator kombinasjoner. CV er gjennomsnitt av 3 uavhengige eksperimenter. (E) MCTSes dannet i platene med miljølokk / roterende inkubator kombinasjon avvek ikke signifikant over 6 grupper av brønner. (B) Men plater med jevne lokk i en standard inkubator dannet MCTSes av varierende størrelse. Data er vist for n> 60 MCTSes per gruppe. Boksene og vannrette streker innenfor boksene i boksplott, er de 25 th og 75 th persentiler og median, henholdsvis. Værhårene representerer de fem th og 95 th percentil, og uteliggere er indikert med de flukt svarte prikker i boksplott. P-verdier av Kruskal-Wallis analyse presenteres nedenfor each boxplot. Dataene er fra minst 3 uavhengige eksperimenter per plate lokk / inkubator kombinasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å bestemme den potensielle anvendelsen av rutinen, var 7 dager gamle MCTSes behandlet med paclitaxel (PTX), vinkristin (VCR), oksaliplatin (OXA), doxorubicin (DOX), og 5-flurouracil (5-FU) på 3 forskjellige konsentrasjoner i 4 dager. Stoffet er hentet fra Universitetssykehuset Olomouc, Palacky University. MCTS bildene ble deretter analysert, og området, store og små økser, omkrets, og soliditet av behandlede MCTSes ble sammenlignet med kontroller (CTL). De store og små aksene ble anvendt for å beregne den geometriske volum. Det var en konsentrasjonsavhengig reduksjon i MCTS areal og volum etter medikamentbehandling (figur 3). Selv 0,001 ug / mL VCR og 0,4 mikrogram / ml DOX og 5-FU resulterte i økning i MCTS område, volumet ble signifikant øket bare følgende 0,001 ug / mL VCR. MCTS omkretsen var signifikant forskjellig bare på de høyeste konsentrasjonene av PTX, DOX, og 5-FU, som fullstendig påvirket MCTS størrelse. PTX og VCR på 0,25 mikrogram / ml og 0,06 pg / ml og DOX og 5-FU ved 100 pg / ml resulterte i en betydelig reduksjon i fasthet, noe som indikerer en fullstendig til delvis nedbrytning av de MCTSes (figur 3).
Figur 3: Mål av narkotika effekter i MCTSes ved semi-automatisert rutine. (A) Bilder av CTL og medikamentbehandlede MCTSes presenteres. Scale bar = 10 mikrometer. Konsentrasjoner i mg / ml er gitt for hvert bilde. (B) De søylediagram viser en doseavhengig effekt av PTX, videospiller, OXA, DOX, og 5-FU påareal og volum av 7 dager gammel MCTSes etter 4 dagers behandling. MCTS utkant ble signifikant redusert etter 0,25 mg / ml PTX og 100 mikrogram / ml DOX og 5-FU. Medikamentkonsentrasjoner som resulterte i fullstendig til delvis oppløsning av MCTSes betydelig redusert MCTS soliditet i forhold til CTL. Dataene er gjennomsnitt ± SD av minst 5 MCTSes fra 3 uavhengige plater. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 medikamentbehandlede versus CTL, en-veis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenligningstest. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belegg 384-Well TC plater med filtrert Agarose
Den standard praksis i LOT er å bruke en 1-1,5% lavt smeltepunkt agarose for å belegge platene, som krever agarose og / eller dispenseringsenhet som skal holdes oppvarmet for å hindre geldannelse av agarose 6. Den gelering av agarose er av potensiell interesse, mens fremstilling av flere plater ved hjelp av væskedispenserende kassetter med små åpninger rør som strekker seg mellom 0,2 og 0,4 mm i diameter. For å overvinne den potensielt problem for tilstopping utleverings kassetter, ble 0,75% FAS brukt, da det krever ingen ekstra oppvarming om utlevering. For øvrig ble det også observert at en 0,75% FAS ikke gel så hurtig som ufiltrert 1-1,5%, eller til og med 0,75% agarose oppløsning. Ved å bruke 0,75% FAS, tar det mindre enn 35 s for å belegge en hel 384-brønners plate TC uten å tette utleverings kassetten. Kassetten kan rengjøres på slutten av priming det med oppvarmet vann for å fjerne rester av engarose, som kan tette tips når kassetten ikke er i bruk.
Miljø Lid og Rotary Inkubator over vanlige Plate Lid og Inkubator
Fordampningen-indusert ujevn tap av medium påvirker betydelig reproduserbarheten av uniform MCTS dannelse og dermed kompromisser utfallet av analysene 14. Overraskende, gruppe 1 brønnene i 384-brønns plater TC under miljø lokket / rotasjonsinkubator kombinasjon viste en statistisk signifikant variasjon i OG absorbans (figur 2C). Imidlertid er en lav CV av OG absorbans i gruppe 1 brønner indikerer at fordampningen i de ytre brønnene på 384-brønners plater TC i rotasjons inkubator med miljø lokk er ikke så stor at det påvirker MCTS vekst (figur 2D). Dette fremgår av de jevnstore MCTSes dannet i gruppe 1 brønner i plater med miljø lokk / rotasjonsinkubator kombinasjon. Også redusert tapmiddels hindrer vel å bra variasjon i legemiddelanalyser fra 384-brønnen TC plater dyrket i den roterende inkubator med miljølokk 8.
Den presenterte metode resulterer også i dannelsen av ensartede MCTSes av noen annen kreft og ikke-cancerøse cellelinjer 8. Imidlertid, siden alle celler som ikke kan iboende aggregere til MCTSes på en ikke-klebende overflate, denne metoden mange ikke være egnet for andre cellelinjer som ikke ble testet for reproduserbarheten av uniform MCTS formasjonen. I tillegg ble det fokusert hovedsakelig på bruk av et avansert teknologi-inkubator i kombinasjon med fordampningstrinn reduserende MP'er samt tallerken lokk for å øke reproduserbarheten av MCTS formasjonen. En annen billig og enkel løsning for å øke reproduserbarheten av MCTS dannelse kan være bruk av embryo-grade mineralolje og pustende tette bånd eller membraner, som hindrer fordamping men tillate normal gassutveksling 15. Selv agarose gir ekstra tykkelse til plate bunner, som kan være en barriere for høyt innhold bildebehandling, gjør dybdeskarphet skapt av en agarose bunn i overført lys avbildning ikke til hinder for konstatering av MCTS størrelse og form etter behandling. Derfor vil presenteres metoden være av potensiell interesse for forskere som vender reproduserbarhet problemer i mye av MCTS kultur.
Semi-automatisert bildeanalyse Rutine
Selv om det er mange halvautomatisk / automatisert programvare som er tilgjengelig for MCTS bildeanalyse, måling av størrelsen på komp til delvis desintegrerte MCTSes etter medikamentbehandling er utsatt for feil 16, 17. I det første trinnet i fremlagt rutine, er det beste fokuserte bildet automatisk valgt fra settet av z -stack bilder ved å beregne normen på graderingen av bildet og velge den med den største 0,999 quantile. Dette er en robust og støy-insensitive mål for det maksimale.
Deretter blir de mørkere grenser beskåret og de behandlede bilder blir lagret på den opprinnelige oppløsningen i Portable Network Graphics format. Denne prosessen reduserer den totale størrelsen fra 2,5 GB, fra å avbilde en hel 384-brønn, TC-behandlede plate, til omtrent 100 MB. Deretter blir midten av MCTS funnet gjennom en konvolusjon med et sirkulært filter av brukerdefinert område (vi bruker 20 piksler, figur 4A). En klar lokalt minimum av den filtrerte bilde gir posisjonen til midten (figur 4A). Beveger seg fra dette sentrum i konsentriske ringrom, er median gråskalaverdi, M, i hvert skall beregnes som en funksjon av radien skallet, R. Deretter blir den første (faste) maksimum av den numeriske deriverte av funksjonen M (R) funnet (Figur 4B). Poenget M OPT av denne maksimale er tatt som den optimale terskelen, og bildet er segmented av thresholding på dette nivået.
Den MCTS er identifisert som den største sentrale delen av bildet. Denne prosedyren vanligvis fungerer bedre enn standard terskel teknikken fordi det er i stand til å skille MCTS kjernen fra toppløs deler som ofte skyldes medikamentell behandling (figur 4C og 4D). Videre tilnærmingen her gjør implisitt bruk av sphericity av MCTS. Enkle Terskelverdier rutiner, eller algoritmer basert på aktive konturer, ikke utnytte a priori kunnskap som en sfærisk objekt er å bli funnet. Når MCTS er klart påvist og avgrenset, er den maksimale M OPT klart og enkelt. Rutinen måler deretter egenskapene til MCTS, for eksempel området, store og små akser, omkrets, og soliditet montert ellipse, og sparer en forhåndsvisning av det segmenterte bildet. Hvis maksimalt er ikke klart, og / eller hvis flere lokale maksima er til stede, en presyn på den foreslåtte segmentering blir lagret i en korreksjon mappe.
I den nest siste trinn, går rutinen brukeren gjennom korreksjonen mappen for å justere den foreslåtte segmentering manuelt ved å flytte terskelen opp eller ned og velge en mangekantet region av interesse å avskjære eventuelle overflødige deler av masken. Etter denne håndboken korreksjon, de rutinemessige tiltak og lagrer MCTS egenskaper, som beskrevet ovenfor.
Figur 4: Illustrasjon av bildet segmentering prosedyre. (A) I sentrum av den MCTS er merket med en grønn stjerne. Et eksempel på det ringformede rom er trukket i rødt. (B) Median gråskalaverdi i hvert skall er plottet som en funksjon av skallet radius (blå linje). Den numeriske deriverte av denne kurve er beregnet (rød linje). Den første betydelige maximum av den numeriske deriverte er funnet (svart stjerne). (C) Den resulterende riktig segmentering av bildet inn i MCTS kjernen og bakgrunn med de disintegrerende MCTS delene. (D) Feil segmentering oppnådd ved Otsu metode. 4X mål; Scale bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den tsjekkiske Ministry of Education, Youth og Sport (LO1304) og Teknologisk Agency i Tsjekkia (TE01020028). Forfatterne ønsker å takke dr Lakshman Varanasi for å ta stillbilder av miljølokk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
