Summary
La perte inégale de milieu à partir de plaques de microtitrage affecte la reproductibilité des multicellulaire formation sphéroïde tumorale uniforme. L'amélioration des conditions de culture pour réduire la perte moyenne significative permettra d'améliorer la reproductibilité de la formation sphéroïde et les résultats des essais à base de sphéroïde-en utilisant la technique de liquide overlay.
Abstract
Modèles de tumeur qui imitent étroitement dans des conditions in vivo sont de plus en plus populaire dans la découverte de médicaments et le développement pour le criblage de médicaments potentiels contre le cancer. Sphéroïdes de tumeur multicellulaires (MCTSes) imitent effectivement les conditions physiologiques des tumeurs solides, ce qui les rend excellents modèles in vitro pour l' optimisation du plomb et la validation de cibles. Sur les diverses techniques disponibles pour la culture SCTM, la méthode de liquide superposition sur agarose est l'une des méthodes les plus économiques pour la production SCTM. Cependant, le transfert fiable des cultures SCTM utilisant liquide overlay pour le criblage à haut débit peut être compromise par un certain nombre de limitations, y compris le revêtement de plaques de microtitrage (PM) avec agarose et la reproductibilité de la formation MCTS uniforme à travers les puits. Les députés sont nettement sujettes à des effets de bord qui résultent de l'évaporation excessive du milieu de l'extérieur de la plaque, ce qui empêche l'utilisation de la totalité de la plaque pour la droguetests. Ce manuscrit fournit des améliorations techniques détaillées à la technique de liquide overlay pour augmenter l'évolutivité et la reproductibilité de la formation uniforme SCTM. En outre, des détails sur un outil logiciel simple, semi-automatique, et universellement applicable pour l'évaluation des SCTM caractéristiques après le traitement médicamenteux est présenté.
Introduction
Les cellules cancéreuses dans les tumeurs sont disposées dans un plan physiologique, en 3 dimensions (3D) de structure complexe entouré par une matrice extracellulaire et les cellules qui interagissent. Que presque toutes les cellules dans les tissus se trouvent dans un environnement 3D, la nécessité d' une plus physiologiquement pertinente dans des modèles de tumeur in vitro qui imitent les caractéristiques de la tumeur a entraîné le développement de plusieurs techniques de culture 3D 1, 2, 3. Ces modèles sont en train de devenir des outils de recherche fondamentale pour étudier le rôle du microenvironnement tumoral sur les métastases et la cellule de réponse à la thérapeutique en 3D 2. En outre, par rapport aux cultures (2D) , la cellule 2 dimensions 4, les modèles 3D permettent une meilleure compréhension des interactions tumeur-stroma, qui affectent les voies de signalisation cellulaires.
sphéroïdes de tumeur multicellulaires (MCTSes) de lignées de cellules cancéreuses sont fréquemment utilisés dans les cellules 3D cmodèles en raison de leur proximité par rapport aux tumeurs in vivo de ulture. Parmi les nombreuses techniques utilisées, la technique de liquide de recouvrement (LOT) de génération SCTM sur des plaques d'agarose revêtues a suscité un intérêt considérable pour l' optimisation de plomb et une cible de validation 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Cela est évident à partir des études récentes qui ont été en mesure d'exécuter avec succès des écrans pilotes de bibliothèques de composés dans les cultures SCTM utilisant LOT 6, 7. Cependant, la variabilité de SCTM morphologie et la croissance du puits à bien en raison de la perte inégale induite par évaporation du milieu sont des obstacles communs qui accompagnent le LOT en utilisant des plaques de microtitrage (MP). Par conséquent, la formation de non-uniforme MCTSes compromet l'importance et la pertinencedes données provenant des essais pharmacologiques 8, 12, 13. En plus des problèmes de reproductibilité, un autre problème pratique qui affecte des essais à haut débit à base de LOT est le revêtement des députés avec agarose lors de l'utilisation de liquide automatique des unités de distribution. Bien que l'unité de distribution peut être maintenu chauffé afin d' éviter la gélification de l' agarose, l'obstruction de la cassette et le tube de distribution est un problème potentiel pour les systèmes robotiques 6.
Pour surmonter certains de ces défis, nous avons récemment mis au point quelques modifications dans le LOT pour MCTS culture 8. Ces modifications sont principalement basées sur les moyens possibles pour empêcher la perte moyenne inégale des députés au moyen d'instruments qui se trouvent couramment dans les laboratoires de criblage à haut débit. Une procédure détaillée de la LOT modifiée pour la génération d'MCTSes de taille uniforme et reproductible à travers 3plaques 84 puits (WPS) est présenté ici. Le manuscrit présente également une routine semi-automatique pour l'évaluation de la taille SCTM, en particulier dans MCTSes, partiellement désintégrés traités avec le médicament qui ne possèdent pas une limite clairement définie pour la mesure de l'aire de section transversale.
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Protocol
1. Préparation des plaques d'agarose revêtues
- Peser 0,75 g de bas point de fusion d'agarose et l'ajouter à 100 ml de milieu 5A de McCoy (avec ou sans rouge de phénol) sans sérum. Chauffer la solution dans un four micro-ondes et agiter toutes les 1-2 minutes pour dissoudre complètement l'agarose. Autoclave la solution pour le stériliser.
- Refroidir l'autoclave d'agarose à environ 70 ° C et filtrer à travers un 500 ml, 0,22 um filtre supérieur par filtration sous vide dans une zone d'écoulement laminaire. Aliquoter la solution d'agarose filtrée 0,75% (FAS) en petits volumes, sinon en utilisant la totalité de la solution à la fois. Conservez ce agarose solution aseptique prêt à l'emploi dans une chambre froide ou 4 ° C réfrigérateur jusqu'à 4 semaines.
- Attacher un petit tube avec une plastique- ou d'une cassette de distribution à pointe métallique à un distributeur de réactif combiné et amorcer la cassette avec 70% d'éthanol (EtOH), puis avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une zone d'écoulement.
- Avant utilisation, chauffer une partie aliquote stockée de FAS i n micro-ondes pour le faire fondre. Premier la cassette de distribution avec une solution d'agarose et le manteau 384 puits, culture de tissu (TC) a traité des "spéciaux" microplaques avec 15 pi de FAS. Laisser l'agarose dans la plaque refroidir pendant 15-20 minutes avant l'ensemencement des cellules. Stocker les plaques d'agarose revêtues aseptique, enveloppé dans un sac en polyéthylène dans une chambre froide ou à 4 ° C et à l'abri de la lumière directe.
REMARQUE: Éviter de chauffer répétée de la FAS 0,75% pour éviter un changement de la concentration d'agarose dans la solution mère. des plaques d'agarose revêtues peuvent être stockées pendant jusqu'à 2 semaines lors d'un stockage dans les conditions précitées. Le FAS ne nécessite pas de chauffage pendant le revêtement de plaques. - Nettoyer la cassette de distribution par amorçage avec 70-80 ° C de l'eau stérile pour éliminer tout agarose restant dans les conseils et tubes cassettes.
2. Culture cellulaire et MCTS Formation
- cellules HCT116 de carcinome du côlon humain de la culture, comme décrit précédemmentlass = "xref"> 8.
- Retirer le nombre requis d'agarose-enduit, 384 puits, TC-traités microplaques de la chambre froide et équilibrer leur température ambiante (RT) pendant 15 min.
- Préparer le distributeur de réactif Combi pour l'ensemencement des cellules en amorçant une cassette tube de distribution standard avec 70% EtOH et PBS stérile. Réglez le volume d'ensemencement à la pi requise et la vitesse de distribution à moyenne en utilisant les boutons de réglage manuel sur le distributeur.
REMARQUE: L'ensemble du processus d'ensemencement des cellules est réalisée dans des conditions stériles et dans une zone d'écoulement laminaire. - Dissocier les cellules adhérentes à partir du flacon de culture de tissu à l'aide d'une enzyme de dissociation de cellules recombinantes. Faire une suspension de stock de cellules dans un récipient stérile avec des cellules de semence , à une densité de 2,5 x 10 4 cellules / ml par puits dans 50 ul de milieu de croissance complet. Lors de l'ensemencement plus d'un WP-384, mélanger les cellules à l'aide d'un agitateur magnétique, afin de les empêcher de se déposer au fond du bécher.
- Laisser leplaques de se reposer pendant 30 min à température ambiante puis centrifuger pendant 15 min à 4 x g.
- Pendant ce temps, prendre un couvercle environnemental évaporation de réduction et le remplir avec 8 ml de H 2 O stérile ou 5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans les petits côtés (gauche et droite) en utilisant une pipette de 5 ml (figure 1A). Tout d'abord, verser 4 ml de liquide de remplissage dans le creux de gauche en balayant la pointe de pipette lentement vers le haut et vers le bas. Répétez cette étape avec le creux du côté droit.
REMARQUE: Assurez -vous que le liquide ajouté aux creux latéraux ne se confond pas au centre du couvercle, et laisser un espace pour l' échange de gaz (figure 1A). L' ajout d' une quantité en excès de H 2 O conduit à l'infiltration de H 2 O à l'extérieur du couvercle et par la suite dans les puits externes des plaques à 384 puits TC. - Remplir le réservoir de liquide de 384 puits plaque de TC avec H 2 O stérile et remplacer les couvercles des plaques régulières avec les liquides remplis couvercles environnementaux (figure 2A).
- Placer les plaques dans un incubateur rotatif à 37 ° C avec 95% d' humidité, 5% de CO 2 et 20% de O 2, et laisser les cellules se rassemblent dans MCTSes pendant 4 jours. Évitez d'ouvrir la porte de l'incubateur pendant trop longtemps dans les jours suivants afin d'éviter que le niveau d'humidité de tomber brusquement.
3. Medium Exchange à l'aide d'un système robotique
- Le jour 4 après la formation MCTS, ajouter 30 pi de milieu préchauffé par puits en utilisant un distributeur de microplaques laveur automatique. Autoriser les MCTSes à croître pendant 3 jours supplémentaires. Remplacez le support régulièrement tous les 3 jours, jusqu'à ce qu'ils atteignent la taille souhaitée pour l'expérimentation.
- Aspirer un volume déterminé de milieu de chaque puits, régler de façon empirique z -hauteur du collecteur de lave - glace. Aspirer 30 pi de milieu par puits et le remplacer par 30 pi de milieu frais, préchauffé.
REMARQUE: Réglez la vitesse de distribution et la vitesse à laquelle le collecteur de lave-glace se déplace vers le basdans des puits au taux le plus bas pour minimiser la turbulence dans les puits.
4. Haut-contenu Imagerie des SCTM et semi-automatisé d'analyse d'images
- Image SCTM dans un système d'imagerie automatisée à haute teneur en utilisant un objectif d'air 4X (NA 16).
- Réglez le temps d'exposition à 11 ms et le binning à 4 x 4. Réglez le nombre et l' espacement des z -stacks et binning de pixel comme souhaité pour l'expérience pour capturer l' ensemble d' un SCTM par puits.
- Traiter les images par étapes, comme décrit dans le "readme", en utilisant une routine en interne écrite dans un langage de programmation.
NOTE: Le code de .m et readme fichiers .txt sont disponibles sous forme de fichiers de code supplémentaires (figure 1B). Les mesures de routine de la région de SCTM, axes majeurs et mineurs, le périmètre et la solidité des images 2D.
Figure 1:La préparation de couvercles sur l'environnement et un organigramme de la routine semi-automatique. (A) Image d'un couvercle environnement évaporation réduisant rempli avec le bon ( à gauche) et l' excès ( à droite) quantité de liquide de remplissage (ici, 5% de DMSO). La flèche indique le creux du côté court pour l'ajout de liquide. L'astérisque montre l'écart au milieu du couvercle après l'addition du volume correct de DMSO. (B) Un flux de travail montrant les étapes impliquées dans l'analyse de l' image de routine semi-automatisé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Representative Results
La perte inégale de milieu, en particulier des puits périphériques, est un problème fréquemment rencontré dans les PM avec de petits volumes de culture. Sensiblement l' amélioration des conditions de culture, telles que les incubateurs avec température / systèmes d'humidification bien contrôlée et les députés de l' évaporation de réduction et les couvercles de la plaque, de réduire la perte significative de milieu dans les puits 8. Pour mesurer l'évaporation relative, des volumes égaux d'Orange G (OG) ont été ajoutés à chaque puits, et le changement de OG absorbance pendant 3 jours a été enregistré dans des plaques avec des couvercles réguliers et environnementaux dans les incubateurs standard et rotatifs. Les puits des plaques ont été divisés en 6 groupes en fonction de leur distance par rapport au bord de la plaque (figure 2A). Dans les groupes 1-4, il y avait un changement significatif dans l'absorbance OG au fil du temps dans des plaques avec des couvercles réguliers dans un incubateur standard (figure 2B). Bien qu'il y avait aussi une variation de l'absorbance de OGgroupe 1 puits dans des plaques sous le couvercle / combinaison incubateur rotatif environnement (figure 2C), les coefficients de variation (CV) étaient beaucoup plus faibles par rapport à ceux des plaques avec des couvercles réguliers dans un incubateur standard (figure 2D).
La perte inégale induite par évaporation du milieu est l' une des causes possibles de la variabilité du puits à bien dans la taille SCTM et le dosage de lecture dans les PM 8. Cependant, des plaques à 384 puits TC avec le couvercle et / ou la combinaison de l' incubateur rotatif de l' environnement ont donné lieu à la formation de MCTSes uniformes dans les 6 groupes de puits (figure 2E). En revanche, MCTSes en plaques avec le / la combinaison régulière d'incubateur standard couvercle varient considérablement en taille et la solidité (figure 3F). Solidité est une mesure de SCTM sphéricité et donne le degré de désintégration de la SCTM. La solidité d'une région 2D est la proportion des pixels dans la convex coque de la région d'intérêt (ROI) et est déterminée en divisant la surface de la ROI par la surface de l'enveloppe convexe de la ROI. Les deux régions circulaires et elliptiques ont une solidité de 1, et comme le SCTM désintègre, la solidité diminue. La différence dans la zone a déjà été signalée dans Das et al. (2016) 8. Le volume a été calculé à partir des axes majeur et mineur des MCTSes.
Figure 2: Plaques avec résultat de l' évaporation minimale dans la meilleure reproductibilité SCTM. (A) Une carte de plaque est présenté pour montrer la répartition des puits en 6 groupes. (B et C) Il existe une variation dépendante du temps significatif de l'absorbance relative des OG des puits dans les groupes 1-4 dans des plaques de culture dans un incubateur standard avec des couvercles réguliers (B) et du groupe 1 , nouslls en plaques avec couvercles environnementaux dans un incubateur rotatif (C). Absorbances Day 3-5 OG sont normalisées à jour 0. (D) moyenné cv de OG absorbance du groupe 1 puits de jours 3-5 sont présentées pour les deux plaques combinaisons / couvercle de l' incubateur. CV sont des moyennes de 3 expériences indépendantes. (E) MCTSes formés dans des plaques avec la combinaison couvercle / incubateur rotatif de l' environnement ne diffèrent pas significativement entre les 6 groupes de puits. (B) Cependant, des plaques avec des couvercles réguliers dans un incubateur classique formé MCTSes de taille variable. Les données sont présentées pour n> 60 MCTSes par groupe. Les boîtes et barres horizontales dans les boîtes dans les boxplots représentent les 25 e et 75 e percentiles et médian, respectivement. Les moustaches représentent les 5 e et 95 e percentiles, ainsi que les valeurs aberrantes sont indiquées par les points noirs alignés dans les boxplots. Les valeurs de p de l'analyse de Kruskal-Wallis sont présentés ci-dessous each boxplot. Les données sont d'au moins 3 expériences indépendantes par plaque combinaison couvercle / incubateur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour déterminer l'applicabilité éventuelle de la routine, 7 jours-vieux MCTSes ont été traités avec le paclitaxel (PTX), vincristine (VCR), oxaliplatine (OXA), la doxorubicine (DOX), et 5-fluorouracile (5-FU) à 3 concentrations différentes pendant 4 jours. Les médicaments ont été obtenus à partir de l'hôpital universitaire d'Olomouc, Université Palacky. Les images SCTM ont ensuite été analysées, et la région, grands et petits axes, le périmètre, et la solidité de MCTSes traitées ont été comparées à des contrôles (CTL). Les axes majeurs et mineurs ont été utilisés pour calculer le volume géométrique. Il y avait une diminution dépendante de la concentration dans la zone SCTM et le volume après le traitement médicamenteux (figure 3). Bien que 0,001 pg / ml VCR et 0,4 pg / mL DOX et 5-FU a donné lieu à augmentation de la superficie des SCTM, le volume a été augmenté de façon significative que suivre VCR / mL 0,001 pg. MCTS périmètre était significativement différente que les concentrations les plus élevées de PTX, DOX, et 5-FU, qui a affecté complètement la taille SCTM. PTX et d'un magnétoscope à 0,25 pg / mL et 0,06 pg / ml et la DOX et de 5-FU à 100 pg / ml ont entraîné une diminution significative de la solidité, indiquant une désintégration complète à partielle des MCTSes (figure 3).
Figure 3: Mesure des effets de la drogue en MCTSes par la routine semi-automatisé. (A) Images de CTL et MCTSes traités avec le médicament sont présentés. Barre d'échelle = 10 pm. Les concentrations en pg / ml sont donnés pour chaque image. (B) Les graphiques à barres montrent un effet dose-dépendante de la PTX, un magnétoscope, oxa DOX et le 5-FU sur lesuperficie et le volume de 7 MCTSes d'un jour après 4 jours de traitement. périmètres SCTM ont été significativement réduits suivant 0,25 pg / ml PTX et 100 pg / ml DOX et 5-FU. Les concentrations de médicaments qui ont abouti à la désintégration complète à partielle de MCTSes réduit de façon significative par rapport à la solidité des SCTM CTL. Les données sont la moyenne ± écart-type d'au moins 5 MCTSes de 3 plaques indépendantes. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 par rapport à la drogue traitée CTL une ANOVA avec un test de comparaison multiple de Dunnett. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Revêtement 384 puits TC Plaques avec Filtré Agarose
La pratique standard dans LOT est d'utiliser un bas point de fusion d' agarose 1-1,5% pour enduire les plaques, ce qui nécessite l'agarose et / ou unité de distribution à garder chauffée pour empêcher la gélification de l'agarose 6. La gélification de l'agarose est une préoccupation potentielle lors de la préparation de multiples plaques en utilisant des cassettes de distribution de liquide avec de petites ouvertures de tube comprises entre 0,2 et 0,4 mm de diamètre. Pour surmonter le problème potentiel de colmatage des cassettes de distribution, 0,75% FAS a été utilisé, car il ne nécessite pas de chauffage supplémentaire lors de la distribution. Par ailleurs, il a également été observé que 0,75% FAS ne se gélifie pas aussi rapidement que non filtrée 1-1,5%, voire 0,75%, une solution d'agarose. Utilisation de 0,75% FAS, il faut moins de 35 s pour enduire une plaque de TC 384 puits entier sans obstruer la cassette de distribution. La cassette peut être nettoyé à la fin par amorçage avec de l'eau chauffée pour éliminer un résidugarose, ce qui pourrait obstruer les conseils lorsque la cassette est pas utilisé.
Couvercle de l'environnement et le Rotary Incubateur plus régulier Couvercle plat et Incubateur
La perte inégale induite par évaporation du milieu affecte de manière significative la reproductibilité de la formation uniforme SCTM et compromet par conséquent les résultats des essais 14. Étonnamment, le groupe 1 puits de plaques TC 384 puits sous la combinaison couvercle / incubateur rotatif de l' environnement ont montré une variation statistiquement significative OG absorbance (figure 2C). Cependant, un faible CV de OG absorbance dans le groupe 1 puits indique que l'évaporation dans les puits externes des plaques 384 puits TC dans l'incubateur rotatif avec des couvercles environnementaux est pas excessive à affecter la croissance des SCTM (figure 2D). Ceci est évident à partir des MCTSes de taille uniforme formées dans le groupe 1 des puits dans des plaques avec le couvercle et / ou la combinaison de l'incubateur rotatif de l'environnement. En outre, la réduction des pertesdu milieu empêche la variabilité du puits à bien dans des essais de médicaments à partir de 384 puits TC plaques de culture dans l'incubateur rotatif avec des couvercles environnementaux 8.
La méthodologie présentée conduit également à la formation de MCTSes uniformes d'un autre type de cancer rares et des lignées de cellules non cancéreuses 8. Cependant, étant donné que toutes les cellules ne peuvent pas se regrouper en soi dans MCTSes sur une surface non adhérente, ce procédé beaucoup ne pas être adapté à d'autres lignées cellulaires qui ne sont pas testés pour la reproductibilité de la formation uniforme SCTM. En outre, l'accent a été mis principalement sur l'utilisation d'un incubateur de technologie avancée en combinaison avec les députés de l'évaporation de réduction et les couvercles des plaques pour augmenter la reproductibilité de la formation des SCTM. Une autre solution pas cher et facile d'augmenter la reproductibilité de la formation des SCTM pourrait être l'utilisation de l' huile minérale embryo-grade et respirante bandes ou membranes, qui empêchent l' évaporation mais étanchéité permettent l' échange de gaz normal 15. Bien que l'agarose ajoute de l'épaisseur supplémentaire à la plaque des fonds, qui peut être un obstacle à l'imagerie à haute teneur, la profondeur de champ créé par un fond d'agarose en imagerie lumière transmise ne gêne pas la détermination de la taille et de la forme SCTM après un traitement médicamenteux. Par conséquent, la méthode présentée sera d'un intérêt potentiel pour les chercheurs confrontés à des problèmes de reproductibilité dans le LOT de la culture SCTM.
Semi-automatique d'analyse d'images de routine
Bien qu'il existe de nombreux semi-automatisé / logiciel disponible pour MCTS analyse d'image automatisée, la mesure des tailles de complète à partiellement MCTSes désintégrés après le traitement médicamenteux est sujette à des erreurs 16, 17. Dans la première étape de la routine présenté, l'image le plus concentré est automatiquement sélectionné parmi l'ensemble d'images -stack z en calculant la norme du gradient de l'image et en sélectionnant l'une de la plus grande 0,999 quaNTILE. Cette mesure est robuste et insensible au bruit de la valeur maximale.
Ensuite, les frontières les plus sombres sont rognées et les images traitées sont stockées à la résolution d'origine au format Portable Network Graphics. Ce processus réduit la taille totale de 2,5 Go, à partir de l'imagerie d'un ensemble de 384 puits, plaque TC-traitée, à environ 100 MB. Par la suite, le centre de la SCTM se trouve grâce à une convolution avec un filtre circulaire de rayon défini par l' utilisateur (on utilise 20 pixels; figure 4A). Un minimum local clair de l'image filtrée fournit la position du centre (figure 4A). Le passage de ce centre en anneaux concentriques, la valeur en niveaux de gris médian, M, dans chaque coquille est calculée en fonction du rayon de la coquille, R. Par la suite, le premier maximum (substantielle) de la dérivée numérique de la fonction M (R) est trouvé (figure 4B). Le point M OPT de ce maximum est considéré comme le seuil optimal, et l'image est segmented par seuillage à ce niveau.
Le SCTM est identifié comme étant le plus grand segment central de l'image. Ce procédé fonctionne habituellement meilleure que la technique de seuillage standard , car il est capable de séparer le noyau SCTM à partir des parties de délitement qui résultent souvent d' un traitement médicamenteux (figure 4C et 4D). En outre, l'approche adoptée ici fait usage implicite de la sphéricité de la SCTM. Routines simples de seuillage, ou des algorithmes basés sur les contours actifs, ne pas exploiter les connaissances a priori qu'un objet sphérique se trouve. Lorsque le SCTM est clairement détectée et délimitée, le M OPT maximale est claire et simple. La routine mesure alors les caractéristiques de la SCTM, tels que la région, les axes majeurs et mineurs, le périmètre et la solidité de l'ellipse équipée, et enregistre un aperçu de l'image segmentée. Si le maximum est pas clair, et / ou si des maxima locaux multiples sont présents, un prévue de la segmentation proposée est enregistrée dans un dossier de correction.
Dans l'avant-dernière étape, la routine guide l'utilisateur à travers le dossier de correction pour ajuster manuellement la segmentation proposée en déplaçant le seuil vers le haut ou vers le bas et la sélection d'une région polygonale d'intérêt pour couper les parties redondantes possibles du masque. Après cette correction manuelle, les mesures de routine et enregistre les caractéristiques des SCTM, comme décrit ci-dessus.
Figure 4: Illustration de la procédure de segmentation d' image. (A) Le centre de la SCTM est marquée d'un astérisque vert. Un exemple de l'espace annulaire est tracé en rouge. (B) La valeur de niveaux de gris médian dans chaque coquille est tracée en fonction du rayon de la coque (ligne bleue). La dérivée numérique de cette courbe est calculée (ligne rouge). La première ma substantielleximum du dérivé numérique se trouve (astérisque noir). (C) La segmentation correcte résultant de l'image dans le noyau MCTS et le fond avec les parties SCTM désintégrant. (D) de segmentation incorrecte obtenue par la méthode d'Otsu. objectif 4X; Barre d'échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère tchèque de l'éducation, de la jeunesse et des sports (LO1304) et l'Agence technologique de la République tchèque (TE01020028). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lakshman Varanasi pour prendre des images fixes de couvercles environnementaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
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