Summary
Den ujævne tab af medium fra mikrotiterplader påvirker reproducerbarheden af ensartet flercellede tumor klumpformet dannelse. Forbedring dyrkningsbetingelser til at reducere væsentlig medium tab vil forbedre reproducerbarheden af sfæroid dannelse og resultaterne af sfæroid assays under anvendelse af flydende-overlay teknik.
Abstract
Tumor modeller, der nøje efterligner in vivo forhold bliver stadig mere populære i lægemiddelforskning og udvikling til screening af potentielle anti-cancer medicin. Multicellulære tumor sfæroider (MCTSes) effektivt efterligne de fysiologiske betingelser i faste tumorer, hvilket gør dem fremragende in vitro modeller for bly optimering og målvalidering. Ud af de forskellige teknikker til rådighed for MCTS kultur, væske-overlay metode på agarose er en af de mest billige metoder til MCTS generation. Imidlertid kan den pålidelige overdragelse af MCTS kulturer under anvendelse væske-overlay for high-throughput screening blive kompromitteret af en række begrænsninger, herunder belægning af mikrotiterplader (MP) med agarose og irreproducibility af ensartet MCTS dannelse tværs brønde. MP'er er betydeligt tilbøjelige til randeffekter, der skyldes for kraftig fordampning af medium fra det ydre af pladen, hvilket forhindrer brugen af hele pladen til lægemiddeltests. Dette håndskrift indeholder detaljerede tekniske forbedringer af væske-overlay teknik til at øge skalerbarheden og reproducerbarhed af ensartet MCTS dannelse. Derudover detaljer om en simpel, semi-automatisk, og universelt anvendelig softwareværktøj til evaluering af MCTS funktioner efter lægemiddelbehandling præsenteres.
Introduction
Kræftceller i tumorer er fysiologisk anbragt i en kompleks, 3-dimensional (3D) struktur omgivet af ekstracellulær matrix og interagerende celler. Som næsten alle celler i væv opholde sig i en 3D-miljø, er behovet for mere fysiologisk relevant in vitro tumormodeller der efterligner tumor træk resulteret i udviklingen af en række 3D dyrkningsteknikker 1, 2, 3. Disse modeller er nu ved at blive grundforskning værktøjer til undersøgelser af betydningen af tumormikromiljøet på metastase og celle respons på terapeutiske midler i 3D 2. Endvidere sammenlignet med 2-dimensionale (2D) cellekulturer 4, 3D-modeller giver mulighed for en bedre forståelse af tumor-stroma-interaktioner, som påvirker celle signalveje.
Flercellede tumor sfæroider (MCTSes) af cancer cellelinjer anvendes hyppigt i 3D celle cturprodukter modeller grund af deres relative nærhed til in vivo tumorer. Ud af de mange teknikker i brug, har den flydende-overlay teknik (LOT), i MCTS generation på agarose-belagte plader opnået betydelig interesse for bly optimering og målvalidering 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Dette fremgår af de seneste undersøgelser, der var held i stand til at køre pilot skærme af sammensatte biblioteker i MCTS kulturer ved hjælp af LOT 6, 7. Men godt-til-brønd variabiliteten i MCTS morfologi og vækst som følge af fordampning-induceret ujævn tab af medium er almindelige forhindringer, der ledsager LOT hjælp mikrotiterplader (parlamentsmedlemmer). Følgelig er dannelsen af uensartet MCTSes kompromitterer betydningen og relevansenaf data fra farmakologiske assays 8, 12, 13. Ud over de reproducerbarhed spørgsmål, en anden praktisk problem, der påvirker LOT-baserede high-throughput assays er coatingen af MP'er med agarose når bruger automatisk væskedispenserende enheder. Selv dispenseringsenheden kan holdes opvarmet for at forhindre gelering af agarose, tilstopning af dispenser kassette og slange er et potentielt problem for robotsystemer 6.
For at overvinde nogle af disse udfordringer, har vi for nylig udviklet et par ændringer i partiet for MCTS kultur 8. Disse ændringer er hovedsagelig baseret på mulige måder at forhindre ujævn medium tab fra parlamentsmedlemmer bruger instrumenter, som er almindeligt forekommende i high-throughput screening laboratorier. En detaljeret procedure af den modificerede LOT til generering af ensartet størrelse og reproducerbare MCTSes tværs 384-brønds plader (WPS) præsenteres her. Manuskriptet præsenterer også en semi-automatiseret rutine for evaluering af MCTS størrelse, især i delvis nedbrudt, lægemiddelbehandlede MCTSes, der ikke har en klart defineret grænse for måling af tværsnitsarealet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af agarose-overtrukne plader
- Afvej 0,75 g af lav-smeltepunkt agarose og føje den til 100 ml McCoys 5A-medium (med eller uden phenolrødt) uden serum. Opvarm opløsningen i en mikrobølgeovn og swirl hver 1-2 min for at opløse agarosen. Autoklaver opløsningen at sterilisere den.
- Afkøl autoklaveret agarose til ca. 70 ° C og filtrere det gennem en 500 ml, 0,22 um filter top ved vakuumfiltrering i en laminar strømning boks. Alikvot den 0,75% filtrerede agaroseopløsning (FAS) i mindre mængder, hvis ikke bruger hele løsningen på en gang. Gemme denne klar-til-brug agaroseopløsning aseptisk i et koldt rum eller 4 ° C køleskab i op til 4 uger.
- Vedhæfte et lille rør med en plast- eller metal-spids dispensering kassette til en Combi reagens dispenser og prime kassetten med 70% ethanol (EtOH) og derefter med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) i en strøm boks.
- Før anvendelse opvarme en lagret alikvot af FAS i n mikrobølge at smelte den. Prime den dispensering kassette med agaroseopløsning og pels 384-godt, vævskultur (TC) -behandlede "særlige" mikroplader med 15 pi FAS. Tillad agarose i pladen afkøle i 15-20 min før podning af cellerne. Opbevar agarose-coatede plader aseptisk indpakket i en polyethylenpose i et koldt rum eller ved 4 ° C og væk fra direkte lys.
BEMÆRK: Undgå gentagne opvarmning af 0,75% FAS at forhindre en ændring i koncentrationen af agarose i stamopløsningen. Agarose-belagte plader kan opbevares i op til 2 uger, når det opbevares under de ovennævnte betingelser. FAS kræver ikke opvarmning under coatingen af plader. - Rengør dispensering kassetten ved at prime den med 70-80 ° C sterilt vand for at fjerne eventuel resterende agarose i kassetten tips og rør.
2. Cell Culture og MCTS Formation
- Kultur humane kolorektal carcinom HCT116-celler, som tidligere beskrevetlass = "xref"> 8.
- Fjern det nødvendige antal agarose-coatet, 384-brønds, TC-behandlet mikroplader fra kold opbevaring og ækvilibrering dem til stuetemperatur (RT) i 15 min.
- Forbered Combi reagens dispenser til celle såning ved priming en standard rør dispensering kassette med 70% EtOH og sterilt PBS. Juster seeding lydstyrken til det ønskede uL og dispensering hastighed til medium ved hjælp af manuel indstilling knapper på dispenseren.
BEMÆRK: Hele cellepodning processen udføres under sterile betingelser og i en laminar strømning boks. - Dissociere adhærente celler fra vævskultur kolbe under anvendelse af en rekombinant celle-dissociation enzym. Foretag en cellesuspension stamopløsning i et sterilt bægerglas med frø celler ved en densitet på 2,5 x 10 4 celler / ml per brønd i 50 pi komplet vækstmedium. Når podning mere end en 384-WP, rør cellerne under anvendelse af en magnetisk omrører for at forhindre dem i at sætte sig på bunden af bægerglasset.
- Tilladplader til at hvile i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres i 15 min ved 4 x g.
- I mellemtiden, tage en miljømæssig låg fordampning-reducerende og fyld den med 8 ml sterilt H2O eller 5% dimethylsulfoxid (DMSO) i de korte sider (venstre og højre) ved anvendelse af en 5 ml pipette (figur 1A). Først dispensere 4 ml fylde væske i den venstre trug ved at feje pipettespidsen langsomt op og ned. Gentag dette trin med den højre side truget.
BEMÆRK: Sørg for, at væsken tilføjes siderenderne ikke fusionere i midten af låget, og efterlade et hul for gasudveksling (figur 1A). Tilsætning af en overskydende mængde af H2O resulterer i udsivning af H2O til det ydre af låget og efterfølgende i de ydre brønde på 384-brønds TC plader. - Fyld væskereservoir af 384 brønde TC plade med sterilt H2O og erstatte de regulære plade låg med de væskefyldte miljømæssige låg (Figur 2A).
- Placer pladerne i en 37 ° C roterende inkubator med 95% fugtighed, 5% CO2 og 20% O2, og lade cellerne aggregere til MCTSes i 4 dage. Undgå at åbne inkubator døren for længe i de efterfølgende dage for at forhindre fugtighedsniveauet i at falde brat.
3. Medium Exchange Brug af en robotsystem
- På dag 4 efter MCTS dannelse, tilsættes 30 pi forvarmet medium per brønd under anvendelse af en automatiseret mikropladevasker dispenser. Tillade MCTSes til at vokse i yderligere 3 dage. Udskift mediet regelmæssigt hver 3 dage, indtil de opnår den ønskede størrelse til eksperimenter.
- At aspirere et defineret volumen af medium fra hver brønd, empirisk justere z -Højde af vaskemaskinen manifold. Aspirér 30 pi medium per brønd og erstatte det med 30 pi frisk, forvarmet medium.
BEMÆRK: Indstil dispensering hastighed og den hastighed, hvormed skiven manifold bevæger sig nedi brønde på den laveste sats for at minimere turbulens i brøndene.
4. High-indhold Imaging af MCTS og Semi-automatiske billedanalyse
- Billede MCTS i en højt indhold automatiseret billeddannelsessystem anvendelse af en 4X luft mål (NA 16).
- Indstil eksponeringen tid til 11 ms og binning til 4 x 4. Juster antallet og afstanden mellem z -stacks og pixel binning som ønsket for eksperimentet at fange en hel MCTS per brønd.
- Behandle billeder trinvis, som beskrevet i "readme," ved hjælp af en in-house rutine skrevet i programmeringssprog.
BEMÆRK: .m kode og .txt Vigtigt-filer er tilgængelige som supplerende kode filer (Figur 1B). De rutinemæssige foranstaltninger MCTS området, større og mindre akser, perimeter, og soliditet fra 2D-billeder.
Figur 1:Udarbejdelse af miljø- låg og et flowchart af det semi-automatiske rutine. (A) Billede af en fordampning-reducerende miljø låg fyldt med den korrekte (til venstre) og overskydende (højre) mængde fylde væske (her, 5% DMSO). Pilen angiver den korte side trug til tilsætning af væske. Asterisken viser hullet i midten af låget efter tilsætning af den korrekte mængde DMSO. (B) En arbejdsgang viser trinene, der er involveret i halvautomatiseret billedanalyse rutine. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ujævne tab af medium, især fra perifere brønde, er en ofte stødt problem i parlamentsmedlemmer med små mængder kultur. Væsentligt forbedrede dyrkningsbetingelser, såsom væksthuse med velkontrollerede temperatur / befugtningsanlæg og fordampning-reducerende parlamentsmedlemmer og plade låg, reducere betydeligt tab af medium tværs brønde 8. For at måle den relative fordampning, blev lige store volumener Orange G (OG) til hver brønd, og ændringen i OL absorbans over 3 dage blev indspillet i plader med regelmæssige og miljømæssige låg i standard og roterende inkubatorer. Plade brønde blev opdelt i 6 grupper baseret på deres afstand fra kanten af pladen (figur 2A). I gruppe 1-4, var der en signifikant ændring i absorbans OG over tid i plader med regelmæssige låg i en standard inkubator (figur 2B). Selv om der var også en variation i OL absorbans fragruppe 1 brønde i plader under miljømæssige låg / roterende inkubator kombination (Figur 2C), variationskoefficienterne (CVS) var meget lavere sammenlignet med dem af pladerne med regelmæssige låg i en standard inkubator (figur 2D).
Fordampningen-induceret ujævn tab af medium er en af de mulige årsager til godt-til-brønd variation i MCTS størrelse og assay udlæsning i parlamentsmedlemmer 8. Men 384-brønds TC plader med de miljømæssige låg / roterende inkubator kombination resulterede i dannelsen af ensartede MCTSes tværs af de 6 grupper af brønde (Figur 2E). I modsætning hertil MCTSes i plader med den almindelige låg / standard inkubator kombination varierer betydeligt i størrelse og soliditet (figur 3F). Soliditet er et mål for MCTS kugleform og giver graden af opløsningen af MCTS. Soliditeten af en 2D region er den del af pixels i convex skrog regionen af interesse (ROI) og bestemmes ved at dividere arealet af ROI med arealet af den konvekse skrog ROI. Både cirkulære og elliptiske regioner har en soliditet på 1, og som MCTS opløses, formindsker soliditet. Forskellen i området er allerede blevet rapporteret i Das et al. (2016) 8. Volumen blev beregnet ud fra de større og mindre akser MCTSes.
Figur 2: Plader med minimal fordampning resultat i øget MCTS reproducerbarhed. (A) En plade kort præsenteres for at vise fordelingen af brønde i 6 grupper. (B og C) Der er en betydelig tidsafhængig variation i den relative absorbans OG fra brønde i grupper 1-4 i plader dyrket i et standard inkubator med regelmæssige låg (B) og fra gruppe 1 viLLS i plader med miljømæssige låg i en roterende inkubator (C). Dag 3-5 OL absorbanser normaliseres til dag 0. (D) i gennemsnit CV for OL absorbansen af gruppe 1 brønde fra dag 3-5 er vist for de to plade låg / inkubator kombinationer. CV'er er gennemsnit af 3 uafhængige forsøg. (E) MCTSes dannet i plader med den miljømæssige låg / roterende inkubator kombination adskilte sig ikke væsentligt på tværs af de 6 grupper af brønde. (B) Dog plader med regelmæssige låg i en standard inkubator dannet MCTSes af forskellig størrelse. Data er vist for n> 60 MCTSes per gruppe. Kasserne og vandrette barer inden kasserne i boxplots repræsenterer de 25 th og 75 th percentiler og median hhv. De whiskers repræsenterer 5. og 95 percentil, og de afvigende værdier er angivet med de flugtende sorte prikker i boxplots. P-værdierne af Kruskal-Wallis-analyse præsenteres nedenfor each boxplot. Dataene er fra mindst 3 uafhængige forsøg per plade låg / inkubator kombination. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at bestemme den potentielle anvendelighed af rutinen, var 7 dage gamle MCTSes behandlet med paclitaxel (PTX), vincristin (VCR), oxaliplatin (OXA), doxorubicin (DOX), og 5-fluoruracil (5-FU) ved 3 forskellige koncentrationer i 4 dage. Lægemidlerne blev opnået fra University Hospital Olomouc, Palacky Universitet. MCTS billeder blev derefter analyseret, og området, større og mindre akser, perimeter, og holdbarheden af behandlede MCTSes blev sammenlignet med kontroller (CTL'er). De større og mindre akser blev anvendt til at beregne den geometriske volumen. Der var en koncentrationsafhængig formindskelse i MCTS areal og volumen efter behandling lægemiddel (figur 3). Selvom 0,001 ug / ml VCR og 0,4 mikrogram / ml DOX og 5-FU medførte stigning i MCTS område, mængden var signifikant forøget først efter 0,001 mg / ml VCR. MCTS perimeter var signifikant forskellige kun på de højeste koncentrationer af PTX, DOX, og 5-FU, som helt påvirket MCTS størrelse. PTX og VCR ved 0,25 ug / ml og 0,06 pg / ml og DOX og 5-FU ved 100 ug / ml resulterede i et signifikant fald i soliditet, hvilket indikerer en komplet-til-partiel desintegration af MCTSes (figur 3).
Figur 3: Måling af lægemiddelvirkninger i MCTSes ved semi-automatiske rutine. (A) Billeder af CTL og lægemiddelbehandlede MCTSes præsenteres. Scale bar = 10 um. Koncentrationer i ug / ml er givet for hvert billede. (B) De søjlediagrammer viser en dosisafhængig effekt af PTX, VCR, OXA, DOX, og 5-FU påområde og volumen på 7 daggamle MCTSes efter 4 dages behandling. MCTS perimetre blev væsentligt reduceret efter 0,25 mikrogram / ml PTX og 100 mikrogram / ml DOX og 5-FU. Drug-koncentrationer, der resulterede i det komplette-til-en delvis opløsning af MCTSes betydeligt reduceret MCTS soliditet i forhold til CTL. Dataene er gennemsnittet ± SD af mindst 5 MCTSes 3 uafhængige plader. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 lægemiddel-behandlede versus CTL, envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Coating 384-Well TC plader med Filtreret Agarose
Den normale praksis i LOT er at anvende en 1-1,5% lavt smeltepunkt agarose at overtrække pladerne, hvilket kræver agarose og / eller dispenseringsindretning, der skal holdes opvarmet for at forhindre gelering af agarose 6. Den geldannende af agarose er potentielt problematiske samtidig forbereder flere plader under anvendelse af flydende udlevering kassetter med små slanger åbninger på mellem 0,2 og 0,4 mm i diameter. For at overvinde det potentielle problem for tilstopning udleveringsmedlemsstaten kassetter, blev 0,75% FAS anvendes, da det kræver ingen yderligere opvarmning under dispensering. I øvrigt blev det også observeret, at en 0,75% FAS ikke gelerer så hurtigt som ufiltreret 1-1,5% eller endog 0,75%, agaroseopløsning. Brug af 0,75% FAS, det tager mindre end 35 s at belægge en hel 384-brønds TC plade uden tilstopning udleveringen kassetten. Kassetten kan rengøres ved enden ved at prime den med opvarmet vand for at fjerne resterende agarose, som kunne tilstoppe spidserne når kassetten ikke er i brug.
Miljø Låg og Rotary Incubator løbet Regelmæssig Plate Låg og Incubator
Fordampningen-induceret ujævn tab af medium påvirker væsentligt reproducerbarheden af ensartede MCTS dannelse og dermed kompromitterer resultatet af analyserne 14. Overraskende, gruppe 1 brønde på 384-brønds TC-plader under de miljømæssige låg / roterende inkubator kombination viste en statistisk signifikant variation i OL absorbans (Figur 2C). En lav CV OG absorbans i gruppe 1 brønde viser dog, at fordampningen i de ydre brønde på 384-brønd TC plader i den roterende inkubator med miljømæssige låg er ikke så kraftig, at det påvirker MCTS vækst (figur 2D). Dette fremgår tydeligt af ensartet størrelse MCTSes dannet i gruppe 1 brønde i plader med den miljømæssige låg / roterende inkubator kombination. Også reduceret tabaf medium forhindrer velhavende godt variation i narkotika analyser fra 384-brønds TC plader dyrket i roterende inkubator med miljømæssige låg 8.
Den præsenterede metode resulterer også i dannelse af ensartede MCTSes af et par andre kræft og ikke-kræft cellelinier 8. Da alle celler i sagens natur ikke kan aggregere til MCTSes på en ikke-klæbende overflade, denne metode mange ikke være egnet til andre cellelinier, som ikke blev testet for reproducerbarheden af ensartet MCTS formation. Derudover var fokus primært på brugen af en avanceret teknologi inkubator i kombination med fordampning-reducerende parlamentsmedlemmer og plade låg til at øge reproducerbarheden af MCTS dannelse. En anden billig og nem løsning til at øge reproducerbarheden af MCTS dannelse kunne være brugen af embryo-grade mineralolie og åndbar forsegling bånd eller membraner, som forhindrer fordampning men tillader udveksling normal gas 1Fem. Selvom agarose tilføjer ekstra tykkelse til plade bunde, som kan være en barriere for høj indhold billedbehandling, er dybdeskarpheden skabt af en agarose bund i transmitteret lys billeddannelse ikke hindre konstatering af MCTS størrelse og form efter lægemiddelbehandling. Derfor vil den præsenterede metode være af interesse for forskere står reproducerbarhed spørgsmål i masse af MCTS kultur.
Semi-automatiske billedanalyse Rutinemæssig
Selvom der er mange halvautomatisk / automatiseret software til MCTS billedanalyse, måling af størrelsen af komplet-til-delvis sønderdelte MCTSes efter lægemiddelbehandling er udsat for fejl 16, 17. I det første trin af den præsenterede rutine, er det bedst fokuserede billede automatisk valgt fra sættet af z -stack billeder ved at beregne normen af gradienten af billedet og vælge den ene med den største 0,999 quantile. Dette er en robust og støj-ufølsom mål for det maksimale.
Dernæst mørkere grænser beskåret og de forarbejdede billeder gemmes på den oprindelige opløsning i Portable Network Graphics format. Denne proces reducerer den samlede størrelse fra 2,5 GB, fra billeddannelse en hel 384 brønde, TC-behandlet plade, til ca. 100 MB. Efterfølgende centrum af MCTS fundet gennem et foldning med et cirkulært filter af brugerdefineret radius (vi bruger 20 pixels; figur 4A). En klar lokalt minimum af den filtrerede billede giver positionen af centrum (figur 4A). Flytning fra dette center i koncentriske ringformede volumener, er medianen gråtoneværdi, M, i hver skal beregnes som en funktion af skallen radius, R. Derefter først (væsentlig) højst den numeriske afledede af funktionen M (R) er fundet (figur 4B). Pointen M OPT for denne maksimale tages som den optimale tærskelværdi, og billedet er segmented af tærskling på dette niveau.
MCTS identificeres som den største centrale segment af billedet. Denne procedure fungerer normalt bedre end standard tærskling teknik, fordi det er i stand til at adskille MCTS kerne fra desintegrerende dele, der ofte skyldes lægemiddelbehandling (Figur 4C og 4D). Desuden fremgangsmåde her gør implicit brug af kugleform af MCTS. Simple tærsklingsparametre rutiner eller algoritmer baseret på aktive konturer, udnytter ikke a priori viden om, at en kugleformet objekt findes. Når MCTS er tydeligt opdages og afgrænset, den maksimale M OPT er klar og enkelt. Rutinen derefter måler karakteristika MCTS, såsom området, større og mindre akser, perimeter, og holdbarheden af monteret ellipse, og sparer en preview af det segmenterede billede. Hvis den maksimale er ikke klart, og / eller hvis flere lokale maksima er til stede, en præbetragtning af den foreslåede segmentering gemmes i en korrektion mappe.
I det næstsidste trin, rutinen går brugeren gennem korrektionen mappe til manuelt at justere den foreslåede segmentering ved at flytte grænsen op eller ned og vælge en polygonal region af interesse at afskære mulige overflødige dele af masken. Efter denne manual korrektion, de rutinemæssige foranstaltninger og gemmer MCTS egenskaber, som beskrevet ovenfor.
Figur 4: Illustration af billedet segmentering procedure. (A) I midten af MCTS er markeret med en grøn asterisk. Et eksempel på det ringformede rum er tegnet med rødt. (B) Den mediane gråtoneværdi i hver skal er afbildet som en funktion af skallen radius (blå linie). Den numeriske derivat af denne kurve beregnes (rød linje). Den første betydelige maremt af den numeriske differentialkvotient er fundet (sort asterisk). (C) Den resulterende korrekt segmentering af billedet i MCTS kerne og baggrunden med desintegrerende MCTS dele. (D) Forkert segmentering opnås ved Otsu metode. 4X mål; Scale bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det tjekkiske ministerium for uddannelse, ungdom og sport (LO1304) og Teknologisk Agentur for Den Tjekkiske Republik (TE01020028). Forfatterne vil gerne takke Dr. Lakshman Varanasi for at tage stillbilleder af miljømæssige låg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
