Summary
Live-cell bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för att visualisera dynamiska processer. Undersökningen av fasta celler ger bara statiska bilder, vilket kan leda till feltolkningar och förvirring om processen. Detta arbete presenterar en metod för att studera upptag, läkemedelsfrisättning och intracellulära lokalisering av liposomalt nanopartiklar i levande celler.
Abstract
Konventionella avbildningstekniker kan ge detaljerad information om cellulära processer. Dock denna information bygger på statiska bilder i ett annars dynamiska system och successiva faser är enkelt glöms bort eller misstolkas. Live-cell imaging och time-lapse mikroskopi, där levande celler kan följas för timmar eller dagar i en mer eller mindre kontinuerlig mode, är därför mycket informativ. Protokollet beskrivs här tillåter för utredning av kemoterapeutiska nanopartiklar öde efter leverans av doxorubicin (dox) i levande celler. DOX är ett intercalating medel som måste släppas ut från dess nanocarrier att bli biologiskt aktiva. Trots dess kliniska registrering för mer än två decennier, är dess upptag, nedbrytning och läkemedelsfrisättning fortfarande inte helt klarlagt. Denna artikel utforskar hypotesen att lipid-baserade nanopartiklar tas upp av tumörcellerna och har långsamt försämrats. Släppta dox är sedan flyttad till kärnan. För att förhindra fixering artefakter, kan live-cell imaging och time-lapse mikroskopi, beskrivs här experimentella, tillämpas.
Introduction
Förmågan att följa en biologisk process, såsom cell-cell interaktioner, inter- och intracellulära transport, cytotoxiska sammansatta upptag och protein-protein interaktioner av enstaka molekyler i levande celler och vävnader, har fått stort intresse under senaste decenniet, eftersom det ger en extra dimension av ”realtid”. I detta manuskript beskrivs en metod för att följa intracellulära öde gratis dox och dox införlivas i nanopartiklar (Dox-NP).
Nanopartiklar har använts i decennier för att behandla vissa cancerformer. DOX-NP har godkänts för behandling av AIDS-relaterat Kaposis sarkom, avancerade cystor och bröstcancer, och multipelt myelom1. Det var en av de första liposomalt nanopartiklar utvecklades och infördes i den kliniska inställningen. Fri form, dox, rensas kraftigt från blodcirkulationen, begränsar dess förmåga att nå webbplatsen tumören i tillräckliga mängder. Dessutom åtföljs behandling av svår och dosbegränsande biverkningar, såsom stomatit och hjärtsvikt. När inkapslade i pegylerat liposomalt nanopartiklar ökar cirkulationen tiden från minuter till dagar2. Denna typ av kolesterol-innehållande Liposom är ganska stabil och denna stabilitet avgör farmakokinetiken för inkapslade drogen.
Denna styvhet har dock en baksida. En förening mot tumörceller cytotoxiska förmåga är första utvärderades in vitro-och det har visats att dox är mer potent än Dox-NP i cytotoxiska analyser3,4. Det antogs att bäraren stabilitet förhindrar frisläppande och cellernas upptag av läkemedlet, och det är värt att undersöka fenomenet ytterligare. Liposomalt egenskaper, byggt att hålla aggressiva elementen i blodet och att nå webbplatsen tumören intakt, resulterade i försämrad biotillgängligheten av cytotoxiska komponenten (dvs dox) på målwebbplatsen (dvs tumören cellkärnan). Även Dox-NP förbättrades hardily svar jämfört med fri form, var det fortfarande av kliniskt värde, eftersom inkapsling reducerade signifikant den kardiotoxiska effekter5. Under de följande åren, var andra föreningar inkapslad i nano-bärare6. Även ändra bärarna medförde utlöst läkemedelsfrisättning (dvs. på webbplatsen tumören) men underhålls stabilitet i blodcirkulationen7,8. Trots år av utredning och klinisk användning är nanocarriers som Dox-NP intratumoral öden fortfarande inte helt klart. I en senaste publikation visades det att nanopartikelportföljen tas upp som helhet medan dox förblir instängda i lysosomer9.
Cellernas upptag av en nanopartikel och drog release är dynamiska processer som bäst kan övervakas med hjälp av live-cell imaging. Övrigt klassiskt histologi, där celler inkuberas och därefter fast, kan ge falska resultat om fixering förstör liposomalt transportören och introducerar artefakter. Det viktigaste kravet för live-cell imaging är visualisering, helst genom fluorescens, av önskad processen. Vissa föreningar, liksom dox, har en inneboende röd fluorescens. Även fluorescerande markörer kan införas i flygbolaget och cell organeller kan visualiseras med hjälp av live-cells markörer. På detta sätt kan en rad parametrar, såsom upptag av transportören, läkemedelsfrisättning och cellulär lokalisering av transportören och drog, avbildas och analyseras. Här beskrivs en metod där intercellulära öde dox och Dox-NP i flera tumörceller följs i realtid. Denna metod kan också enkelt anpassas att skapa idealiska förutsättningar för riktade (t.ex. debiteras nanopartiklar10) och utlöst (t.ex. hypertermi7) läkemedelsfrisättning.
Protocol
1. beredning
- montera imaging kammaren, som består av två delar.
- Placera en 25 mm ljusöppningen ( figur 1A -1) på den nedre delen av kammaren ( figur 1A -2) och skruva fast den övre delen i den nedre delen ( figur 1A -3). Dra inte åt för hårt, eftersom glaset kan gå sönder. Autoklav hela kammaren ( figur 1A -4).
- Förbereda cellodlingsmedium genom att komplettera Dulbecco ' s ändrad Eagle ' s Medium (DMEM) utan fenolrött med 10% Värmeinaktiverade fetalt kalvserum (FCS) och 1 mM L-glutamin under sterila förhållanden. Förvaras vid 4 ° C och varma till 37 ° C före användning.
- Upprätthålla cellerna med cellodlingsmedium i odling kolvar med standard cell kultur tekniker.
Obs: Här, två mus cellinjer, melanom B16BL6 11 och Lewis lung carcinom (LLC), och två mänskliga melanom, BLM och 1F6 12, användes. - Gör 0,1% gelatin genom vägning och upplösa gelatin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C över natten. Sterilisera lösningen genom att filtrera det genom ett 0,22 µm filter och lagra den på 4 ° C.
2. Platta celler
- bort imaging kammaren från sterilisering påsen i ett laminärt flöde skåp, försiktigt dra åt kammaren och placera den i en petriskål.
Obs: För att undvika kontaminering, hålla imaging kammaren i en petriskål tills kammaren kan placeras under lupp. - Coat imaging kammaren glas med 1 mL 0,1% steril gelatin under 20 minuter vid 37 ° C och 5% CO 2.
Obs: Detta gör att bättre cell fastsättning. - Ta bort mediet från cell kultur kolvar (se steg 1.2 och 1.3), tvätta en gång med 1 x PBS och lossa cellerna med 0,25% trypsin. Inaktivera trypsin genom att lägga till cellodlingsmedium, samla cellerna, snurra dem ner vid 1100 x g i 5 min och återsuspendera pelleten i 5 mL cellodlingsmedium.
- Späd 20 µL cellsuspension med 20 µL av trypan blå (som kommer att tas upp av döda celler). Räkna antalet levande och döda celler som använder en hemocytometer; antalet döda celler bör inte överstiga 10%.
- Sug ut gelatinet och platta celler i en spädning som möjliggör maximalt 70% täckning inom 24 h. Till exempel använda en utspädning av 5 x 10 4 eller 10 x 10 4 celler i 1 mL. Tillåta cellerna att följa vid 5% CO 2 och 37 ° C under 24 h.
3. Time-lapse mikroskopi ( figur 2)
Obs: här, en confocal Mikroskop med en skräddarsydd scenen hållare användes, även om de flesta tillverkar erbjuder ett utbud av inkubatorer för live-cell imaging som är även lämplig att undersöka nanoparticulated drogen leverans.
- Utvärdera cellerna under ett mikroskop för konfluens, cellulära morfologi och kontaminering. Placera kammaren tillbaka i CO 2 inkubatorn.
Obs: Konfluens bör inte överstiga 70%. Om cellernas morfologi är inkonsekvent (dvs cellerna inte klibbar) eller förorening upptäcks, kassera imaging kammaren. - Slå på mikroskopet confocal ( figur 1E -1), fluorescerande ljus ( figur 1E -2) och dator ( figur 1E -3).
- Ansluta lins värmaren till målet och ange den till 35 ° C ( figur 1E -4 + insert).
- Förbereda enheten inkubation, som visas i figur 1B.
Obs: Denna enhet består av en uppvärmd scenen ( figur 1B -1), ett flöde skede med en kontakt till CO 2 rören ( figur 1B -2) och CO 2 sond ( figur 1B -3), och en röd balansdagens patch ( figur 1B -4). Denna patch används för att tillfälligt stänga enheten tills imaging kammaren placeras. - Placerar inkubation enheten på Mikroskop scenen och Anslut i - och ut - flow CO 2 rören ( figur 1E -5). Öppna CO 2 huvudventilen ( figur 1E -6) och växla på CO 2 controller ( figur 1E -7). Kontrollera att handkontrollen är satt till 5% CO 2.
Obs: För luftfuktighet, CO 2 passerar genom en luftfuktare ( figur 1E -8). Vid hypoxi experiment, en separat O 2 regulator ( figur 1E -9) ingår i konfigurationen. - Ställa in steg temperaturen till 37 ° C ( figur 1E -10). För hypertermi experiment, Ställ in temperaturen till 42 ° C. Tillåt inkubation enheten att nå den valda temperaturen och CO 2 procentandel.
- Ta imaging kammaren från de huvudsakliga CO 2 inkubator och transportera kammaren i en petriskål till mikroskopi rummet.
- Placera den imaging kammaren ( figur 1A -4) i en skräddarsydd, 35 mm diameter stage innehavaren ( figur 1A -5) och Stäng kammaren med skräddarsydda tätande lock ( Figur 1A -6).
Obs: Locket gör CO 2 att passera och förhindrar avdunstning och kontaminering.- Öppna enheten inkubation, ersätta röda lappen med imaging kammaren och stänga enheten ( figur 1 c). Gör detta så fort som möjligt för att förhindra nedkylning av cellerna. Kontrollera att inga kablar har fastnat mellan scenen och mikroskopet.
- Lämna enheten acklimatisera sig för 30 min.
- Öppna programvaran och Aktivera lasrar.
Obs: Här, 488 nm argon, 543 nm helium-neon och 633-nm helium-neon lasrar användes. - Göra en ny databas genom att klicka " New " under fliken fil namn och spara databasen.
- Ange konfigurationen genom att klicka " Config " under fliken förvärva Välj " kanalläge " och " enda spår " att utvärdera en enda fluorophore eller " Multi track " för flera fluorophores. Välj lämplig band-passera filter matchande fluorophore (t.ex. 560 till 615 nm band-passera filter för dox och Dox-NP, se representativa resultat för fler exempel). Välj ljusa fält kanalen i ett av spåren.
- Ange att skanna kontrollen genom att klicka " Skanna " under fliken förvärva Set ramstorleken (1 024 x 1 024), scan hastighet (optimalt), skanna riktning (8-bitars, enkel) och skanna genomsnittet (4) genom att klicka på " läge. " ange pinhole (200 µm), få och offset () t.ex., 580, 700 och 835; (se figur 3), och laser power (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) genom att klicka på " kanaler. "
- Spara dessa inställningar genom att klicka " Config " i konfigurationen tab och spara dem i konfigurationsdatabasen.
- Ange den time-lapse genom att klicka " Multi tid X " ( figur 1 d) makro på fliken Klicka " enda läge ".
- Att hålla cellerna i fokus, Välj automatisk fokus i makrot genom att klicka " Auto fokus. "
Obs: autofokus uppnås med 633-nm laser med reflektion av glaset som en referenspunkt. - Använda sparade konfigurationen genom att klicka på " enda spår " eller " Multi track, " rullning krävs konfiguration i konfigurationsdatabasen, ställa in tidsintervallet (t.ex., 15 min), antal skanningar (t.ex., 97) och Klicka på " laddar Config. "
Obs: använder dessa inställningar, en tid-rad 97 x 15 min = 24 h kommer att göras. - Namn på time-lapse i den " Base filnamnet " och välj databasen (tillverkad i steg 3.11) genom att klicka " Image Data Base " Spara den time-lapse. Ange en tillfällig mapp genom att klicka " Tmp bild mapp. "
Obs: om systemet slutar eller kraschar av någon anledning, bilderna finns i denna mapp. - Öppna ruvande enheten, lyft imaging ringen, Lägg en droppe av nedsänkning olja till målet och stänga enheten så fort som möjligt. Fokusera och markera en position i imaging kammaren.
Obs: Denna ståndpunkt innehåller celler i en enskiktslager, med ett minimum av 70% konfluens, möjliggör avbildning av enskilda celler. - Kontrollera konfigurationsinställningarna för bakgrunden och korrigera om så behövs.
Obs: Bakgrunden kan korrigeras genom att minska vinsten eller laser makt. Ändringar i konfigurationen måste sparas (se steg 3.17) och lastas (se steg 3.18) igen i makrot. - i laminärt flöde skåp, späd fritt läkemedel eller nanopartiklar på en koncentration av 5 µg/mL läkemedel eller 0.05 µmol av lipider i cellodlingsmedium. Filtrera genom ett filter med 0,22 µm i sprutan om de drog/nanopartiklarna inte är sterila.
- Öppna ruvande kammaren, lyft på försegla locket, ta bort mediet från cellerna, tillsätt 1 mL av utspädda läkemedlet/nanopartiklar och stänga enheten så fort som möjligt.
- Fokusera på celler och start den time-lapse genom att klicka " starttid " i makrot Multi tid X.
- Kontrollera regelbundet för att se om cellerna är fortfarande i fokus eller använda autofokus (se steg 3.16). Programmet sparar automatiskt de time-lapse i databasen. Stäng inte databasen medan programmet körs.
4. Dataanalys
- beroende på den ursprungliga frågeställningen, använda programvaror såsom ImageJ för dataanalys (se avsnittet resultat för exempel).
Representative Results
Märkning liposomalt bärare med olika markörer har ändrats tidigare beskrivna9. Bärare med mån dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine perklorat (gjorde; Ex = 644 nm. EM = 665 nm) eller grön 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm. EM = 515 nm) presenteras i detta manuskript. Visa intercellulära likheter och skillnader i liposomalt upptag, release och intracellulära lokalisering, flera tumörtyper studerades. Dessa inkluderar två mus linjer, B16BL6 melanom11 och Lewis lung carcinom (LLC), och två mänskliga melanom, en mycket metastaserande (BLM) och en icke-metastaserande (1F6) melanom12,13. Alla experimenten utfördes med hjälp av levande celler. I alla experiment administrerades en koncentration av 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP eller 0.05 µmol av nanopartiklar för 3 eller 24 h. mätt och analyserat dox (i gratis, släppt, inkapslade, beslagtagna eller ortodoxas form) var kallat DXR. En 40 X (numerisk bländare: 1.3) olja objektiv användes, och imaging utfördes med en 488 nm argon laser (10% / 0,2 mW power) och 505 till 550 nm band-passera filter för CF-PE och lysosomala markör (LM)-grön. 543 nm helium-neon laser (100% / 0,2 mW power) och ett 560 till 615 nm band-passera filter användes för dox, Dox-NP och lysosomala markör-röd. 633 nm helium-neon laser (100% / 0,5 mW power) och 640 nm lång-pass filter användes för gjorde.
På grund av dess inkapsling var den i vitro cytotoxicitet, biotillgänglighet och farmakokinetik dox betydligt förändrad3,9,14. Skillnaden mellan biotillgängligheten av läkemedlet när det ges i fri och inkapslad form demonstreras i figur 3. DOX är en intercalating agent och måste ange cellkärnan att bli cytotoxisk. Figur 3 och relaterade filmer 1 och 2 visar en 3 h time-lapse av BLM celler behandlas med dox eller Dox-NP under identiska förhållanden. Inom minuter dox exponering, nukleära DXR kan observeras (figur 3A, film 1) och använda en lägre viktökning (infoga), kan ses infoga i kärnan. Däremot när de utsätts för Dox-NP, är intracellulära DXR knappt synlig inom denna tidsram (figur 3B, Movie 2). Endast genom att öka den Fotomultiplikator vinsten, DXR i cytoplasman kan observeras (infoga). Använda ImageJ, analyserades de pixel densiteterna av cytoplasmisk och nukleära DXR. Celler är i rörelse under time-lapse utvärderingen, är det viktigt att kombinera lysrör med ljusa fält bilder. Detta presenterar möjligheten att spåra enskilda celler och stabilisera XY-drivan med specifika plugins i ImageJ. I den analys som presenteras i figur 3, användes ljusa-fältet bilden för att rita en region av intresse (ROI) runt cytoplasman (heldragen linje) och nucleus (streckad linje). ROI chefen i ImageJ kan hittas i menyalternativet analysera > verktyg > ROI manager. Dessa ROIs används i fluorescerande bilden för att analysera pixeltäthet med hjälp av menyalternativet analysera > åtgärd. Skillnaden mellan pixeltätheten i kärnan (figur 3 c) och cytoplasman (figur 3D) av dox - eller Dox-NP-behandlade celler bekräftar vad som syns i bilderna. Dessutom var cellerna inkuberas i 24 h med dox eller Dox-NP, varefter föreningen var ersättas med medium och omedelbart avbildade med ökad känslighet av fotomultiplikatorn vinsten (figur 4). Andra inställningar, till exempel lasereffekt, offset, pinhole och bildvisning, var identiska. Den låga DXR signalen i Dox-NP-behandlade jämfört med dox-behandlade celler är slående. Med en vinst på 700, blir DXR i Dox-NP-behandlade cellerna synligt, medan bilden av dox är redan överexponerad. Detta enkla i vitro experiment visualiserar en signifikant skillnad i biotillgängligheten av gratis kontra inkapslade drogen.
När celler utsätts kontinuerligt för Dox-NP för 24 h, byggs DXR upp över tid, som visas i figur 5A och filmer 3 och 4. Signalen ökar i cytoplasman, och senare DXR finns även interkalenderat i kärnan. Dessa observationer bekräftas av pixel densitet diagrammen (figur 5B). Uppmätta cytoplasmiska pixeltätheten är lägre i BLM jämfört 1F6 celler på grund av skillnaden i intracellulär distribution. Medan DXR i 1F6 cellerna distribueras i hela cellen, är DXR i BLM celler mer koncentrerad i en organell nära kärnan (figur 5 c).
Därför undersöktes localizationen av drogen och bärare i olika cellinjer (figur 6). Cellerna var inkuberas i 24 h med Dox-NP/gjorde och avbildas. Överlagring av cellmembranet (heldragen linje) och nucleus (streckad linje) drogs i fluorescerande bilden av tre olika cellinjer och använder den ljusa-fältet bilden. Det framgår här att flygbolaget, märkt med gjorde, följer samma cytoplasmiska mönster som DXR: koncentrerad i en organell nära kärnan i BLM, runt hela kärnan i LLC, och slumpmässigt utspridda i cytoplasman i B16BL6 celler. I kärnan, endast DXR och ingen kan ses, som anger släppt dox. Genom att minska den Fotomultiplikator vinsten, enskilda cellulära blåsor som innehåller DXR och transportören, märkt med gjorde samt med CF-PE (siffror 6B och 6 C), kan ses.
Cytoplasmiska DXR sequesters i små blåsor och celler var märkt med en live-cell lysosomala markör i grön eller röd. Förflyttning av dessa lysosomer kan följas i cellerna (film 5). Cytoplasmiska DXR och nanocarrier colocalize inom dessa strukturer och intercellulära skillnaden i DXR mönstret, som kan ses i figur 6, förklaras här. Lysosomer är slumpmässigt fördelade i cytoplasman i B16BL6 och ligger bredvid kärnan i BLM celler (figur 7A). Använda ImageJ, colocalization mellan DXR och bärare i lysosomen beräknades (figur 7B). Bilder i färg skedde binärt (Process > binärt > gör binära) och, med hjälp av colocalization plug-in (analysera > Colocalization), en colocalization bilden gjordes av DXR med gjorde. Detta skapar en grön-röd-vit färgad bild, med vita pixlar som representerar de colocalized pixlarna på båda bilderna. Via menyn objekt processen > binärt > gör binära, de vita pixlarna kommer separeras och omvandlas till svarta pixlar, från vilken pixeltätheten mäts (analysera > mått). Därefter en colocalization bild gjordes mellan denna DXR-bilden och binära bilden av lysosomala markör (LM) och pixeltäthet mätt. Colocalization data är andelen pixlar positivt för DXR-gjorde och DXR-gjorde/lysosomala markör (figur 7 c). Att flygbolaget, märkt med CF-PE samt som gjorde, är beläget i lysosomen också visas i figur 7 d.
Figur 1: instrument och utrustning setup. (A) imaging kammare + nödvändigheter. #1 täckglaset med 25 mm (1), nedre delen av kammaren (2), överdel i kammaren (platsd upp och ner) och O-ring (3), skede korthållaren (4) och försegla locket (5). Skalstapeln: 2 cm. B) inkubation enhet. Uppvärmd Mikroskop scenen (1), flöde med i - och ut - flow för CO2 (2), en CO2 sond (3) och en avslutande patch (4). Skalstapeln: 2 cm. C) Imaging kammare i enheten inkubator, som sett under mikroskopet. (D) flera tid series makro. (E) utrustning för avbildning. Inverterade Mikroskop (1), fluorescerande ljus (2), dator (3), ring värmare (4, infoga) och controller (4, huvudsakligt figurerar), CO2 flöde slangar (5), CO2 ventil (6), CO2 -styrenhet (7), CO2 luftfuktare (8), O2 ventil och Controller (9), och scenen temperatur controller (10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av mikroskopet parametrar beskrivs i protokollet avsnitt 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utreda kortsiktiga utnyttjandet av dox och Dox-NP. BLM celler exponerades kontinuerligt för dox eller Dox-NP för 3 h och en time-lapse togs. (A) fortfarande bilder av den time-lapse av cellerna inkuberas med dox. (B) fortfarande bilder av den time-lapse av cellerna inkuberas med Dox-NP. Skalstapeln = 50 µm. (C) Pixel densitet ökning av nukleära DXR i dox - och Dox-NP-behandlade celler. (D) Pixel densitet ökning av cytoplasmisk DXR i dox - och Dox-NP-behandlade celler. Uppgifterna representerar det medelvärde ± SD 3 celler per fält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: undersöka långsiktiga upptaget av dox och Dox-NP i olika cellinjer. Celler utsattes för dox eller Dox-NP och avbildas 24 h senare. Bilder togs omedelbart efter avlägsnande av droger, med 3 olika vinster. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: undersöker cellernas upptag och utsläpp av liposomalt agens. Celler exponerades kontinuerligt för Dox-NP för 24 h, och en time-lapse gjordes. (A) fortfarande bilder av den time-lapse. Skalstapeln = 50 µm. (B) Pixel densitet ökning av DXR kärnan och cytoplasman. Uppgifterna representerar det medelvärde ± SD 3 celler per fält. (C) bilder visar localizationen av DXR inom cellen. Heldragen linje: cellmembranet, prickad linje: nucleus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: undersöka localizationen av drogen och bärare i olika cellinjer. (A) celler var utsatt för Dox-NP/gjorde för 24 h och avbildas. Skalstapeln = 50 µm. (B) celler var utsatt för Dox-NP/gjorde/CF-PE under 24 h och avbildas med en lägre intensitet vinst att särskilja enskilda blåsor. (C) ljus-området och DXR overlay visar DXR i cytoplasmiska blåsor (pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: utredning av intracellulära localizationen av drogen och bärare. Celler utsattes för Dox-NP/gjorde eller CF-PE/gjorde för 24 h och lysosomer visualiseras med live-cell lysosomala märkpenna (LM) i grön eller röd. (A) intracellulära lokalisering av DXR och transportören (gjorde). Pilarna representerar 3 exempel på DXR och gjorde lokaliserade i lysosomen. Skalstapeln = 50 µm. (B) samtidig lokalisering analys av DXR och transportören (gjorde) i lysosomer (LM) använder ImageJ. (C) andelen Co lokalisering av DXR och flygbolaget i lysosomer. Uppgifterna representerar det medelvärde ± SEM 3 individuella experiment. (D) lysosomala komplexbildare transportörens visualiseras med hjälp av två olika markörer. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Movie 1: relaterade till Figur 3 : BLM celler inkuberades med dox för 3 h. Time-lapse: 19 bilder, med ett intervall på 10 min. bildhastighet: 3 fps. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Filmen 2: relaterade till Figur 3 : BLM celler inkuberades med Dox-NP för 3 h. Time-lapse: 19 bilder, med ett intervall på 10 min. bildhastighet: 3 fps. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Filmen 3: relaterade till Figur 5 : BLM celler inkuberades med Dox-NP för 24 h. Time-lapse: 96 bilder, med ett intervall på 15 min. bildhastighet: 8 fps. Skalstapeln = 50 µm.
Movie 4: relaterade till Figur 5 : 1F6 celler inkuberades med Dox-NP för 24 h. Time-lapse: 96 bilder, med ett intervall på 15 min. bildhastighet: 8 fps. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 5: relaterade till Figur 7 : Lysosomer av B16BL6 celler var målat med en live-cell markör. Time-lapse: 10 bilder, med ett intervall på 10 s. bildhastighet: 3fps. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Discussion
Som påpekat tidigare, fixering kan förstöra liposomalt nanocarriers nästan omedelbart och DXR släppt form dessa förstörda liposomer fortfarande hade tid att ange kärnan, vilket gör tolkningen av data mycket svårt och även vilseledande. Med några mikroskopiska justeringar, kan kemoterapeutiska ödet i levande celler och vävnader rutinmässigt undersökas för att bekräfta eller störta histologiska observationer. En nyligen papper visade det upptag, release och lokalisering av DXR i celler behandlas med gratis och inkapslade dox använder live-cell time-lapse imaging9. Detta arbete beskriver den experimentellt ställa in mer i detalj. Med denna modell, är det möjligt att visualisera omedelbar transport av dox till kärnan, där det kontinuerligt ackumuleras tills cellen dör så småningom. När Dox-NP används, finns däremot endast små mängder släppt dox i kärnan. Även om kontinuerlig exponering resulterar i kontinuerlig DXR uppbyggd, fluorescerande signalen är mycket lägre i Dox-NP-kontra dox-behandlade celler, som visar en skillnad i cellulära koncentrationen och efterföljande cytotoxicitet. Dessutom med hjälp av live-cells markörer, visades det att, när utsätta celler till Dox-NP, DXR och nanocarrier ligger i lysosomen. Detta indikerar att den komplett Liposom tas upp av cellen och visar ett endocytic väg medverkan under upptaget av dessa nanopartiklar. DXR i kärnan är tydligt från släppta dox. Dock är använder denna metod, som både DXR och carrier Co lokalisera och verkar vara anhållna i lysosomer, det fortfarande osäkert om detta är inkapslat eller släppt dox. Det är möjligt att nanopartikelportföljen inneboende stabilitet förhindrar dox release när lokaliserad i lysosomen.
I detta protokoll demonstreras live-cell imaging med en specifik mikroskopiska setup, med skräddarsydda scenen hållare (specifikationerna kan ges på begäran). Mest confocal Mikroskop tillverkar erbjuder dock ett utbud av inkubatorer som utför live-cell imaging. Bevara cell odlingsbetingelser (dvs temperatur, CO2, pH, luftfuktighet och sterilitet) är det viktigaste kriteriet av dessa inkubatorer och kräver vissa preliminära tester för att fastställa lämpliga villkor, som förklaras närmare. Automatiserad data förvärv program kan också levereras av samma tillverkar. En ”Multi läge” alternativet gör det möjligt att bild flera positioner i samma kammare, raffinering statistisk analys. Det här alternativet i makrot nämns i detta manuskript kräver dock fasta XYZ positioner, som möjligheten att korrigera för Z-drift är förlorad. Skanna den Z-dimensionen kan inkluderas i detta makro och använder fokus planet för analys. Detta kräver dock extra scanning, ökar möjligheten att fototoxicitet och blekning.
Som med alla fluorescerande mätningar, är överexponering ett problem, särskilt när man jämför två föreningar med en olika cellernas upptag. Fluorescerande intensiteten är inte bara beroende på inneboende signalen av föreningen, utan även på andelen upptag, koncentrationen och drog exponeringstiden. Som visas i figur 3, är nukleära DXR innehållet i dox-behandlade celler redan synliga, medan ingen signal ses i Dox-NP-behandlade celler. Endast genom att öka känsligheten kan DXR i Dox-NP-behandlade celler visualiseras, leder till överexponering i dox-behandlade celler. Dessutom även intracellulärt, Dox-NP är heterogent fördelat, vilket kan resultera i oundvikliga under- eller överexponering. Särskilt när du undersöker cellulära DXR entrapment, minskade vinsten betydligt för att särskilja enskilda organeller (siffror 5B och 5 C). Således åtföljas de mätningar som representeras av pixeltätheten av de representativa bilderna för korrekt tolkning av resultaten.
Fototoxicitet, blekning och en låg signal-brus-förhållande är också viktiga frågor i fluorescerande mikroskopi, och en kompromiss mellan kvaliteten på bilden och bilden förvärvet måste fastställas. Även när Mikroskop installationen är optimal, avgörs bildkvaliteten också till stor del dock av kvaliteten på cellerna och lade till föreningen. DXR ger en stark signal, och med de lämpliga försiktighetsåtgärderna, blekning inte observerades även efter längre perioder (upp till 72 h). Minskning av fluorescerande signalen kan dock också vara ett resultat av efflux. Efflux är ett viktigt fenomen i drogen motstånd15 och uppstår när celler pumpa ut läkemedlet från intracellulära platsen för åtgärden. En minskning av fluorescerande signalen över tid kan därför också vara ett resultat av dox efflux9. Jämföra fluorescerande signalera av en icke-skannas läge i slutet av experimentet med den sista bilden från time-lapse-serien kommer att demonstrera blekning (dvs signalen kommer att vara högre i det icke-skannas läget) eller efflux (dvs båda signaler kommer att vara identiska). Det finns flera correctional alternativ (t.ex. bakgrund, vindavdrift, blekning, etc.) i program som liknar ImageJ16. Som fluorescerande intensiteten ökar över tiden, kan konfigurationsinställningarna också pre utvärderades i ett pilotprojekt experiment för att minimera överexponering i slutet av det time-lapse (steget 3.21). En tänkbar kammare med celler redan utsätts för läkemedlet för önskad tidsperiod kan alternativt användas för att initiera inställningar. Slutligen för denna typ av analys, giftiga läkemedelskoncentrationen (steg 3.22) bör undvikas och förutbestämd använder konventionella bio-analyser.
Celler odlade kontinuerligt och underhålls i medium utan fenolrött. Fenolrött fluorescerar i den röda delen av spektrat och kan observeras i cellernas organeller, troligen lysosomer, presentera falskt positiva information (steg 1.2). För att möjliggöra övervakning av enskilda celler, bör cell sammanflödet inte överstiga 70% (steg 3.1.). CO2 flöde-hastighet (steg 3.5) behöver regleras i ett validering experiment när utrustningen köps eller efter underhåll. När hastigheten är för hög, kommer att medium avdunsta. När hastigheten är låg, kommer att pH av medium öka, vilket kan påverka cellernas tillväxt. Som medium är utan de indikatorn fenolrött pH-förändringarna i pH inte kan observeras och därför förbises lätt. När CO2 flödet valideras, kan dessa inställningar användas i alla framtida experiment.
Med metoden som beskrivs här, kan öde av nanopartiklar lätt undersökas med hjälp av live-cell imaging och time-lapse mikroskopi. I den här proceduren användes kommersiellt tillgängliga nanopartiklar. Men ödet för värmekänslig17, katjoniska liposomer10; liposomer berikad med kortkedjade shingolipids18; och nanopartiklar encapsulating andra droger8,19 undersöktes också på detta sätt i tumören och normala celler.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
De mikroskopi utrymmen som används är en del av stadens Erasmus optisk Imaging, och vi vill tacka Personalen på OIC för sina tjänster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
