Summary
La pérdida desigual de medio de placas de microtitulación afecta a la reproducibilidad de la formación de esferoides de tumor multicelulares uniforme. La mejora de las condiciones de cultivo para reducir la pérdida significativa medio mejorará la reproducibilidad de la formación de esferoides y los resultados de los ensayos basados en esferoides utilizando la técnica de los líquidos de recubrimiento.
Abstract
Modelos de tumores que imitan estrechamente las condiciones in vivo se están volviendo cada vez más popular en el descubrimiento de fármacos y el desarrollo para el cribado de posibles fármacos contra el cáncer. Esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) imitan efectivamente las condiciones fisiológicas de los tumores sólidos, haciéndolos excelente en modelos in vitro para la optimización de plomo y la validación de dianas. Fuera de las diversas técnicas disponibles para el cultivo de MCTS, el método líquido superposición de agarosa es uno de los métodos más económicos para la generación de MCTS. Sin embargo, la transferencia fiable de cultivos MCTS utilizando líquido de recubrimiento para la selección de alto rendimiento puede verse comprometida por una serie de limitaciones, incluyendo el recubrimiento de placas de microtitulación (MP) con agarosa y la irreproducibilidad de la formación de MCTS uniforme a través de pozos. MPs son significativamente propensos a los efectos de borde que resultan de la evaporación excesiva de medio desde el exterior de la placa, evitando el uso de toda la placa para la drogapruebas. Este manuscrito ofrece mejoras técnicas detalladas a la técnica de superposición de líquido para aumentar la escalabilidad y la reproducibilidad de la formación uniforme de MCTS. Además, los detalles de una herramienta de software simple, semi-automático, y universalmente aplicable para la evaluación de las características de MCTS después se presenta el tratamiento de drogas.
Introduction
Las células de cáncer en los tumores están dispuestos fisiológicamente en una estructura compleja, 3 dimensiones (3D), rodeada de matriz extracelular y células que interactúan. Como casi todas las células en los tejidos residen en un entorno 3D, la necesidad de más fisiológicamente relevante en modelos de tumores in vitro que imitan los rasgos tumorales se ha traducido en el desarrollo de varias técnicas de cultivo 3D 1, 2, 3. Estos modelos se están convirtiendo en herramientas fundamentales de investigación para estudiar el papel del microambiente del tumor en respuesta metástasis y celular a la terapéutica en 3D 2. Por otra parte, en comparación con 2-dimensionales cultivos celulares (2D) 4, los modelos 3D permiten una mejor comprensión de las interacciones tumor-estroma, que afectan a las vías de señalización celulares.
esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) de líneas celulares de cáncer se utilizan con frecuencia en la celda 3D cULTURA modelos debido a su relativa cercanía a los tumores in vivo. Fuera de las varias técnicas en uso, la técnica de los líquidos de recubrimiento (LOT) de la generación de MCTS en placas de agarosa recubiertas de ha ganado un interés significativo para la optimización de plomo y de destino de validación 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Esto es evidente en los recientes estudios que fueron éxito capaz de ejecutar las pantallas piloto de bibliotecas de compuestos en cultivos MCTS utilizando el lote 6, 7. Sin embargo, la variabilidad del pozo a pozo en MCTS morfología y crecimiento debido a la pérdida de evaporación desigual inducida del medio son obstáculos comunes que acompañan a la LOT usando placas de microtitulación (MPs). En consecuencia, la formación de no uniforme MCTSes compromete la importancia y relevanciade los datos de ensayos farmacológicos 8, 12, 13. Además de los problemas de reproducibilidad, otro problema práctico que afecta a ensayos de alto rendimiento basado en lotes es el recubrimiento de los parlamentarios con la agarosa utilizando las unidades de dispensación automático de líquidos. Aunque la unidad de distribución se puede mantener calienta a prevenir la gelificación de agarosa, la obstrucción de la cassette de distribución y el tubo es un problema potencial para los sistemas robóticos 6.
Para superar algunos de estos desafíos, hemos ideado recientemente algunas modificaciones en el lote para el cultivo de MCTS 8. Estas modificaciones se basan principalmente en las posibles formas de prevenir la pérdida de medio desigual de los parlamentarios que utilizan instrumentos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de análisis de alto rendimiento. Un procedimiento detallado de la LOT modificado para la generación de MCTSes de tamaño uniforme y reproducible a través de 3placas de 84 pocillos (WP) se presentan aquí. El manuscrito también presenta una rutina de semi-automatizado para la evaluación del tamaño de MCTS, en particular en MCTSes parcialmente desintegradas, tratados con el fármaco que no tienen un límite claramente definido para la medición del área en sección transversal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de placas recubiertas con agarosa
- Pesar 0,75 g de agarosa de bajo punto de fusión y añadirlo a 100 ml de medio 5A de McCoy (con o sin rojo fenol) sin suero. Calentar la solución en un horno de microondas y agitar cada 1-2 min para disolver completamente la agarosa. Autoclave la solución para esterilizarlo.
- Se enfría la autoclave de agarosa a aproximadamente 70 ° C y filtrar a través de un 500 mL, 0,22 micras filtro superior por filtración a vacío en una caja de flujo laminar. Alícuota del 0,75% filtrada solución de agarosa (FAS) en volúmenes más pequeños si no se utiliza la solución completa de una vez. Almacenar esta solución de agarosa asépticamente listos para usar en una habitación fría o 4 ° C refrigerador hasta por 4 semanas.
- Adjuntar un pequeño tubo con una Plastica- o casete de dispensación con punta de metal para un dispensador de reactivos Combi y cebar la casete con 70% de etanol (EtOH) y después con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en un cuadro de flujo.
- Antes de su uso, calentar una alícuota almacenada de FAS i n el microondas para que se derrita. El primer casete de dispensación con una solución de agarosa y el abrigo de 384 pocillos, cultivo de tejidos (TC) tratados con "especial" microplacas con 15 l de FAS. Deje que la agarosa en la placa se enfríe durante 15-20 minutos antes de sembrar las células. Almacenar las placas de agarosa recubiertas de forma aséptica, envuelto en una bolsa de polietileno en una habitación fría o a 4 ° C y protegido de la luz directa.
NOTA: Evitar el calentamiento repetido del 0,75% FAS para evitar un cambio en la concentración de agarosa en la solución madre. placas de agarosa recubiertas de se pueden almacenar durante hasta 2 semanas cuando se almacena bajo las condiciones antes mencionadas. El FAS no requiere calentamiento durante el recubrimiento de placas. - Limpiar el casete de dispensación cebando con 70-80 ° C agua estéril para eliminar cualquier resto de agarosa en la punta de cassette y tubos.
2. Cultivo Celular y MCTS Formación
- HCT116 células de carcinoma colorrectal humano Cultura, como se ha descrito anteriormentelass = "xref"> 8.
- Eliminar el número requerido de agarosa recubiertas, de 384 pocillos, TC-tratados microplacas de almacenamiento en frío y se equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
- Preparar el dispensador de reactivos Combi para la siembra de células cebando un casete de dispensación tubo estándar con EtOH al 70% y PBS estéril. Ajuste el volumen a la siembra l requerida y la velocidad de dispensación al medio utilizando los botones de ajuste manual en el dispensador.
NOTA: El proceso de la siembra de células se lleva a cabo en condiciones estériles y en un cuadro de flujo laminar. - Disociar las células adherentes del matraz de cultivo de tejidos usando una enzima de disociación celular recombinante. Hacer una acción suspensión de células en un vaso de precipitados estéril con células de semillas a una densidad de 2,5 x 10 4 células / ml por pocillo en 50 l de medio de crecimiento completo. Cuando la siembra de más de un 384-WP, remover las células usando un agitador magnético para evitar que depositarse en el fondo del vaso de precipitados.
- permitir que elplacas en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 15 minutos a 4 x g.
- Mientras tanto, tomar una tapa de la evaporación del medio ambiente reductor y llenarlo con 8 ml de H2O estéril o el 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) en los lados cortos (izquierda y derecha) usando una pipeta de 5 ml (Figura 1A). En primer lugar, prescindir 4 ml de líquido de relleno en la pila de la izquierda mediante el barrido de la punta de la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo. Repita este paso con el canal del lado derecho.
NOTA: Asegúrese de que el líquido añadido a los canales secundarios no mezcla en el centro de la tapa y dejar un espacio para el intercambio de gases (Figura 1A). La adición de una cantidad excesiva de H 2 O resultados en la filtración de H2O en el exterior de la tapa y, posteriormente, en los pocillos exteriores de las placas de 384 pocillos TC. - Llenar el depósito de líquido de la placa de TC de 384 pocillos con H 2 O estéril y vuelva a colocar las tapas de placas regulares con las tapas ambientales llenas de líquido (Figura 2A).
- Colocar las placas en una incubadora rotativa 37 ° C con 95% de humedad, 5% de CO 2, y 20% de O 2, y permitir que las células se agregan en MCTSes durante 4 días. Evitar la apertura de la puerta de la incubadora durante demasiado tiempo en los días posteriores a fin de evitar que el nivel de humedad caiga bruscamente.
3. Intercambio media usando un sistema robótico
- En el día 4 después de la formación de MCTS, añadir 30 l de medio de pre-calentado por pocillo usando un dosificador lavador de microplacas automatizado. Permitir que los MCTSes crecer durante 3 días adicionales. Reemplazar el medio regularmente cada 3 días, hasta que alcancen el tamaño deseado para la experimentación.
- Para aspirar un volumen definido de medio de cada pocillo, empíricamente ajustar el -altura z del colector de la lavadora. Aspirar 30 l de medio por pocillo y reemplazarlo con 30 l de medio fresco, pre-calentado.
NOTA: Ajuste la velocidad de dispensación y la velocidad a la que el colector se desplaza hacia abajo la arandelaen los pozos en la tarifa más baja para minimizar la turbulencia en los pozos.
4. Imágenes de alta contenido de los MCT y análisis de imágenes semi-automatizado
- La imagen de MCTS en un sistema automatizado de imágenes de alto contenido utilizando un objetivo de aire 4X (NA 16).
- Ajuste el tiempo de exposición a 11 ms y el binning de 4 x 4. Ajuste el número y el espaciamiento de los -stacks Z y el pixel binning como se desee para el experimento para capturar todo un MCTS por pocillo.
- Procesar las imágenes paso a paso, como se describe en el "readme", usando una rutina de la casa escrito en lenguaje de programación.
Nota: El código .m y léame .txt archivos están disponibles como archivos de código suplementarios (Figura 1B). Las medidas rutinarias de la zona de MCTS, ejes mayor y menor, el perímetro y la solidez de las imágenes 2D.
Figura 1:Preparación de tapas ambientales y un diagrama de flujo de la rutina de semi-automática. (A) Imagen de una tapa de la evaporación del medio ambiente reductor de lleno con el correcto (izquierda) y el exceso (a la derecha) la cantidad de líquido que llena (en este caso, 5% de DMSO). La flecha indica la cubeta de lado corto para añadir líquido. El asterisco muestra el hueco en el centro de la tapa después de la adición del volumen correcto de DMSO. (B) Un flujo de trabajo que muestra las etapas implicadas en la rutina de análisis de imagen semi-automatizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La pérdida desigual del medio, sobre todo de los pozos periféricos, es un problema frecuentemente encontrado en los parlamentarios con pequeños volúmenes de cultivo. Condiciones de cultivo sustancialmente mejoradas, tales como incubadoras con sistemas bien controlados de temperatura / humidificación y parlamentarios de evaporación reductores y tapas de placas, reducen la pérdida significativa de la media en todos los pozos 8. Para medir la evaporación relativa, se añadieron volúmenes iguales de Naranja G (OG) a cada pocillo, y el cambio en la absorbancia OG más de 3 días se registró en placas con tapas regulares y ambientales en incubadoras estándar y giratorios. Pocillos de la placa se dividieron en 6 grupos basados en su distancia desde el borde de la placa (Figura 2 A). En los grupos 1-4, no hubo un cambio significativo en la absorbancia de OG con el tiempo en placas con tapas regulares en una incubadora estándar (Figura 2B). Aunque también hubo una variación en la absorbancia de OGgrupo 1 pozos en las placas de debajo de la tapa / combinación incubadora rotativa del medio ambiente (Figura 2C), los coeficientes de variación (CV) eran mucho más bajos en comparación con aquellos de las placas con tapas regulares en una incubadora estándar (Figura 2D).
La pérdida desigual evaporación inducida por medio es una de las posibles razones para la variabilidad entre pocillos de tamaño MCTS y lectura del ensayo de 8 MP. Sin embargo, las placas TC de 384 pocillos con la combinación del medio ambiente tapa / giratorio incubadora dieron como resultado la formación de MCTSes uniforme en toda la 6 grupos de pozos (Figura 2E). Por el contrario, MCTSes en placas con la combinación regular de la tapa / incubadora estándar varían significativamente en tamaño y solidez (Figura 3F). La solidez es una medida de los MCT esfericidad y da el grado de desintegración de la MCT. La solidez de una región 2D es la proporción de los píxeles en el convex casco de la región de interés (ROI) y se determina dividiendo el área del retorno de la inversión por el área de la envolvente convexa de la ROI. Ambas regiones circulares y elípticas tienen una solidez de 1, y como se desintegra el MCTS, la solidez disminuye. La diferencia en el área ya ha sido reportado en Das et al. (2016) 8. El volumen se calcula a partir de los ejes mayor y menor de la MCTSes.
Figura 2: Placas con el resultado en un aumento de la evaporación mínima reproducibilidad MCTS. (A) Un mapa de placa se presenta para mostrar la división de los pozos en 6 grupos. (B y C) Hay una variación dependiente del tiempo significativo en la absorbancia relativa de OG de los pozos en los grupos 1-4 en placas de cultivo en una incubadora estándar con tapas regulares (B) y del grupo 1 queLLS en placas con tapas ambientales en una incubadora rotativa (C). Absorbancias Día 3-5 OG se normalizan a día 0. (D), como promedio CV de OG absorbancia del grupo 1 de pozos días 3-5 se muestran las combinaciones de tapa / incubadora de dos placas. CV son la media de 3 experimentos independientes. (E) MCTSes formados en las placas con la combinación de tapa / incubadora rotativa del medio ambiente no difirieron significativamente entre los grupos de 6 pocillos. (B) Sin embargo, las placas con tapas regulares en una incubadora estándar formaron MCTSes de tamaño variable. Los datos se muestran para n> 60 MCTSes por grupo. Las cajas y barras horizontales dentro de las cajas en los diagramas de cajas representan los 25 º y 75 º percentiles y la mediana, respectivamente. Los bigotes representan los 5 º y 95 º percentiles, y los valores atípicos son indicados por los puntos negros alineados en los diagramas de caja. Los valores de p de los análisis de Kruskal-Wallis se presentan a continuación EACh diagrama de caja. Los datos son de al menos 3 experimentos independientes por placa combinación tapa / incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para determinar la posible aplicabilidad de la rutina, MCTSes 7 días de edad, se trataron con paclitaxel (PTX), vincristina (VCR), el oxaliplatino (OXA), doxorubicina (DOX), y 5-fluorouracilo (5-FU) a 3 concentraciones diferentes durante 4 días. Los medicamentos se obtuvieron del Hospital Universitario de Olomouc, Universidad Palacky. Las imágenes MCTS se analizaron a continuación, y la zona, ejes mayor y menor, perímetro, y la solidez de MCTSes tratadas se compararon con los controles (CTL). Los ejes mayor y menor se utilizaron para calcular el volumen geométrico. Hubo una disminución dependiente de la concentración en el área de MCTS y el volumen después del tratamiento de drogas (Figura 3). Aunque 0,001 g / ml VCR y 0,4 mg / ml DOX y 5-FU produjo aumento de la superficie de MCTS, el volumen se incrementó de manera significativa únicamente a raíz de 0,001 g / ml VCR. MCTS perímetro fue significativamente diferente sólo en las más altas concentraciones de PTX, DOX, y 5-FU, que afectó por completo el tamaño de MCTS. PTX y VCR a 0,25 g / ml y 0,06 g / ml y DOX y 5-FU en 100 mg / ml resultaron en una disminución significativa en la solidez, lo que indica una desintegración-complete-a parcial de las MCTSes (Figura 3).
Figura 3: Medida de los efectos de la droga en MCTSes por la rutina semi-automatizado. Se presentan (A) Imágenes de CTL y MCTSes tratados con el fármaco. Barra de escala = 10 micras. Las concentraciones en mg / ml se dan para cada imagen. (B) Los gráficos de barras que muestran un efecto dependiente de la dosis de PTX, VCR, OXA, DOX, y 5-FU en elárea y volumen de 7 MCTSes de un día después de 4 días de tratamiento. perímetros MCTS se redujeron significativamente después de 0,25 mg / ml PTX y 100 mg / ml DOX y 5-FU. Las concentraciones de fármaco que dieron lugar a la desintegración completa a parcial de MCTSes redujo significativamente en comparación con la solidez de MCTS CTL. Los datos son la media ± SD de al menos 5 MCTSes de 3 placas independientes. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 droga-tratada frente a CTL, ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El recubrimiento de placas de 384 pocillos con filtro de CT con agarosa
La práctica estándar en la LOT es utilizar un punto de agarosa de baja fusión 1-1,5% para recubrir las placas, lo que requiere la agarosa y / o unidad de distribución que deben tenerse climatizada para evitar la gelificación de la agarosa 6. La gelificación de la agarosa es materia de preocupación mientras se prepara múltiples platos usando casetes de dispensación de líquido con pequeñas aberturas de tubos que oscilan entre 0,2 y 0,4 mm de diámetro. Para superar el problema potencial de la obstrucción de los cassettes de dispensación, se utilizó 0,75% FAS, ya que no requiere calentamiento adicional durante la dispensación. A propósito, también se observó que un 0,75% FAS no gelifique tan rápidamente como sin filtrar 1-1,5%, o incluso 0,75%, solución de agarosa. El uso de 0,75% FAS, se tarda menos de 35 s para recubrir toda una placa TC de 384 pocillos sin obstruir el casete de dispensación. El casete se puede limpiar al final cebando con agua caliente para eliminar un residuogarose, lo que podría obstruir la punta cuando el casete no está en uso.
Tapa del medio ambiente y Rotary Incubadora sobre la tapa de la placa regular y la Incubadora
La pérdida desigual evaporación inducida por medio afecta de manera significativa la reproducibilidad de la formación uniforme MCTS y consecuentemente compromete el resultado de los ensayos 14. Sorprendentemente, grupo 1, pocillos de placas TC de 384 pocillos en la combinación de tapa / incubadora rotativa del medio ambiente mostraron una variación estadísticamente significativa en OG absorbancia (Figura 2C). Sin embargo, un bajo CV de OG absorbancia en el grupo 1 pozos indica que la evaporación en los pocillos exteriores de las placas de 384 pocillos de CT en la incubadora rotativa con tapas del medio ambiente no es tan excesiva que pueda afectar el crecimiento de MCTS (Figura 2D). Esto es evidente en los MCTSes de tamaño uniforme formados en el grupo 1 en placas de pozos con la combinación del medio ambiente tapa / rotatorio incubadora. Además, la pérdida reducidadel medio evita la variabilidad entre pocillos en los ensayos de la droga de placas TC de 384 pocillos cultivados en la incubadora rotativa con tapas ambientales 8.
La metodología presentada también resulta en la formación de MCTSes uniforme de unos pocos otro tipo de cáncer y las líneas celulares no cancerosas 8. Sin embargo, puesto que todas las células no pueden agregar inherentemente en MCTSes en una superficie no adherente, este método muchos no ser adecuado para otras líneas de células que no fueron probados para la reproducibilidad de la formación uniforme MCT. Además, la atención se centró principalmente en el uso de una incubadora-tecnología avanzada en combinación con MPs evaporación de reducción y las tapas de la placa para aumentar la reproducibilidad de la formación de los MCT. Otra solución barata y fácil de aumentar la reproducibilidad de la formación de MCTS podría ser el uso de aceite mineral de grado embrión y transpirable cintas o membranas, que impiden la evaporación pero de sellado permite el intercambio de gases normales 15. A pesar de agarosa añade grosor adicional a la placa fondos, que pueden ser un obstáculo para la formación de imágenes de alto contenido, la profundidad de campo creado por una parte inferior de agarosa en imágenes de luz transmitida no dificulta la determinación de tamaño y forma MCTS después del tratamiento de drogas. Por lo tanto, el método presentado será de potencial interés para los investigadores se enfrentan a problemas de reproducibilidad en el solar de la cultura MCTS.
Semi-automatizado de rutina Análisis de Imágenes
Aunque hay muchos semi-automatizado / software disponible para el análisis de imágenes automatizado MCTS, la medición de los tamaños de tratamiento de drogas completa a parcialmente MCTSes desintegrados después es propenso a errores 16, 17. En la primera etapa de la rutina presentada, la mejor imagen enfocada se selecciona de forma automática desde el conjunto de imágenes -stack z mediante el cálculo de la norma del gradiente de la imagen y seleccionar el que tiene el mayor 0,999 quaNTILE. Esta es una medida robusta y ruido insensible del máximo.
A continuación, los bordes más oscuros se recortan y las imágenes procesadas se almacenan en la resolución original en formato Portable Network Graphics. Este proceso reduce el tamaño total de 2,5 GB, a partir de imágenes de un entero pocillos 384, la placa tratada con TC, de aproximadamente 100 MB. Posteriormente, el centro de la MCTS se encuentra a través de una convolución con un filtro circular de radio definido por el usuario (usamos 20 píxeles; Figura 4A). Un mínimo local clara de la imagen filtrada proporciona la posición del centro (Figura 4A). El paso de este centro en anillos concéntricos, el valor de escala de grises mediana, M, en cada carcasa se calcula como una función del radio de la cáscara, R. A continuación, la primera (sustancial) máximo de la derivada numérica de la función M (R) es encontrado (Figura 4B). La OPT punto M de este máximo será igual al umbral óptimo, y la imagen es segmented por umbralización a este nivel.
El MCTS se identifica como el segmento central más grande de la imagen. Este procedimiento generalmente funciona mejor que la técnica de umbral estándar, ya que es capaz de separar el núcleo MCTS de las partes de desintegración que a menudo resultan de tratamiento de drogas (Figura 4C y 4D). Por otra parte, el enfoque adoptado aquí hace un uso implícito de la esfericidad de la MCTS. Rutinas sencillas de umbral, o algoritmos basados en contornos activos, no explotan el conocimiento a priori de que un objeto esférico se encuentra. Cuando el MCTS se detecta claramente delineada y, los TPO máximo M es claro y sencillo. La rutina luego mide las características de la MCTS, tales como el área, ejes mayor y menor, el perímetro y la solidez de la elipse equipada, y guarda una vista previa de la imagen segmentada. Si el máximo no está claro, y / o si múltiples máximos locales están presentes, un preHabida cuenta de la segmentación sugerido se guarda en una carpeta de corrección.
En la penúltima etapa, la rutina de guía al usuario a través de la carpeta de corrección para ajustar manualmente la segmentación sugerido moviendo el umbral arriba o hacia abajo y la selección de una región poligonal de interés para cortar posibles partes redundantes de la máscara. Después de esta corrección manual, las medidas de rutina y guarda las características MCTS, como se describe anteriormente.
Figura 4: Ilustración del procedimiento de segmentación de imágenes. (A) El centro de la MCTS está marcado con un asterisco verde. Un ejemplo de la corona circular se dibuja en rojo. (B) El valor de la mediana escala de grises en cada cáscara se representa como una función del radio de la cáscara (línea azul). La derivada numérica de esta curva se calcula (línea roja). La primera ma sustancialximo de la derivada numérica se encuentra (asterisco negro). (C) La correcta segmentación resultante de la imagen en el núcleo de MCTS y el fondo con las partes de desintegración MCTS. (D) la segmentación incorrecta obtenido por el método de Otsu. objetivo 4X; Barra de escala = 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Educación Checa, Juventud y Deportes (LO1304) y la Agencia Tecnológica de la República Checa (TE01020028). Los autores desean agradecer al Dr. Lakshman Varanasi para tomar las imágenes fijas de tapas ambientales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
