Summary
De ongelijke verlies drager van microtiterplaten beïnvloedt de reproduceerbaarheid van uniforme multicellulaire bolvormige tumoren ontstaan. Verbetering kweekomstandigheden aanzienlijk medium verlies zal de reproduceerbaarheid van sferoïde vorming en de resultaten van sferoïde-gebaseerde testen met de vloeistof-overlay techniek te verbeteren verminderen.
Abstract
Tumormodellen die nauw nabootsen in vivo omstandigheden worden steeds populairder in geneesmiddelen en ontwikkeling voor de screening van potentiële geneesmiddelen tegen kanker. Meercellige bolvormige tumoren (MCTSes) effectief te bootsen de fysiologische omstandigheden van solide tumoren, waardoor ze uitstekend in vitro modellen voor lead optimalisatie en target validatie. Van de verschillende technieken beschikbaar voor het MCTS cultuur, de vloeistof-overlay methode op agarose is een van de meest goedkope werkwijzen voor MCTS genereren. Echter, de betrouwbare overdracht van MCTS culturen die vloeibare-overlay voor high-throughput screening worden beïnvloed door een aantal beperkingen, waaronder de bekleding van microtiterplaten (MPs) met agarose en irreproducibility uniforme MCTS formatie in putten. MPs significant gevoelig voor effecten die resulteren uit overmatige verdamping van medium vanaf de buitenzijde van de plaatrand, die het gebruik van de gehele dienblad drugproeven. Dit manuscript bevat gedetailleerde technische verbeteringen aan de vloeistof-overlay techniek om de schaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van uniforme MCTS vorming verhogen. Daarnaast, details op een eenvoudige, semi-automatische en universeel toepasbare software tool voor de evaluatie van MCTS beschikt na de behandeling met geneesmiddelen wordt gepresenteerd.
Introduction
Kankercellen in tumoren fysiologisch gerangschikt in een complex, 3-dimensionale (3D) structuur omgeven door extracellulaire matrix en interagerende cellen. Daar bijna alle cellen in weefsels in een 3D-omgeving bevinden, is de behoefte aan meer fysiologisch relevante in vitro tumormodellen die tumor eigenschappen nabootsen geleid tot de ontwikkeling van verschillende 3D kweektechnieken 1, 2, 3. Deze modellen worden nu fundamenteel onderzoeksinstrumenten voor het bestuderen van de rol van de tumor micro op metastase en celrespons op therapeutica 3D 2. Bovendien, in vergelijking met 2-dimensionale (2D) celculturen 4, 3D apparaten kan een beter begrip van tumor-stroma interacties, welke cel signaalroutes beïnvloeden.
Multicellulaire bolvormige tumoren (MCTSes) kankercellijnen worden vaak gebruikt in 3D cel cultuur modellen als gevolg van hun relatieve nabijheid van in vivo tumoren. Van de verschillende technieken gebruikt, is de vloeistof-overlaytechniek (LOT) MCT generatie on-agarose gecoate platen significant belang voor lead optimalisatie en targetvalidatie 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 bereikt. Dit blijkt uit de recente studies die met succes kunnen pilot-schermen van collecties van chemische moleculen draaien in MCTS culturen met behulp van LOT 6, 7 waren. Echter, well-to-well variabiliteit in MCTS morfologie en groei als gevolg van de verdamping veroorzaakte ongelijke verlies van het medium komen vaak hindernissen die de LOT met behulp van microtiterplaten (MPS) te begeleiden. Bijgevolg is de vorming van niet-uniforme MCTSes compromitteert de betekenis en relevantiegegevens van farmacologische assays 8, 12, 13. Naast de reproduceerbaarheid kwesties ander praktisch probleem dat LOT-based high-throughput assays beïnvloedt is de bekleding van de MPs met agarose bij automatische vloeibare toedieningseenheden. Hoewel de afgifte-eenheid verwarmd tot de gelering agarose voorkomen kan worden gehouden, het verstoppen van de afgifte cassette leidingen is een potentiële zorg voor robotsystemen 6.
Om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, hebben we onlangs bedacht een paar wijzigingen in de LOT voor MCTS cultuur 8. Deze wijzigingen zijn voornamelijk gebaseerd op de mogelijkheden om ongelijke medium verlies van MPs gebruiken instrumenten die gewoonlijk worden aangetroffen in screeningslaboratoria high-throughput voorkomen. Een gedetailleerde procedure van de gewijzigde LOT voor het genereren van uniforme grootte en reproduceerbare MCTSes over 384-well platen (WP) wordt hier gepresenteerd. Het manuscript geeft een semi-automatische routine voor de evaluatie van MCTS grootte, met name in gedeeltelijk gedesintegreerde, geneesmiddelbehandelde MCTSes dat geen duidelijke begrenzing voor het meten van de doorsnede hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van agarose gecoate platen
- Weeg 0,75 g laag-smeltpunt agarose toevoegen aan 100 ml McCoy's 5A medium (met of zonder fenolrood) zonder serum. Verwarm de oplossing in een magnetron en schud elke 1-2 min de agarose volledig op te lossen. Autoclaaf de oplossing te steriliseren.
- Koel het agarose autoclaaf tot ongeveer 70 ° C en filtreer het door een 500 mL, 0,22 urn filter top door vacuumfiltratie in een laminaire stroming in. Aliquot de 0,75% gefilterde agarose-oplossing (FAS) in kleinere hoeveelheden, zo niet in een keer met behulp van de gehele oplossing. Bewaar deze kant-en-klare agarose oplossing aseptisch in een koude kamer of 4 ° C koelkast gedurende maximaal 4 weken.
- Bevestig een buisje met een kunststof- of metalen top afgeven cassette een Combi reagens dispenser en vul de cassette met 70% ethanol (EtOH) en vervolgens met steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een stroom vak.
- Voor gebruik warmte een opgeslagen hoeveelheid van FAS i n de magnetron om het te smelten. Prime de verstrekking cassette met agarose-oplossing en jas 384-wells, weefselkweek (TC) -behandeld "speciale" microplaten met 15 pi van FAS. Laat de agarose in de plaat afkoelen 15-20 min voor het zaaien van de cellen. Bewaar de agarose-gecoate platen aseptisch, verpakt in een polyethyleen zak in een koude kamer of bij 4 ° C en uit de buurt van direct licht.
OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk verwarmen van de 0,75% FAS een verandering in de concentratie van agarose in de voorraadoplossing voorkomen. -Agarose gecoate plaatjes kunnen worden bewaard gedurende maximaal 2 weken bij opslag onder de bovengenoemde omstandigheden. De FAS geen verhitting nodig heeft tijdens het bekleden van platen. - Maak de verstrekking cassette door priming met 70-80 ° C steriel water om alle resterende agarose in de cassette tips en buizen te verwijderen.
2. Cel Cultuur en MCTS Formation
- Cultuur HCT116 humane colorectaal carcinoom cellen, zoals eerder beschrevenlass = "xref"> 8.
- Verwijder het vereiste aantal-agarose gecoate, 384 putjes, TC-behandelde microplaten van koel- en evenwicht ze op kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min.
- Bereid de Combi reagens dispenser voor cel zaaien door priming een standaard buis doseren cassette met 70% EtOH en steriel PBS. Stel het zaaien volume op het vereiste pi en de afgifte snelheid tot medium met behulp van de handmatige instelling knoppen op de dispenser.
OPMERKING: De gehele cel enten wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden en in een laminaire stroming in. - Distantiëren hechtende cellen uit de weefselkweek kolf met een recombinante cel-dissociatie enzym. Wordt celsuspensie voorraad in een steriele beker met zaad cellen bij een dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / mL per putje in 50 ul volledig groeimedium. Tijdens zenden meerdere 384-WP, roer de cellen met behulp van een magnetische roerder om te voorkomen dat zich afzet op de bodem van het bekerglas.
- laat deplaten rusten 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer 15 minuten bij 4 x g.
- Ondertussen neemt de verdamping reducerende milieu af en giet het met 8 ml steriel H2O of 5% dimethylsulfoxide (DMSO) bij de korte zijden (links en rechts) met een 5 ml pipet (figuur 1A). Eerst afzien 4 ml vulvloeistof in de linker goot opvegen de pipetpunt langzaam op en neer. Herhaal deze stap met de rechter-side trog.
OPMERKING: Zorg dat de vloeistof toegevoegd aan de zijkant troggen niet samen te voegen in het midden van het deksel, en laat een gat voor de gasuitwisseling (Figuur 1A). Toevoegen van een overmaat H 2 O leidt tot lekkage van H2O aan de buitenkant van het deksel en vervolgens in de buitenste putjes van de 384-well platen TC. - Vul het vloeistofreservoir van de 384-well TC plaat met steriel H2O en vervang regelmatig plaat deksels met vloeistof gevulde milieu deksels (Figuur 2A).
- Plaats de platen in een 37 ° C roterende incubator met 95% vochtigheid, 5% CO2 en 20% O2, en laat de cellen te aggregeren tot MCTSes gedurende 4 dagen. Vermijd openen van de incubator deur te lang in de daaropvolgende dagen om te voorkomen dat de luchtvochtigheid abrupt daalt.
3. Medium Exchange Met behulp van een robotsysteem
- Op dag 4 na MCTS vorming, voeg 30 ul van voorverwarmde medium per putje onder toepassing van een geautomatiseerde microplaat ring dispenser. Laat de MCTSes om te groeien voor een extra 3 dagen. Vervang het medium regelmatig elke 3 dagen totdat de gewenste grootte bereiken voor experimenten.
- Om een bepaald volume van het medium uit elk aspireren goed, empirisch passen de z -Hoogte van de wasmachine spruitstuk. Verzamelbak 30 ul van medium per putje en vervangen door 30 pi van verse, voorverwarmde medium.
LET OP: Stel de afgifte snelheid en de snelheid waarmee de wasmachine spruitstuk reistin putten tegen het laagste tarief turbulentie in de putten te minimaliseren.
4. High-gehalte beeldvorming van MCTS en Semi-automatische beeldanalyse
- Beeld de MCTS in een high content geautomatiseerd beeldvormingssysteem met een 4X doelstelling lucht (NA 16).
- Stel de belichtingstijd tot 11 ms en de binning tot 4 x 4. Pas het aantal en de spreiding van de z -stacks en de pixel binning zoals gewenst voor het experiment om een hele MCTS per goed vast te leggen.
- Verwerk de beelden stapsgewijs, zoals beschreven in het "readme," met een eigen routine geschreven programmeertaal.
LET OP: De .m code en .txt readme-bestanden zijn beschikbaar als aanvullende code-bestanden (Figuur 1B). De routine meet de MCTS gebied, grote en kleine assen, perimeter, en stevigheid van de 2D-beelden.
Figuur 1:Bereiding van milieu deksels en een stroomdiagram van de halfautomatische routine. (A) Afbeelding van een verdamping verminderen milieu deksel gevuld met de juiste (links) en een overmaat (rechts) hoeveelheid van het vullen van vloeistof (hier, 5% DMSO). De pijl geeft de kopse goot voor het toevoegen van vloeistof. De asterisk geeft het gat in het midden van het deksel na de toevoeging van de juiste hoeveelheid DMSO. (B) Een werkstroom die de stappen van de semi-automatische beeldanalyse routine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ongelijke verlies van medium, in het bijzonder van de perifere putjes, is een veel voorkomende probleem in Kamerleden met kleine cultuur volumes. Substantieel verbeterde kweekomstandigheden, zoals incubatoren met goed gecontroleerde temperatuur / bevochtigingsystemen en verdamping verminderen MPs en plaat deksels, verminderen significant verlies drager in putjes 8. De relatieve verdamping te meten, gelijke volumes Orange G (OG) werden aan elk putje toegevoegd en de verandering in absorptie OG dan 3 dagen werd opgenomen in platen met regelmatige en milieu deksels in standaard en roterende incubatoren. Putjes werden verdeeld in 6 groepen gebaseerd op de afstand tot de rand van de plaat (figuur 2A). In groepen 1-4, was er een significante verandering in de absorptie van de OG tijd in platen met regelmatige deksels in een standaard incubator (figuur 2B). Hoewel er ook een variatie in absorptie van OGgroep 1 putjes in platen onder de milieuomstandigheden deksel / roterende incubator combinatie (figuur 2C), de variatiecoëfficiënten (cv's) waren veel lager dan die van de platen met regelmatige deksels in een standaard incubator (figuur 2D).
De verdamping veroorzaakte ongelijke verlies van medium is een van de mogelijke redenen voor de well-to-well variabiliteit in MCTS grootte en assay uitlezing in Kamerleden 8. Echter, 384 TC-wells platen met de milieu deksel / roterende incubator combinatie resulteerde in de vorming van uniforme MCTSes over de 6 groepen van putjes (figuur 2E). In tegenstelling MCTSes in platen met de reguliere deksel / standaard incubator combinatie variëren sterk in grootte en stevigheid (figuur 3F). Solidity is een maat MCTS bolvormigheid en geeft de mate van desintegratie van de MCTS. De stevigheid van een 2D gebied is het deel van de pixels in de convex romp van het gebied van belang (ROI) en wordt bepaald door het gebied van de ROI te delen door het oppervlak van de bolle romp van het ROI. Zowel ronde en elliptische regio's hebben een soliditeit van 1, en zoals het MCTS uiteenvalt, de soliditeit afneemt. Het verschil in gebied reeds gerapporteerd in Das et al. (2016) 8. Het volume werd berekend op basis van de grote en kleine assen van de MCTSes.
Figuur 2: Platen met minimale verdamping resulteren in verhoogde MCTS reproduceerbaarheid. (A) Een plaat kaart wordt voorgesteld de verdeling van putjes vertonen in 6 groepen. (B en C) Er is een aanzienlijke tijdsafhankelijke verandering van de relatieve absorptie van OG uit putten in groepen 1-4 in platen gekweekt in een standaard incubator met geregelde deksel (B) en uit groep 1 wells in platen met milieu deksels in een roterende incubator (C). Dag 3-5 OG absorptie zijn genormaliseerd tot dag 0. (D) gemiddeld cv's van OG absorptie van groep 1 putten uit dagen 3-5 worden getoond voor de twee platen deksel / incubator combinaties. CV's zijn gemiddelden van 3 onafhankelijke experimenten. (E) MCTSes gevormd in platen met de milieu-deksel / roterende incubator combinatie niet significant verschillen tussen de 6 groepen van putten. (B) echter platen met regelmatige deksels in een standaard incubator gevormd MCTSes van variabele grootte. Gegevens worden getoond voor n> 60 MCTSes per groep. De dozen en horizontale balken binnen de vakken in de boxplots vertegenwoordigen de 25 ste en 75 ste percentiel en de mediaan, respectievelijk. De whiskers vertegenwoordigen de 5e en 95e percentielen en de uitbijters aangegeven door de uitgelijnde zwarte stippen in de boxplots. De p-waarden van de Kruskal-Wallis analyse worden hieronder weergegeven each boxplot. De gegevens zijn afkomstig van ten minste 3 onafhankelijke experimenten per plaat deksel / incubator combinatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de potentiële toepasbaarheid van de routine bepalen werden 7 dagen oude MCTSes behandeld met paclitaxel (PTX), vincristine (VCR), oxaliplatine (OXA), doxorubicine (DOX) en 5-flurouracil (5-FU) bij 3 verschillende concentraties gedurende 4 dagen. De drugs werden verkregen uit het Academisch Ziekenhuis Olomouc, Palacky University. De MCTS beelden werden vervolgens geanalyseerd, en het gebied, grote en kleine assen, perimeter, en de soliditeit van behandelde MCTSes werden vergeleken met controles (CTL). De grote en kleine assen zijn gebruikt om het geometrische volume berekenen. Er werd een concentratie-afhankelijke afname MCTS stippellijn volume na behandeling met geneesmiddelen (Figuur 3). Hoewel 0,001 ug / ml VCR en 0,4 ug / ml DOX en 5-FU resulteerde in toename MCTS gebied, het volume werd significant verhoogd na slechts 0,001 pg / ml VCR. MCTS perimeter significant verschilde slechts bij de hoogste concentraties van PTX, DOX en 5-FU, die volledig beïnvloed MCT grootte. PTX en VCR bij 0,25 ug / ml en 0,06 ug / ml en DOX en 5-FU bij 100 ug / ml resulteerde in een significante afname van de stevigheid, wat wijst op een volledige tot gedeeltelijke desintegratie van de MCTSes (figuur 3).
Figuur 3: Meet de effecten van geneesmiddelen in MCTSes door de semi-automatische routine. (A) Foto's van CTL en geneesmiddel behandelde MCTSes worden gepresenteerd. Schaal bar = 10 micrometer. Concentraties in ug / mL worden gegeven voor elk beeld. (B) De grafieken tonen een dosis-afhankelijke effect van PTX, VCR, oxa DOX en 5-FU op deoppervlakte en inhoud van 7 dagen oude MCTSes na 4 dagen van de behandeling. MCTS perimeters significant verminderd na 0,25 ug / ml PTX en 100 ug / ml DOX en 5-FU. Geneesmiddelconcentraties die resulteerde in een totale naar gedeeltelijke desintegratie van MCTSes aanzienlijk verminderd MCTS stevigheid in vergelijking met CTL. De gegevens zijn het gemiddelde ± SD van ten minste 5 MCTSes van 3 onafhankelijke platen. * p <0,001, # p <0,01, φ p <0,05 geneesmiddel behandelde versus CTL, eenzijdige ANOVA met meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Coating 384-Well TC Platen met Filtered Agarose
De gangbare praktijk in LOT is een 1-1,5% laag smeltpunt agarose gebruiken om de vacht van de platen, die de agarose en / of apotheekhoudend apparaat heeft verwarmd te worden gehouden aan de geleren van de agarose 6 te voorkomen. Het geleren van de agarose is potentieel problematische tijdens het bereiden van meerdere platen met vloeibare afgeven cassettes met slangetjes openingen variërend tussen 0,2 en 0,4 mm in diameter. Om het potentieel probleem van verstopping van de afgifte cassettes overwinnen, 0,75% FAS werd gebruikt, omdat geen extra verwarming vereist tijdens het afgeven. Overigens werd ook waargenomen dat een 0,75% FAS niet zo snel ongefilterde 1-1,5% of zelfs 0,75% agarose oplossing heeft geleert. Met behulp van 0,75% FAS, het duurt minder dan 35 s voor het coaten van een volledige 384-wells TC plaat zonder verstopping van de afgifte cassette. De cassette kan aan het eind worden gereinigd door priming met verwarmd water om de resterende een te verwijderengarose, waarbij de tips kunnen verstoppen wanneer de cassette niet in gebruik is.
Milieu Deksel en Rotary Incubator ten opzichte van reguliere plaat deksel en Incubator
De afdamping geïnduceerde ongelijke verlies drager wezenlijk beïnvloedt de reproduceerbaarheid van uniforme MCTS vorming en bijgevolg afbreuk doet aan de resultaten van de assays 14. Verrassenderwijs groep 1 putjes van 384 TC-wells platen onder de milieuomstandigheden deksel / roterende incubator combinatie toonde een statistisch significante variatie in OG absorptie (Figuur 2C). Echter, een lage CV OG absorptie in groep 1 putjes aangeeft dat de verdamping in de buitenste putjes van de 384-well platen in de TC roterende incubator milieu- deksels is niet overdreven om MCTS groei (figuur 2D) beïnvloeden. Dit blijkt uit de uniforme grootte MCTSes gevormd in groep 1 putjes in platen met het milieu deksel / roterende incubator combinatie. Ook minder verliesvan middelgrote voorkomt well-to-well variabiliteit in drug testen van 384-wells TC platen gekweekt in de roterende incubator met milieu-deksels 8.
De gepresenteerde methode leidt eveneens tot de vorming van uniforme MCTSes van enkele andere kanker en niet-carcinomateuze cellijnen 8. Aangezien alle cellen niet inherent aggregeren in MCTSes op een niet-hechtende oppervlak, deze werkwijze veel niet geschikt voor andere cellijnen die niet werden getest op de reproduceerbaarheid van uniforme MCTS formatie. Bovendien lag de nadruk vooral op het gebruik van een geavanceerde technologie-incubator in combinatie met verdamping verminderen van parlementsleden en plaat deksels om de reproduceerbaarheid van MCTS vorming verhogen. Nog een goedkope en eenvoudige oplossing voor de reproduceerbaarheid van MCTS vorming toename van het gebruik van embryo-grade minerale olie en ademend kan zijn afdichtingstape of membranen die verdamping te voorkomen maar laat normale gasuitwisseling 15. Hoewel agarose voegt extra dikte bodems, die een belemmering voor high-gehalte imaging kan zijn plaat, is de diepte van het veld gecreëerd door een agarose bodem in doorgelaten licht beeldvorming niet de vaststelling van MCTS grootte belemmeren en vorm na behandeling met geneesmiddelen. Daarom zal de gepresenteerde methode van potentieel belang voor onderzoekers geconfronteerd reproduceerbaarheid vraagstukken op het lot van MCTS cultuur.
Semi-automatische beeldanalyse Routine
Hoewel er vele semi-automatische / geautomatiseerde software voor beeldanalyse MCTS, het meten van de grootte van volledig naar gedeeltelijk gedesintegreerd MCTSes na behandeling geneesmiddel foutgevoelig 16, 17. In de eerste stap van de gepresenteerde routine, is de best-gericht beeld automatisch geselecteerd uit de verzameling van z -stack beelden door het berekenen van de norm van de gradiënt van het beeld en het selecteren van degene met de grootste 0.999 quaNTILE. Dit is een robuuste en noise-ongevoelige maat voor het maximum.
Vervolgens worden de donkere randen bijgesneden en de verwerkte beelden worden op de oorspronkelijke resolutie Portable Network Graphics formaat opgeslagen. Dit proces vermindert de totale omvang van 2,5 GB, van het afbeelden van een volledige 384-wells, TC-behandelde plaat, tot ongeveer 100 MB. Vervolgens wordt het midden van het MCTS gevonden via een convolutie met een circulaire filter door de gebruiker gedefinieerde radius (we gebruiken 20 pixels Figuur 4A). Een duidelijke lokaal minimum van de gefilterde afbeelding geeft de positie van het midden (Figuur 4A). Verplaatsen naar het centrum concentrische ringvormige openingen, is de gemiddelde grijswaarde, M in iedere houder berekend als functie van de straal shell, R. Daarna wordt de eerste (aanzienlijke) maximaal de numerieke afgeleide van de functie M (R) is gevonden (Figuur 4B). Het punt M OPT van dit maximum wordt genomen als de optimale drempel, en het beeld is segmented door drempelwaarden op dit niveau.
MCT is geïdentificeerd als de grootste centrale deel van het beeld. Deze procedure werkt gewoonlijk beter dan de standaard drempelwaarde techniek omdat het in staat is de MCTS onderscheiden van hoofd- desintegrerende onderdelen die vaak het gevolg van medicatie (figuur 4C en 4D). Bovendien is de hier gekozen benadering maakt impliciet gebruik van de bolvorm van het MCTS. Eenvoudige drempelwaarde routines of algoritmen gebaseerd op actieve contouren, niet a priori kennis dat een bolvormig voorwerp te vinden benutten. Wanneer het MCTS duidelijk wordt gedetecteerd en afgebakend, de maximale M OPT is duidelijk en single. De routine meet vervolgens de kenmerken van het MCTS, zoals het gebied, grote en kleine assen, perimeter, en de soliditeit van de gemonteerde ellips, en bespaart een preview van de gesegmenteerde afbeelding. Indien het maximum niet duidelijk, en / of meerdere lokale maxima aanwezig zijn, een preGezien de voorgestelde segmentatie wordt opgeslagen in een correctie map.
In de voorlaatste stap, de routine loopt de gebruiker via de map correctie van de voorgestelde segmentatie handmatig aanpassen door de drempelwaarde hoger of lager en het selecteren van een veelhoekige interessegebied eventuele overtollige gedeelten van het masker af. Hierna handmatige correctie, de routinemaatregel en slaat de MCTS kenmerken, zoals hierboven beschreven.
Figuur 4: Illustratie van het beeld segmentatie procedure. (A) Het centrum van de MCTS wordt gemarkeerd met een asterisk groen. Een voorbeeld van de annulus wordt aangezogen rood. (B) De gemiddelde grijswaarde in elk reservoir wordt uitgezet als functie van de straal reservoir (blauwe lijn). De numerieke afgeleide van deze curve wordt berekend (rode lijn). De eerste substantiële maximum van de numerieke afgeleide is gevonden (zwart asterisk). (C) De daaruit voortvloeiende correcte segmentatie van de afbeelding in het MCTS kern en de achtergrond met de desintegrerende MCTS onderdelen. (D) Onjuiste segmentatie verkregen door methode Otsu's. 4X doelstelling; Schaal bar = 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Tsjechische ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport (LO1304) en de technologische Agentschap van de Tsjechische Republiek (TE01020028). De auteurs willen graag bedanken Dr. Lakshman Varanasi voor het nemen van de foto's van milieu-deksels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
- Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
- Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
- Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
- Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
- Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).
- Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
- Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
- Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
- Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103 (2016).
- Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
- Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).
