Summary
Live-cel imaging is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van dynamische processen. Het onderzoek van vaste cellen biedt alleen statische afbeeldingen, die tot verkeerde interpretaties en verwarring over het proces leiden kunnen. Dit werk presenteert een methode om te studeren opname, drug release en intracellulaire lokalisatie van liposomaal nanodeeltjes in levende cellen.
Abstract
Conventionele beeldvormingstechnieken kunnen gedetailleerde informatie over cellulaire processen bieden. Echter, deze informatie is gebaseerd op statische beelden in een anders dynamisch systeem en opeenvolgende fasen zijn gemakkelijk over het hoofd gezien of verkeerd geïnterpreteerd. Live-cel beeldvorming en time-lapse microscopie, waarin levende cellen kunnen worden gevolgd voor uren of zelfs dagen in een min of meer continu mode, zijn dan ook zeer informatief. Het protocol hier beschreven staat voor het onderzoek van het lot van chemotherapeutische nanodeeltjes na de levering van Doxorubicine (dox) in levende cellen. Dox is een intercalating agens dat moet worden vrijgelaten uit de nanocarrier biologisch actief. Ondanks haar klinische registratie voor meer dan twee decennia, worden de opname, verdeling en drug release nog steeds niet volledig begrepen. Dit artikel verkent de hypothese dat lipide gebaseerde nanodeeltjes worden overgenomen door de tumorcellen en zijn langzaam afgebroken. Vrijgegeven dox is dan translocated aan de kern. Om te voorkomen dat artefacten van fixatie, kunnen live-cel beeldvorming en time-lapse microscopie, beschreven in deze experimentele procedure worden toegepast.
Introduction
De mogelijkheid om het volgen van een biologisch proces, zoals cel interacties, inter- en intracellulair transport, cytotoxische samengestelde opname en eiwit-eiwit interactie van afzonderlijke moleculen in levende cellen en weefsels, grote belangstelling heeft opgedaan in de afgelopen tien jaar, want het biedt de extra dimensie van "real time". In dit manuscript is een methode te volgen van het intracellulaire lot van gratis dox en dox opgenomen in nanodeeltjes (Dox-NP) beschreven.
Nanodeeltjes hebben voor decennia is gebruikt voor de behandeling van bepaalde kankers. Dox-NP is goedgekeurd voor de behandeling van AIDS-gerelateerde Kaposi sarcoom, geavanceerde ovariële en borst kanker en multiple myeloma1. Het was een van de eerste Liposomale nanodeeltjes ontwikkeld en ingevoerd in de klinische setting. De vrije vorm, dox, is enorm gewist uit de bloedsomloop, beperken haar vermogen om de site van de tumor in voldoende hoeveelheden te bereiken. Bovendien gaat behandeling gepaard met ernstige en dosis-limiting neveneffecten, zoals stomatitis of hartfalen. Wanneer ingekapseld in gepegyleerde Liposomale nanodeeltjes loopt op de omloop tijd van minuten tot dagen2. Dit type cholesterol-bevattende liposoom is vrij stabiel en deze stabiliteit bepaalt de farmacokinetiek van encapsulated drug.
Deze starheid heeft echter een keerzijde. De cytotoxische vermogen van een stof naar tumorcellen is eerste beoordeeld in vitro, en het heeft aangetoond dat dox is krachtiger dan Dox-NP in cytotoxische3,4 testen. Het was veronderstelde dat de stabiliteit van de vervoerder de release en een cellulaire opname van de drug voorkomt, en het is de moeite waard om dit fenomeen verder onderzoeken. De intrinsieke Liposomale eigenschappen, gebouwd naar de tumor site intact, duren de agressieve elementen in de bloedstroom en resulteerde in de verminderde biobeschikbaarheid van de cytotoxische component (dat wil zeggen, dox) op de doelsite (dat wil zeggen, de tumor celkern). Hoewel Dox-NP verbeterd hardily de reactie ten opzichte van de vrije vorm, was het nog steeds van klinische waarde, zoals inkapseling aanzienlijk verminderd de cardiotoxische effecten5. In de daaropvolgende jaren werden andere verbindingen ingekapseld in nano-dragers6. Ook wijzigen de vervoerders resulteerde in geactiveerde drug release (dat wil zeggen, op de site van de tumor) maar onderhouden van stabiliteit in de bloed omloop7,8. Ondanks jaren van onderzoek en het klinische gebruik zijn het lot van de intratumoral van nanocarriers zoals Dox-NP nog niet helemaal duidelijk. In een recente publicatie, werd aangetoond dat de nanoparticle in beslag als geheel genomen wordt terwijl de dox opgesloten in de lysosomen9 blijft.
Cellulaire opname van een nanoparticle en drug release zijn dynamische processen die best kunnen worden gecontroleerd met behulp van live-cel imaging. Bovendien, klassieke histologie, in welke cellen worden geïncubeerd en daarna vast, valse resultaten kan geven als de fixatie de liposomale vervoerder vernietigt en artefacten introduceert. De belangrijkste vereiste voor live-cel imaging is visualisatie, bij voorkeur door fluorescentie, van het gewenste proces. Bepaalde verbindingen, zoals dox, hebben een intrinsieke rode fluorescentie. Ook, fluorescente markeringen kunnen worden ingevoerd in de vervoerder, en organellen van de cel kunnen worden gevisualiseerd met behulp van live-cel markeringen. Op deze manier kan een array van parameters, zoals de opname van de vervoerder, drug release en cellulaire lokalisatie van de vervoerder en drug, worden beeld en geanalyseerd. Hier wordt een methode beschreven waarin de intercellulaire lot van dox en Dox-NP in verschillende tumorcellen is gevolgd in real-time. Ook deze methode kan gemakkelijk aangepast worden aan de ideale omstandigheden voor (bijvoorbeeld betalen nanodeeltjes10 gerichte) en getriggerd maken (bijvoorbeeld hyperthermie7) drug release.
Protocol
1. voorbereiding
- de imaging kamer, die uit twee delen bestaat assembleren.
- Plaats van een glas cover 25-mm ( figuur 1A -1) op het onderste gedeelte van de kamer ( figuur 1A -2) en schroef het bovenste gedeelte in het onderste gedeelte ( figuur 1A -3). Niet scherpen te hard, als het glas kan breken. Autoclaaf de hele zaal ( figuur 1A -4).
- Bereiden cel kweekmedium Dulbecco beogen te wijzigen door ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM) zonder fenol rood met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en 1 mM L-glutamine onder steriele omstandigheden. Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C vóór gebruik.
- Behouden de cellen met cel kweekmedium in kolven gebruik standaard cel cultuur technieken culturing.
Opmerking: Hier twee muis cellijnen, melanoom B16BL6 11 en Lewis lung carcinoma (LLC), en twee menselijke melanomen, BLM en 1F6 12, dienden. - Make 0,1% gelatine door wegen en ontbinding van de gelatine in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C's nachts. Steriliseren van de oplossing in het filteren door middel van een 0.22-µm filter en het bewaren bij 4 ° C.
2. Plaat van cellen
- de imaging kamer verwijderen uit de zak van de sterilisatie in een laminaire flow kabinet, zorgvuldig draai van de kamer en plaats deze in een petrischaal.
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, houden de imaging kamer in een petrischaal totdat de kamer worden onder de Microscoop geplaatst kan. - Jas het glas van de beeldvorming kamer met 1 mL 0,1% steriele gelatine gedurende 20 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2.
Opmerking: Zal hierdoor beter cel bijlage. - Het medium verwijderen uit de cel cultuur kolven (zie stap 1.2 en 1.3) keer wassen met 1 x PBS en loskoppelen van de cellen met behulp van 0,25% trypsine. Inactivering van de trypsine door toevoeging van cel kweekmedium, verzamelen van de cellen, draaien ze neer op 1100 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in cel kweekmedium 5 mL.
- Verdun 20 µL celsuspensie met 20 µL van trypan blauw (die zal worden overgenomen door dode cellen). Het aantal levende en dode cellen met behulp van een hemocytometer; het aantal dode cellen mag niet hoger zijn dan 10%.
- Gecombineerd de gelatine en plaat van de cellen in een verdunning die het mogelijk voor een maximum van 70% dekking binnen de 24u maakt. Bijvoorbeeld, gebruik een verdunning van 5 x 10, 4 of 10 x 10 4 cellen in 1 mL. De cellen te houden bij 5% CO 2 en 37 ° C gedurende 24 h. toestaan
3. Time-lapse microscopie ( Figuur 2)
Opmerking: hier, een confocal microscoop met de houder van een op maat gemaakte stadium werd gebruikt, hoewel de meeste fabrikanten een aanbod van starterscentra voor live-cel imaging dat zijn ook geschikt om te onderzoeken nanoparticulated drug delivery.
- Evalueren de cellen onder een Microscoop voor confluentie, cellulaire morfologie en verontreiniging. Plaats de kamer terug in de incubator CO 2.
Opmerking: De confluentie mag niet hoger zijn dan 70%. Als de cellulaire morfologie inconsistent (dat wil zeggen is, de cellen niet aanhangen) of verontreiniging wordt gedetecteerd, negeren de imaging zaal. - Zet de confocal microscoop ( figuur 1E -1), tl-licht ( figuur 1E -2) en computer ( figuur 1E -3).
- De lens kachel verbinden met de doelstelling en stel deze in op 35 ° C ( figuur 1E -4 + Tussenvoegsel).
- Bereiden de incubatie-eenheid, zoals weergegeven in figuur 1B.
Opmerking: Deze eenheid bestaat uit een verwarmd stadium ( figuur 1B -1), een fase stroom met een connector voor de CO 2 buisjes ( figuur 1B -2) en CO 2 sonde ( figuur 1B -3), en een rode sluiten patch ( figuur 1B -4). Deze patch wordt gebruikt om tijdelijk de eenheid sluiten totdat de imaging kamer is geplaatst. - Plaats van de incubatie-eenheid in het werkgebied van de Microscoop en sluit de in - en uitgaand - flow CO 2 buisjes ( figuur 1E -5). De CO 2 hoofdafsluiter ( figuur 1E -6) open en zet de CO 2 controller ( figuur 1E -7). Controleer of de controller is ingesteld op 5% CO 2.
Opmerking: Voor vocht, CO 2 passeert een luchtbevochtiger ( figuur 1E -8). Voor hypoxie experimenten, een aparte O 2 regulator ( figuur 1E -9) is opgenomen in het configuratiemenu. - Steldetemperatuur in fase tot 37 ° C ( figuur 1E -10). Voor hyperthermie experimenten, de temperatuur instellen tot en met 42 ° C. toestaan de incubatie eenheid te bereiken de geselecteerde temperatuur en CO 2 percentage.
- Nemen de imaging zaal van de belangrijkste CO 2 incubator en vervoer van de vergaderzaal in een petrischaal naar de kamer van de microscopie.
- De imaging kamer ( figuur 1A -4) plaats in een op maat gemaakte, 35 mm-diameter stagen houder ( figuur 1A -5) en sluiten de kamer met een op maat gemaakte afdichting deksel ( Figuur 1A -6).
Opmerking: De klep kan CO 2 geschiedde en verdamping en vervuiling.- Open de incubatie-eenheid, vervangen de rode patch met de beeldvorming kamer en sluiten van de eenheid ( Figuur 1 c). Doe dit zo snel mogelijk om te voorkomen dat de afkoeling van de cellen. Ervoor te zorgen dat geen kabels tussen podium en de Microscoop vastzitten.
- Laat de eenheid te acclimatiseren gedurende 30 minuten
- De software niet openen en overschakelen op de lasers.
Opmerking: Hier, 488 nm argon, 543 nm helium-neon en 633 nm helium-neon lasers dienden. - Een nieuwe database maken door te klikken op " New " onder de tab bestand naam en sla de database.
- De configuratie instellen door te klikken op " Config " onder de ophaal tab. Selecteer " kanaal modus " en " nummer " om te evalueren van een enkele fluorophore of " Multi track " voor verschillende fluorophores. Selecteer de juiste band pass filters overeenkomen met de fluorophore (b.v., 560 tot 615 nm band pass filter voor dox en Dox-NP; Zie de resultaten van de vertegenwoordiger voor meer voorbeelden). Selecteer het kanaal helder-veld in een van de tracks.
- De scan instellen door te klikken op " Scan " onder de ophaal tab. Set de framegrootte (1024 x 1024), scan snelheid (optimaal), scannen richting (8-bit, honkslag), en scannen van gemiddelde (4) door te klikken op " modus. " instellen het gaatje (200 µm), gain en compenseren () bijvoorbeeld, 580, 700 en 835; Zie Figuur 3), en macht laser (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) door te klikken op " kanalen. "
- deze instellingen opslaan door te klikken op " Config " in de configuratie tab en ze opslaan in de database voor beveiligingsconfiguratie.
- De time-lapse instellen door te klikken op " Multi tijd X " ( Figuur 1 d) in de Macro tab. Klik " Single locatie ".
- Te houden van de cellen in beeld, selecteer de automatische focus in de macro door te klikken op " Auto Focus. "
Opmerking: Autofocus is bereikt met de laser van de 633 nm met behulp van de reflectie van het glas als referentiepunt.
De opgeslagen configuratie van de toepassing van de - door te klikken op " nummer " of " Multi track, " schuiven naar de vereiste configuratie in de configuratiedatabase, instellen van het interval (bv 15 minuten), aantal scans (bijvoorbeeld 97) en te klikken op " Load Config. "
Opmerking: met de volgende instellingen, een tijd-serie van 97 x 15 min = 24 h geschiedt. - Naam de time-lapse in de " Base bestandsnaam " en selecteer de database (gemaakt in stap 3.11) door te klikken op " afbeelding Data Base " te slaan de time-lapse. Instellen van een tijdelijke map door te klikken op " Tmp Image map. "
Opmerking: als het systeem stopt of voor welke reden dan ook crasht, de afbeeldingen bevinden zich in deze map. - Openen de drachtige eenheid, heffen de imaging ring, een daling van immersie-olie toevoegen aan het doel, en sluiten de eenheid zo snel mogelijk. Focus en selecteer een positie in de beeldvorming zaal.
Opmerking: Dit standpunt bevat cellen in een enkelgelaagde, met een minimum van 70% confluentie, waardoor voor de beeldvorming van afzonderlijke cellen. - De configuratie-instellingen voor de achtergrond controleren en indien nodig corrigeren.
Opmerking: De achtergrond kan worden gecorrigeerd door het verminderen van de macht van de winst of laser. Wijzigingen in de configuratie moet worden opgeslagen (zie stap 3.17) en geladen (zie stap 3.18) weer in de macro. - In de laminaire flow kabinet, Verdun gratis drugs of nanodeeltjes op een concentratie van 5 µg/mL drug of 0.05 µmol van lipiden in cel kweekmedium. Filtreer door een 0,22 µm spuit filter als drug/nanoparticles niet steriele.
- Opent de drachtige zaal, til de klep afdichting verwijderen van het medium in de cellen, voeg 1 mL verdunde drug/nanodeeltjes en de eenheid zo snel mogelijk sluiten.
- Gericht op de cellen en de time-lapse start door te klikken op " Start Time " in de Multi tijd X macro.
- Regelmatig te controleren om te zien als de cellen nog steeds in focus zijn of gebruik de autofocus (zie stap 3.16). Het programma automatisch de time-lapse opgeslagen in de database; Sluit de database niet terwijl het programma draait.
4. Data-analyse
- afhankelijk van de oorspronkelijke onderzoeksvraag, softwareprogramma's zoals ImageJ te gebruiken voor data-analyse (Zie het gedeelte ' resultaten ' voor voorbeelden).
Representative Results
Labelen van liposomaal luchtvaartmaatschappijen met verschillende markeringen geweest eerder beschreven9. Dragers voorzien van far-red dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine perchloraat (deed; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) of groene 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) worden gepresenteerd in dit manuscript. Om te tonen intercellulaire gelijkenissen en verschillen in Liposomale opname, release, en de lokalisatie van het intracellulaire, dat verschillende tumor werden bestudeerd. Het gaat hierbij om twee lijnen van de muis, de B16BL6 melanoom11 en de Lewis longcarcinoom (LLC), en twee menselijke melanomen, een zeer metastatische (BLM) en een niet-metastatische (1F6) melanoom12,13. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van levende cellen. In alle experimenten, een concentratie van 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP of 0.05 µmol van nanodeeltjes werden toegediend voor 3 of 24 h. gemeten en geanalyseerd dox (in de vorm van gratis, vrijgegeven, ingekapselde, afgezonderd of tussenliggende) waren bedoeld als DXR. Een 40 X (numerieke diafragma: 1.3) olie objectief werd gebruikt, en imaging werd uitgevoerd met een 488 nm argon laser (10% / 0.2 mW vermogen) en een 505 tot 550 nm band pass filter voor CF-PE en lysosomale marker (LM)-groen. Een 543 nm helium neon laser (100% / 0.2 mW vermogen) en een 560 tot 615 nm band pass filter werd gebruikt voor dox, Dox-NP en lysosomale marker-rood. Een 633 nm helium neon laser (100% / 0,5 mW vermogen) en een 640 nm long pass filter werd gebruikt voor deed.
Vanwege zijn inkapseling waren het in vitro cytotoxiciteit, biologische beschikbaarheid en farmacokinetiek van dox aanzienlijk veranderde3,9,14. Het verschil tussen de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel toegediend bij vrije en ingekapselde vorm wordt geïllustreerd in Figuur 3. Dox is een intercalating agens en de celkern tot cytotoxische moet invoeren. Figuur 3 en verwante films 1 en 2 Toon een 3U time-lapse van BLM cellen behandeld met dox of Dox-NP onder identieke omstandigheden. Binnen enkele minuten van dox blootstelling nucleaire DXR kan worden waargenomen (figuur 3A, film 1) en met behulp van een lagere winst (insert), zichtbaar zijn aan de intercalating in de kern. In tegenstelling, wanneer blootgesteld aan Dox-NP, is intracellulaire DXR nauwelijks zichtbaar binnen dit tijdsbestek (figuur 3B, Movie 2). Alleen door het verhogen van de winst fotomultiplicatorbuizen, DXR in het cytoplasma kan worden waargenomen (invoegen). Met behulp van ImageJ, werden de pixel dichtheid van cytoplasmatische en nucleaire DXR geanalyseerd. Als cellen in beweging tijdens de time-lapse beoordeling zijn, is het belangrijk te combineren TL met helder-veld beelden. Dit biedt de mogelijkheid voor het bijhouden van afzonderlijke cellen en het stabiliseren van de XY-drift gebruik van specifieke plugins in ImageJ. In de analyse in Figuur 3, werd het beeld helder-veld gebruikt voor het tekenen van een regio van belang (ROI) rond het cytoplasma (vaste lijn) en de kern (gestippelde lijn). De manager van de ROI in ImageJ vindt u in het menu-item analyseren > Tools > ROI manager. Deze ROIs gewend bent in de fluorescerende afbeelding pixeldichtheid analyseren met behulp van het menu-item analyseren > maatregel. Het verschil tussen de pixeldichtheid in de kern (Figuur 3 c) en cytoplasma (figuur 3D) van dox - of Dox-NP-testgroep cellen bevestigt wat wordt gezien in de beelden. Ook werden cellen geïncubeerd gedurende 24 uur met dox of Dox-NP, waarna de compound werd vervangen door medium en onmiddellijk beeld met verhoogde gevoeligheid van de fotomultiplicator winst (Figuur 4). Andere instellingen, zoals laser macht, offset, gaatje en beeldweergave, waren identiek. Het lage DXR signaal in Dox-NP-behandeld ten opzichte van dox-behandelde cellen is opvallend. Met behulp van een winst van 700, wordt DXR in de cellen van Dox-NP-testgroep zichtbaar, overwegende dat het beeld van dox is al overbelicht. Dit experiment eenvoudig in vitro visualiseert een significant verschil in de biodisponibiliteit van gratis versus encapsulated drug.
Wanneer cellen worden voortdurend blootgesteld aan Dox-NP voor 24u, bouwt DXR na verloop van tijd, zoals weergegeven in figuur 5A en films 3 en 4. Het signaal verhoogt in het cytoplasma, en ontdekte later dat, DXR is ook tussenliggende in de kern. Deze opmerkingen worden bevestigd door de pixel dichtheid grafieken (figuur 5B). De gemeten cytoplasmatische pixeldichtheid is lager in BLM vergeleken met 1F6 cellen vanwege het verschil in intracellulaire distributie. Overwegende dat de DXR in 1F6 cellen is verspreid over de cel, is DXR in BLM cellen meer geconcentreerd in een organel dicht bij de kern (figuur 5C).
Dus, de lokalisatie van de drug en vervoerder in verschillende cellijnen (Figuur 6) werd onderzocht. Cellen werden gedurende 24 h met Dox-NP/deed en verbeelde geïncubeerd. Met behulp van het beeld helder-veld, werd een overlay van de celmembraan (vaste lijn) en de nucleus (stippellijn) getrokken in de fluorescerende afbeelding van drie verschillende cellijnen. Het blijkt hier dat de vervoerder, aangeduid met de cytoplasmatische hetzelfde patroon als DXR deed, volgt: geconcentreerd in een organel dicht bij de kern in BLM, rond de gehele kern in de LLC, en willekeurig verspreid over het cytoplasma in B16BL6 cellen. In de kern, enige DXR en neen kan worden gezien, die aangeeft dox uitgebracht. Door het verminderen van de fotomultiplicator winst, individuele cellulaire blaasjes met DXR en vervoerder, voorzien van deed, evenals met CF-PE (cijfers 6B en 6 C), kunnen worden gezien.
Cytoplasmatische DXR sequesters in kleine blaasjes, en cellen waren gemarkeerd met een live-cel lysosomale marker in groen of rood. Het verkeer van deze lysosomen kan worden gevolgd in de cellen (film 5). Cytoplasmatische DXR en de nanocarrier colocalize binnen deze structuren en de intercellulaire verschil in de DXR patroon, zoals te zien in Figuur 6, is hier uitgelegd. Lysosomen zijn willekeurig verspreid over het cytoplasma in B16BL6 en bevinden zich naast de kern in BLM cellen (figuur 7A). Met behulp van ImageJ, de colocalization tussen DXR en vervoerder in het lysosoom werd berekend (figuur 7B). De kleurenbeelden werden gemaakt binaire (proces > binaire > maken binaire) en, met behulp van de plug-in colocalization (analyseren > Colocalization), een colocalization beeld werd gemaakt van DXR met deed. Hierdoor ontstaat een gekleurd beeld van groen-rood-wit, met witte pixels vertegenwoordigen de colocalized pixels van beide beelden. Via het menu item proces > binaire > maken binaire, de witte pixels worden gescheiden en geconverteerd naar zwarte pixels, vanwaar de pixeldichtheid wordt gemeten (Analyze > maatregel). Daarna een colocalization beeld werd gemaakt tussen deze DXR-beeld en de binaire image van de lysosomale marker (LM) en de pixeldichtheid gemeten. De gegevens van de colocalization is het percentage van pixels positief voor DXR-deed en DXR-deed/lysosomale marker (Figuur 7 c). Dat de vervoerder, aangeduid met CF-PE alsook, evenals, zich in het lysosoom bevindt wordt ook weergegeven in figuur 7D.
Figuur 1: instrumenten en apparatuur setup. A) imaging kamer + benodigdheden. 25-mm #1 dekking glas (1), onderste gedeelte van de kamer (2), deel van de kamer (plaats topd opwaartse naar beneden) en O-ring (3), fase houder (4) en afdichting deksel (5). Schaal bar: 2 cm. B) incubatie eenheid. Verwarmde Microscoop fase (1), stroom podium met in - en uitgaand - flow voor CO2 (2), een CO2 sonde (3), en een afsluitende patch (4). Schaal bar: 2 cm. C) Imaging kamer in de couveuse-unit, zoals gezien onder de Microscoop. D) multi-tijd serie macro. E) apparatuur voor imaging. Omgekeerde Microscoop (1), tl-licht (2), computer (3), ring verwarming (4, insert) en controller (4, belangrijkste figuur), CO2 stroom buis (5), CO2 ventiel (6), CO2 controller (7), CO2 luchtbevochtiger (8), O2 ventiel en controller (9), en fase temperatuur controller (10). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische van de parameters van de Microscoop gedetailleerde in Protocol sectie 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: onderzoek naar de korte termijn verbreiding van dox en Dox-NP. BLM cellen werden voortdurend blootgesteld aan dox of Dox-NP voor 3 h, en een time-lapse werd genomen. (A) nog steeds foto's van de time-lapse van cellen geïncubeerd met dox. (B) nog foto's van de time-lapse van cellen geïncubeerd met Dox-NP. Schaal bar = 50 µm. (C) Pixel dichtheid toename van nucleaire DXR in dox en Dox-NP-behandelde cellen. (D) verhoging van de Pixel dichtheid van cytoplasmatische DXR in dox en Dox-NP-behandelde cellen. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van 3 cellen per veld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: onderzoek naar de langdurige verbreiding van dox en Dox-NP in verschillende cellijnen. Cellen werden blootgesteld aan dox of Dox-NP en beeld 24 h later. Beelden werden genomen onmiddellijk na de verwijdering van de drugs, met 3 verschillende winsten. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: onderzoek naar de cellulaire opname en het vrijkomen van liposomaal agentia. De cellen waren voortdurend blootgesteld aan Dox-NP gedurende 24 uur en een time-lapse is gemaakt. (A) nog steeds foto's van de time-lapse. Schaal bar = 50 µm. (B) Pixel dichtheid stijging van DXR in de celkern en het cytoplasma. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van 3 cellen per veld. (C) afbeeldingen tonen de lokalisatie van DXR binnen de cel. Ononderbroken lijn: celmembraan, gestippelde lijn: nucleus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: onderzoek naar de lokalisatie van de drug en vervoerder in verschillende cellijnen. (A) cellen werden blootgesteld aan Dox-NP/deed voor 24u en beeld. Schaal bar = 50 µm. (B) cellen werden blootgesteld aan Dox-NP/deed/CF-PE voor 24u en beeld met een lagere intensiteit winst te onderscheiden van individuele blaasjes. (C) Bright-veld en DXR overlay DXR in cytoplasmatische blaasjes (pijl) tonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: onderzoek van de intracellulaire lokalisatie van de drug en vervoerder. Cellen werden blootgesteld aan Dox-NP/deed of CF-PE/deed voor 24 h, en lysosomen worden gevisualiseerd met behulp van de live-cel lysosomale markering (LM) in groen of rood. (A) intracellulaire lokalisatie van DXR en de vervoerder (deed). De pijlen vertegenwoordigen 3 voorbeelden van DXR en gelokaliseerde in het lysosoom deed. Schaal bar = 50 µm. (B) mede lokalisatie analyse van DXR en de vervoerder (deed) in de lysosomen (LM) met behulp van ImageJ. (C) Percentage van co lokalisatie van DXR en de drager in de lysosomen. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 3 individuele experimenten. (D) lysosomale vastleggen van de vervoerder gevisualiseerd met behulp van twee verschillende markeringen. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Filmpje 1: met Figuur 3 : BLM cellen werden geïncubeerd met dox voor 3 h. Time-lapse: 19 beelden, met een interval van 10 min. framesnelheid: 3 bps. Schaal bar = 50 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 2: verband met Figuur 3 : BLM cellen werden geïncubeerd met Dox-NP voor 3 h. Time-lapse: 19 beelden, met een interval van 10 min. framesnelheid: 3 bps. Schaal bar = 50 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 3: met Figuur 5 : BLM cellen werden geïncubeerd met Dox-NP voor 24 h. Time-lapse: 96 beelden, met een interval van 15 min. framesnelheid: 8 fps. Schaal bar = 50 µm. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Rechtsklik om te downloaden.)
Film 4: met Figuur 5 : 1F6 cellen werden geïncubeerd met Dox-NP voor 24 h. Time-lapse: 96 beelden, met een interval van 15 min. framesnelheid: 8 fps. Schaal bar = 50 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 5: met Figuur 7 : Lysosomen van B16BL6 cellen werden gekleurd met een live-cel marker. Time-lapse: 10 beelden, met een interval van 10 s. framesnelheid: 3 bps. Schaal bar = 50 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Discussion
Zoals opgemerkt in het verleden, fixatie Liposomale nanocarriers bijna onmiddellijk kan vernietigen en DXR vrijgegeven formulier deze vernietigde liposomen had nog steeds de tijd om de kern, waardoor de interpretatie van gegevens erg moeilijk en zelfs misleidend. Met microscopisch kleine aanpassingen kan het chemotherapeutische lot in levende cellen en weefsels routinematig worden onderzocht om te bevestigen of omver histologische opmerkingen. Een recent document toonde de opname, release, en lokalisatie van DXR in cellen met gratis en ingekapseld dox met behulp van live-cel time-lapse imaging9behandeld. Dit werk beschrijft de experimentele opzet in meer detail. Met behulp van dit model, is het mogelijk om te visualiseren de onmiddellijke vervoer van dox naar de kern, waar het voortdurend worden bij elkaar opgeteld totdat de cel uiteindelijk sterft. Daarentegen wanneer Dox-NP wordt gebruikt, slechts een kleine hoeveelheid vrijgegeven dox zijn te vinden in de kern. Hoewel voortdurende blootstelling in continue DXR opbouw resulteert, het fluorescent signaal is veel lager in Dox-NP-versus dox-behandelde cellen, die een verschil in cellulaire concentratie en latere cytotoxiciteit aangeeft. Bovendien, met behulp van live-cel markeringen, werd aangetoond dat, wanneer het bloot cellen aan Dox-NP, DXR en de nanocarrier bevinden zich in het lysosoom. Dit betekent dat de volledige liposoom in beslag door de cel genomen wordt en de betrokkenheid van een endocytotische route tijdens de opname van deze nanodeeltjes toont. De DXR in de kern is duidelijk van vrijgegeven dox. Met behulp van deze methode, zoals zowel de DXR vervoerder mede lokaliseren en lijken te worden gevangen in de lysosomen, is het echter nog steeds onduidelijk of dit wordt ingekapseld of vrijgegeven dox. Het is mogelijk dat de intrinsieke stabiliteit van de nanoparticle voorkomt dat dox release gelokaliseerd in het lysosoom.
In dit protocol, is live-cel imaging aangetoond door middel van een specifieke microscopische setup, met een op maat gemaakte fase houder (de specificaties kunnen worden gegeven op aanvraag). Echter, meest confocal microscoop produceert een aanbod van starterscentra die live-cel imaging uitvoeren. Behoud van cel kweekomstandigheden (dat wil zeggen, temperatuur, CO2, pH, vochtigheid en steriliteit) is het belangrijkste criterium van deze starterscentra en vereist sommige voorbereidende tests om te bepalen van de juiste voorwaarden, die verder wordt uitgelegd. Geautomatiseerde data acquisitie programma's kunnen ook worden geleverd door de dezelfde fabrikanten. Een "Multi locatie" optie maakt het mogelijk om het imago van de verschillende standpunten in deze zelfde zaal, raffinage van statistische analyse. Echter moet deze optie in de macro vermeld in dit manuscript vaste XYZ posities, waarbij de mogelijkheid om te corrigeren voor Z-drift verloren is. Scannen van de Z-dimensie kan worden opgenomen in deze macro en gebruikt een focus vlak voor de analyse. Dit vereist echter extra scannen, verhogen van de mogelijkheid van fototoxiciteit en bleken.
Zoals met alle fluorescerende metingen, is overbelichting een probleem, vooral bij het vergelijken van twee verbindingen met een verschillende cellulaire opname. De fluorescerende intensiteit is niet alleen afhankelijk op de intrinsieke signaal van de stof, maar ook op het tempo van de opname, de concentratie en de blootstellingstijd drug. Zoals blijkt uit figuur 3, is de nucleaire DXR inhoud van dox-behandelde cellen al zichtbaar, terwijl geen signaal wordt gezien in Dox-NP-testgroep cellen. Alleen door het verhogen van de winst kan de DXR in Dox-NP-testgroep cellen worden gevisualiseerd, wat leidt tot overmatige blootstelling in dox-behandelde cellen. Bovendien, zelfs intracellulair, Dox-NP is ongelijkmatig verdeeld zijn, hetgeen kan leiden tot onvermijdelijke onder- of overbelichten. Vooral bij het onderzoeken van de cellulaire DXR entrapment, was de winst aanzienlijk verminderd om te onderscheiden van individuele organellen (cijfers 5B en 5 C). Dus, de metingen vertegenwoordigd door pixeldichtheid moeten vergezeld gaan van de representatieve beelden voor de juiste interpretatie van de resultaten.
Fototoxiciteit bleken en een lage signaal-/ ruisverhouding zijn ook belangrijke kwesties in fluorescent microscopie, en een compromis tussen de kwaliteit van het beeld en de Beeldacquisitie moet worden vastgesteld. Echter, zelfs wanneer de instelling van de Microscoop optimaal is, de beeldkwaliteit is ook grotendeels bepaald door de kwaliteit van de cellen en de toegevoegde compound. DXR geeft een sterk signaal en, met de juiste voorzorgsmaatregelen, bleken werd niet waargenomen, zelfs na langere perioden (maximaal 72 h). De vermindering van het fluorescerende signaal kunnen echter ook een gevolg van de efflux. Efflux is een belangrijk fenomeen in drug weerstand15 en treedt op wanneer cellen pomp uit de drug van de intracellulaire werkplek waar de activiteiten. Een daling van het fluorescerende signaal na verloop van tijd kan daarom ook een gevolg zijn van dox efflux9. Vergelijking van het fluorescerende signaal van een niet-gescande locatie aan het einde van het experiment met het laatste beeld uit de time-lapse serie demonstreer bleken (dat wil zeggen, het signaal hoger zal zijn op de locatie niet-gescand) of efflux (dat wil zeggen, beide signalen zullen niet identiek zijn). Verschillende correctionele opties (b.v., achtergrond, drift, bleken, etc.) zijn beschikbaar in programma's zoals ImageJ16. Ook, zoals de fluorescerende intensiteit na verloop van tijd verhoogt, kunnen de configuratie-instellingen worden vooraf geëvalueerd in een proefproject om te minimaliseren van overmatige blootstelling aan het einde van de time-laps (stap 3,21). U kunt ook kan een imaging kamer met cellen al blootgesteld aan de drug voor de gewenste periode worden gebruikt voor het initialiseren van de instellingen. Tot slot voor dit type analyse, giftige drug concentraties (stap 3.22) moeten worden vermeden en vooraf ingesteld met behulp van conventionele bio-assays.
Cellen zijn voortdurend gekweekt en onderhouden in medium zonder fenol rood. Fenol rood licht in het rode gedeelte van het spectrum en kunnen worden waargenomen in cellulaire organellen, meest waarschijnlijke lysosomen, presenteren van vals-positieve informatie (stap 1.2). Als u wilt toestaan voor de monitoring van de afzonderlijke cellen, cel samenvloeiing mag niet meer dan 70% (stap 3.1.). De CO2 flow-snelheid (stap 3.5) moet geregeld worden in een experiment van de validatie wanneer de apparatuur wordt gekocht of na onderhoud. Wanneer de snelheid te hoog, zal medium verdampen. Wanneer de snelheid te laag is, vergroot de pH van het medium, waardoor celgroei. Als het medium zonder is de fenol rood pH-indicator veranderingen in de pH niet worden waargenomen en zijn daarom gemakkelijk over het hoofd gezien. Zodra de CO2 -stroom wordt gevalideerd, kunnen deze instellingen worden gebruikt in alle toekomstige experimenten.
Met behulp van de methode beschreven hier, kan het lot van nanodeeltjes gemakkelijk worden onderzocht met behulp van live-cel beeldvorming en time-lapse microscopie. In deze procedure werden verkrijgbare nanodeeltjes gebruikt. Echter, het lot van hittegevoelige17, kationische liposomen10; liposomen verrijkt met korte keten shingolipids18; en nanodeeltjes inkapselen van andere drugs8,19 werden ook onderzocht op deze manier in de tumor en normale cellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De microscopie installaties maken deel uit van het Erasmus optische Imaging Center, en wij willen de medewerkers van de OIC voor hun diensten bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
