Summary
הדמיה לחיות תאים הוא כלי רב עוצמה כדי לחזות תהליכים דינאמיים. הבחינה של תאים קבוע מספק רק תמונות סטטיות, אשר יכול להוביל פירוש מוטעה ובלבול לגבי התהליך. עבודה זו מציגה שיטה ללמוד ספיגת התרופה שחרור, לוקליזציה תאיים של חלקיקים liposomal בתאים חיים.
Abstract
טכניקות הדמיה שגרתיות יכול לספק מידע מפורט אודות תהליכים תאיים. עם זאת, מידע זה מבוסס על תמונות סטטיות בכל מערכת אחרת דינמי, שלבים רצופים בקלות להתעלם או שלא כהלכה. הדמיה לחיות תאים, מיקרוסקופ זמן לשגות, שבו תאים חיים יכול להיות בעקבות שעות או אפילו ימים באופן רציף יותר או פחות, ולכן הם מאוד אינפורמטיבי. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר החקירה על גורלם של חלקיקים כימותרפיות לאחר המסירה של דוקסורוביצין (dox) בתאים חיים. Dox הוא סוכן intercalating זה חייב להשתחרר מן nanocarrier שלה להיות פעילים ביולוגית. למרות רישומה קלינית במשך יותר משני עשורים, את ספיגת, התמוטטות, ושחרור סמים הם עדיין לא מובן במלואו. מאמר זה בוחן את ההיפותזה חלקיקים המבוססת על השומנים שנלקחה על ידי תאים סרטניים והשפילו הם לאט לאט. Dox שפורסמו אז translocated את הגרעין. כדי למנוע קיבוע חפצים, הדמיה לחיות תאים, מיקרוסקופ זמן לשגות, המתוארות בהליך זה ניסיוני, יכול להיות מיושם.
Introduction
היכולת לעקוב אחר תהליך ביולוגי, כגון תאים תאים אינטראקציות, אינטר-תחבורה תאיים, ספיגת מתחם ציטוטוקסיות ואת אינטראקציית חלבון של מולקולות יחיד בתוך החיים תאים ורקמות, צברה עניין רב במהלך האחרון עשור, כפי שהיא מספקת המימד הנוסף של "בזמן אמת". כתב יד זה, מתוארת שיטה כדי לעקוב אחר גורלם תאיים dox חינם ו dox שולבו חלקיקים (Dox-NP).
חלקיקים שימשו במשך עשרות שנים לטיפול סרטן מסוימים. Dox-NP אושרה לטיפול סרקומה קפוסי הקשורות לאיידס, מתקדם השחלות, השד סרטן, מיאלומה נפוצה1. זה היה אחד של חלקיקים liposomal הראשון פיתח והציג בסביבה קלינית. הצורה החופשית, dox, מנוקה במידה רבה של מחזור הדם, הגבלת הקיבולת שלו כדי להגיע לאתר הגידול בכמויות מספיקות. יתר על כן, טיפול זה מלווה חמורה והגבלת מינון תופעות לוואי, כגון stomatitis ואי ספיקת לב. כאשר מקופל לתוך pegylated liposomal חלקיקים זרימת הזמן מגביר דקות ימים2. סוג זה של כולסטרול המכילים ליפוזום היא די יציבה, יציבות זו קובעת את פרמקוקינטיקה של התרופה במארז.
עם זאת, קשיחות זו יש חיסרון. היכולת ציטוטוקסיות של תרכובת לכיוון תאים סרטניים הוא הראשון הערכה במבחנה, הוכח ש-dox הזה הוא יותר חזק ממה Dox-NP בציטוטוקסיות מבחני3,4. זה היה שיערו כי היציבות של המוביל מונע שחרור, ספיגת הסלולר של הסם, כדאי לחקור את התופעה הזו עוד יותר. המאפיינים liposomal מהותי, נבנה אחרונה המרכיבים אגרסיביות בזרם הדם ולהגיע לאתר הגידול ללא פגע, גרמו הביולוגית לקוי של הרכיב ציטוטוקסיות (קרי: dox) באתר היעד (קרי, הגידול גרעין התא). למרות Dox-NP דיברת שיפור התגובה לעומת הצורה החופשית, זה היה עדיין בעל ערך קליני, כמו עטיפת הקטינה באופן משמעותי את ההשפעות cardiotoxic5. בשנים הבאות, תרכובות אחרות היו אנקפסולציה ננו-נשאים6. בנוסף, שינוי נשאים, גרמו סמים מופעלות שחרור (קרי, באתר הגידול) אך שמר על יציבות ב-7,זרימת הדם8. למרות שנים של חקירה, שימוש קליני, גורל intratumoral nanocarriers כמו Dox-NP עדיין לא ברורות לגמרי בפרסום האחרון, זה הוצג כי ננו-חלקיק הוא נלקח כולו בעוד dox נשאר לכוד ב lysosomes9.
ספיגת הסלולר של שחרור nanoparticle וסמים הם תהליכים דינאמיים שניתן בצורה הטובה ביותר לפקח עליהם באמצעות הדמיה לחיות תאים. יתר על כן, היסטולוגיה קלאסי, שבו תאים מודגרת, לאחר מכן קבועה, יכול לתת תוצאות שגויות אם הקיבעון הורס המוביל liposomal ומציג חפצים. הדרישה המרכזית הדמיה לחיות תאים הוא חזותי, רצוי על ידי קרינה פלואורסצנטית, של התהליך הרצוי. תרכובות מסוימות, כמו dox, יש של פלואורסצנטי אדום פנימי. כמו כן, סמני פלורסנט יכולה להיות מוחדרים המוביל, האברונים ניתן לאבחן באמצעות סמנים לחיות תאים. בדרך זו, מערך של פרמטרים, כמו ספיגת של המוביל, שחרור התרופה, לוקליזציה הסלולר של הספק ושל סמים, יכול להיות עם תמונה, מנותח. . הנה, שיטה מתואר שבו המערכת גורל dox ו Dox-NP בתאי הגידול במספר מלווה בזמן אמת. בנוסף, שיטה זו ניתן להתאים בקלות ליצור תנאים אידיאליים עבור ממוקד (למשל, טעונה חלקיקים10) ועורר שחרור התרופה (למשל, היפרתרמיה7).
Protocol
1. הכנה
- להרכיב לחדר ההדמיה, אשר מורכב משני חלקים-
- מקום 25-מ מ כיסוי זכוכית ( איור 1 א'-1) בחלק התחתון של החדר ( איור 1 א'-2), להבריג את החלק העליון בחלק התחתון ( איור 1 א'-3). לא להדק חזק מדי, כפי יכול לשבור את הזכוכית. אוטוקלב התא כולו ( איור 1 א' -4).
- להכין בינוני התרבות התא על-ידי שכשהם Dulbecco ' s נשר שונה ' s בינוני (DMEM) ללא פנול אדום עם 10% חום-לא פעיל עגל עוברית סרום (FCS) ולא 1 מ"מ-גלוטמין בתנאים סטריליים. החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
- לשמור על התאים עם תא תרבות במדיום culturing מבחנות בטכניקות תרבות תא רגיל.
הערה: כאן, שתי שורות תאים העכבר, מלנומה B16BL6 11 ולואיס ריאות קרצינומה (LLC), ואת שני מלנומה אנושיים, BLM ו- 1F6 12, שימשו. - הופכים את הג'לטין 0.1% על ידי שקילה המסת הג'לטין בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לעקר את הפתרון על-ידי סינון זה דרך מסנן 0.22-מיקרומטר ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס
2. צלחת תאים
- להסיר תא הדמיה של השקית עיקור ב- cabinet זרימה שכבתית, בזהירות להדק את התא, ולמקם אותו בצלחת פטרי.
הערה: כדי למנוע זיהום, להשאיר לחדר ההדמיה בצלחת פטרי עד החדר ניתן למקם תחת המיקרוסקופ. - מעיל הזכוכית של תא הדמיה עם 1 מ"ל של ג'לטין סטרילי 0.1% במשך 20 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
הערה: פעולה זו תאפשר יותר מצורף תא. - להסיר את המדיום המבחנות התרבות התא (ראה שלבים 1.2 ו- 1.3), לשטוף פעם עם 1 x PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין 0.25%. בטל את טריפסין על-ידי הוספת תא תרבות בינוני לאסוף את התאים, ספין אותם למטה ב g x 1,100 במשך 5 דקות, resuspend בגדר ב 5 מ של התא תרבות בינונית. µL
- µL 20 לדלל תא השעיה עם 20 של trypan blue (אשר תועבר ידי תאים מתים). ספירת מספר התאים חי וגם מת באמצעות hemocytometer; מספר תאים מתים לא יעלה על 10%.
- תשאף הג'לטין, צלחת התאים לדילול המאפשר לכל היותר 70% כיסוי בתוך 24 שעות. לדוגמה, השתמש לדילול של 5 x 10 4 או 10 x 10 תאים 4 ב 1 מ"ל. לאפשר את התאים לדבוק ב 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס במשך ה 24
3. זמן לשגות מיקרוסקופ ( איור 2)
הערה: כאן, השתמשו מיקרוסקופ קונפוקלי עם בעל שלב בהזמנה אישית, למרות מייצרת רוב מציעים מגוון של חממות עבור תאים חיים הדמיה זה הם מתאים גם לחקור משלוח הסמים nanoparticulated.
- להעריך את התאים במיקרוסקופ confluency, מורפולוגיה הסלולר של זיהום. מקם את התא בחזרה בחממה 2 CO.
הערה: confluency לא יעלה על 70%. אם המורפולוגיה הסלולר הוא לא עקבי (קרי, התאים אינן מתיישבות) או זיהום מזוהה, למחוק תא הדמיה- - לעבור על מיקרוסקופ קונפוקלי ( איור 1E-1), אור פלורסנט ( איור 1E-2) ומחשב ( איור 1E-3)-
- להתחבר החימום עדשה המטרה ולהגדיר אותו עד 35 ° צ' ( איור 1E -4 + insert).
- להכין את היחידה דגירה, כפי שמוצג באיור 1B.
הערה: יחידה זו מורכבת שלב מחוממת ( איור 1B-1), שלב זרימה עם מחבר עבור 2 CO הצינורות ( איור 1B-2) ו- CO 2 בדיקה ( איור 1B -3), ואת כתם אדום הסגירה ( איור 1B-4). תיקון זה משמש כדי לסגור באופן זמני את יחידת עד לחדר ההדמיה מושם. - מקום ביחידה אינקובציה על הבמה מיקרוסקופ וחבר בו -out - flow CO 2 הצינורות ( איור 1E-5). לפתוח את השסתום 2 CO המרכזי ( איור 1E-6) ולעבור בבקר 2 CO ( איור 1E-7). בדוק הבקר מוגדר כ- 5% CO 2.
הערה: עבור לחות, CO 2 עובר דרך מכשיר לחות ( איור 1E -8). לניסויים היפוקסיה, הרגולטור 2 O נפרד ( איור 1E-9) נכלל בכיוונון. - להגדיר את הטמפרטורה הבמה 37 ° C ( איור 1E-10). לניסויים היפרתרמיה, הגדר את הטמפרטורה 42 ° C. אפשר יחידת הדגירה כדי להגיע טמפרטורה שנבחר, CO 2 אחוז.
- לקחת לחדר ההדמיה של המפקד הראשי חממה 2 ומובילים התא בצלחת פטרי לחדר מיקרוסקופ.
- מקום לחדר ההדמיה ( איור 1A-4) בהזמנה אישית, 35 מ מ קוטר הבמה מחזיק ( איור 1 א'-5) ולסגור את התא עם מכסה איטום בהזמנה אישית ( איור 1A-6).
הערה: המכסה מאפשר CO 2 לעבור ומונעת אידוי וזיהום.- לפתוח ביחידה אינקובציה, החלף את התיקון אדום לחדר ההדמיה, וסגור את יחידת ( איור 1C). . תעשה את זה מהר ככל האפשר כדי למנוע את הקירור של התאים ודא כי ללא כבלים תקועים בין הבמה לבין המיקרוסקופ.
- לעזוב את היחידה להתאקלם במשך 30 דקות
- לפתוח את התוכנה ולעבור על הלייזרים.
הערה: כאן, 488 ננומטר ארגון, 543 nm הליום-ניאון, 633 ננומטר הליום-ניאון לייזרים שימשו. - להפוך מסד נתונים חדש על-ידי לחיצה על " ניו " תחת הכרטיסיה קובץ שם ולשמור את מסד הנתונים.
- להגדיר את התצורה באמצעות לחיצה על " Config " תחת הכרטיסיה ידרשו בחר " מצב ערוץ ", " מסלול יחיד " כדי להעריך את fluorophore של יחיד או " רב המסלול " עבור מספר fluorophores. בחר את הלהקה המתאים-לעבור מסננים תואמים את fluorophore (למשל, 560 כדי 615 ננומטר מסנן לעבור הלהקה dox ו Dox-NP; ראה התוצאות נציג לקבלת דוגמאות נוספות). בחרו בערוץ שדה בהיר אחד של המסילה.
- להגדיר את הפקד סריקה באמצעות לחיצה על " סרוק " תחת הכרטיסיה ידרשו להגדיר גודל המסגרת (1,024 x 1,024), מהירות סריקה (אופטימלי), לסרוק כיוון (8 סיביות, יחיד), ולאחר סרוק ממוצע (4) על-ידי לחיצה " מצב. " להגדיר את חריר (200 מיקרומטר), לזכות והיסט ( למשל, 580 700, 835; ראה איור 3), לייזר כוח (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) על ידי לחיצה " ערוצים. "
- לשמור הגדרות אלה על-ידי לחיצה על " Config " בתצורה טאב ולשמור אותם במסד הנתונים של התצורה.
- להגדיר מואץ על ידי לחיצה " X זמן רב " ( איור 1D) היחידים מאקרו לחץ " יחיד מיקום ".
- לשמור את התאים בפוקוס, בחר את הפוקוס האוטומטי המאקרו על-ידי לחיצה על " פוקוס אוטומטי. "
הערה: פוקוס אוטומטי מושגת עם 633 ננומטר לייזר באמצעות ההשתקפות של הזכוכית כנקודת התייחסות. - להחיל את התצורה שנשמרה על-ידי לחיצה על " מסלול יחיד " או " רב המסלול, " גלילה לתצורה הנדרשת במסד הנתונים של התצורה, הגדרת את מרווח הזמן (למשל, 15 דקות), מספר סריקות (למשל, 97), לחיצה על " טען Config. "
הערה: באמצעות הגדרות אלה, זמן-סדרת 97 x 15 min = 24 שעות ייעשה. - שם מואץ ב " שם קובץ בסיס ", בחר את מסד הנתונים (שנעשתה בשלב 3.11) על ידי לחיצה " בסיס הנתונים של תמונת " לשמירת מואץ. להגדיר תיקייה זמנית על-ידי לחיצה על " Tmp תמונת התיקיה. "
הערה: אם המערכת מפסיקה או קורסת מכל סיבה שהיא, התמונות ממוקמים בתיקיה זו. - פתח את יחידת ומוכנסות, הרם את הטבעת הדמיה, להוסיף טיפה של שמן טבילה המטרה, וסגור את יחידת מהר ככל האפשר. להתמקד ולבחור עמדה בבית הבליעה הדמיה-
הערה: עמדה זו מכילה תאים טפט, עם מינימום של 70% confluency, המאפשר ההדמיה של תאים בודדים. - לבדוק את הגדרות התצורה עבור הרקע ולתקן במידת הצורך.
הערה: ניתן לתקן את הרקע על-ידי הפחתת הכוח רווח או לייזר. כל שינוי בתצורה צריך להינצל (ראה שלב 3.17) והוא טעון (ראה שלב 3.18) שוב במאקרו. - ב זרימה שכבתית cabinet, לדלל סמים חינם או חלקיקים ריכוז סמים µg/mL 5 או µmol 0.05 של ליפידים במדיום התרבות תאים. לסנן דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר אם הסמים/חלקיקים אינם סטריליים.
- פתח את התא ומוכנסות, הרם את המכסה איטום, להסיר את המדיום של התאים, להוסיף 1 מ"ל של סמים מדולל/חלקיקים, וסגור את יחידת מהר ככל האפשר.
- מתמקדים התאים ואת ההתחלה מואץ על ידי לחיצה " שעת התחלה " במאקרו X זמן רב.
- לבדוק באופן קבוע כדי לראות אם התאים נמצאים עדיין בפוקוס או להשתמש את פוקוס אוטומטי (ראה שלב 3.16). התוכנית שומר באופן אוטומטי מואץ במסד הנתונים; לא לסגור את מסד הנתונים בעת הפעלת התוכנית.
4. ניתוח נתונים
- בהתאם שאלת המחקר המקורי, להשתמש בתוכנות כגון ImageJ לניתוח נתונים (עיין בסעיף התוצאות לדוגמאות).
Representative Results
תיוג נושאות liposomal עם סמנים שונים כבר שתואר לעיל9. נשאים עם התווית עם פרכלורט tetramethylindotricarbocyanine dioctadecyl מרחיקת אדום (; Ex = 644 ננומטר; Em = 665 ננומטר) או 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) ירוק (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 ננומטר) מוצגים בכתב היד. כדי להציג את המערכת והשונה ספיגת liposomal, שחרור, לוקליזציה תאיים, נחקרו מספר סוגים של הגידול. אלה כוללים שני קווים העכבר, מלנומה B16BL611 ו קרצינומה של הריאות לואיס (LLC), ו מלנומה אנושיים שני, מאוד גרורתי (BLM) ו12,מלנומה-גרורתי (1F6)13. כל הניסויים בוצעו באמצעות תאים חיים. בניסויים כל, ריכוז של 5 dox µg/mL, 5 µg/mL Dox-NP או µmol 0.05 של חלקיקים נוהלו במשך 3 או 24 ה מדוד, dox שנותחה (בצורה חופשית, המשוחררים, שעברו אנקפסולציה, מוחרמת או intercalated) היו מתייחסים כאל חייה של DXR. 40 X (מפתח נומרי: 1.3) שמן המטרה עדשה שימש, ובוצע הדמיה עם 488 ננומטר ארגון לייזר (10% / 0.2 mW הספק) ועם 505 עד 550 ננומטר הלהקה לעבור סינון עבור CF-PE ו- lysosomal סמן (LM)-ירוק. 543 ננומטר לייזר הליום-ניאון (100% / 0.2 mW הספק) 560 כדי 615 ננומטר מסנן לעבור הלהקה נבנה למטרות dox Dox-NP, סמן lysosomal-אדום. לייזר הליום-ניאון nm 633 (100% / 0.5 mW הספק) ומסנן nm פס ארוך 640 שימש עבור האם.
בגלל אנקפסולציה שלה, cytotoxicity במבחנה , הזמינות הביולוגית פרמקוקינטיקה של dox היו שינו באופן משמעותי3,9,14. ההבדל בין הביולוגית של התרופה כאשר ניתנת בצורה חופשית ו שעברו אנקפסולציה הוא הפגין באיור3. Dox סוכן intercalating, עליך להזין את גרעין התא להפוך ציטוטוקסיות. איור 3 ו קשורים סרטים 1 ו-2 להראות ה 3 בצילום מואץ של תאים BLM שטופלו dox או Dox-NP בתנאים זהים. תוך דקות של חשיפה dox, חייה של DXR גרעיני יכול להיות שנצפו (איור 3A, סרט 1), באמצעות נמוכה יותר רווח (insert), ניתן לראות intercalating בגרעין. לעומת זאת, כאשר הם נחשפים Dox-NP, חייה של DXR תאיים מוצגת בקושי בתוך פרק הזמן (איור 3B, סרט 2). רק על ידי הגדלת הרווח של האופטיקה, ניתן לעקוב אחר חייה של DXR בציטופלסמה (להוסיף). שימוש ImageJ, צפיפות פיקסלים של חייה של DXR cytoplasmic וגרעיני נותחו. כמו תאים נמצאים בתנועה במהלך הערכת זמן לשגות, חשוב לשלב פלורסנט עם תמונות בהיר-שדה. זה מציג את האפשרות של מעקב אחר תאים בודדים וייצוב של XY-להיסחף באמצעות תוספים ספציפיים ב- ImageJ. הניתוח המוצג באיור3, התמונה בהיר-שדה שימשה כדי לצייר אזור עניין (ROI) סביב הציטופלסמה (קו רציף) ואת גרעין (קו מנוקד). מנהל רועי ב- ImageJ ניתן למצוא את פריט התפריט נתח > כלי > רועי מנהל. ROIs אלה נעשה שימוש בתמונה פלורסנט לנתח צפיפות פיקסלים באמצעות פריט התפריט נתח > מידה. ההבדל בין צפיפות הפיקסלים בגרעין (איור 3C) לבין הציטופלסמה (איור 3D) של תאים dox או Dox-NP-שטופלו מאשר מה שנראה של תמונות... כמו כן, התאים היו הדגירה במשך 24 שעות ביממה עם dox או Dox-NP, לאחר מכן המתחם היה מוחלף על ידי בינוני, מיד עם תמונה עם רגישות מוגברת רווח האופטיקה (איור 4). הגדרות אחרות, כגון עוצמת הלייזר, היסט, חריר תצוגת תמונה, היו זהים. האות חייה של DXR נמוכות בתאים בהשוואה שטופלו dox Dox NP-שטופלו הוא מדהים. באמצעות רווח של 700, חייה של DXR בתאים Dox NP-שטופלו הופך לגלוי, ואילו דמותה של dox הוא חשיפת כבר. הניסוי הזה פשוט במבחנה מדמיין הבדל משמעותי הביולוגית של חינם נגד סמים שעברו אנקפסולציה.
כאשר תאים נחשפים באופן רציף Dox-NP במשך 24 שעות ביממה, חייה של DXR מצטבר לאורך זמן, כפי שמוצג באיור 5A , סרטים 3 ו- 4. מגביר האות בציטופלסמה, מאוחר יותר, חייה של DXR נמצא גם intercalated בגרעין. תצפיות אלה מאושרות על-ידי הגרפים צפיפות פיקסלים (איור 5B). צפיפות הפיקסלים cytoplasmic נמדד היא נמוכה יותר ב- BLM בהשוואה לתאים 1F6 הפער של התפלגות תאיים. ואילו חייה של DXR בתאים 1F6 מופצת ברחבי התא, חייה של DXR בתאים BLM יותר מרוכזת של אברון קרוב לגרעין (איור 5C).
לכן, נחקר הלוקליזציה של סמים, נושאת בשורות תאים שונים (איור 6). התאים היו הדגירה במשך 24 שעות ביממה עם היו Dox-NP, הדמיה. שימוש בתמונה בהירים-שדה, כיסוי של קרום התא (קו רציף), גרעין (קו מנוקד) נמשך בדמות שלוש שורות תאים שונה פלורסנט. הוכח כאן כי ההובלה, עם תוויות עשה, עוקב אחר אותו דפוס cytoplasmic כמו חייה של DXR: מרוכזים של אברון קרוב לגרעין ב- BLM, מסביב לגרעין כולו ב- LLC, ולא באופן אקראי הפזורים הציטופלסמה בתאים B16BL6. בגרעין, רק חייה של DXR ולא ניתן לראות, המציין שוחרר dox. על ידי הקטנת הרווח של האופטיקה, בודדים שלפוחית התאית המכילה חייה של DXR, הספק, עם, כמו גם עם CF-PE (דמויות 6B ו- 6 C), ניתן לראות.
חייה של DXR cytoplasmic מרחיק בתוך שלפוחית קטנה, ומוענקת התאים היו לחיות תאים lysosomal סמן ירוק או אדום. התנועה של lysosomes אלה ניתן בעקבות בתאים (סרט 5). חייה של DXR cytoplasmic ו nanocarrier את colocalize בתוך מבנים אלה, ההבדל המערכת בתבנית חייה של DXR, כפי שניתן לראות באיור 6, המוסברת כאן. Lysosomes מופצים באופן אקראי בכל רחבי הציטופלסמה ב B16BL6, נמצאים בסמוך לגרעין בתאי BLM (איור 7 א). שימוש ImageJ, colocalization בין חייה של DXR המוביל ליזוזום חושבה (איור 7 ב). תמונות צבע נעשו בינארי (תהליך > בינארי > להפוך בינארי) ו, תוך שימוש colocalization של יישום plug-in (נתח > Colocalization), תמונת colocalization היה עשוי חייה של DXR עם האם. זה יוצר תמונה בצבע ירוק-אדום-לבן, עם פיקסלים לבנים המייצגים את הפיקסלים colocalized של שתי תמונות. דרך התפריט פריט תהליך > בינארי > להפוך בינארי, הפיקסלים הלבנים מופרדים ו להמיר פיקסלים שחורים, שממנו נמדד צפיפות הפיקסלים (נתח > מידה). לאחר מכן, תמונת colocalization נעשתה בין חייה של DXR הזה-התמונה ומדדתי התמונה הבינארית של סמן lysosomal (LM), צפיפות פיקסלים. הנתונים colocalization הוא אחוז חיובי על חייה של DXR פיקסלים-האם וסמן חייה של DXR-האם/lysosomal (איור 7C). כי ההובלה, כמו גם עם CF-PE תוויות, כמו ממוקם ליזוזום מוצג גם איור 7D.
איור 1: התקנת הציוד והכלים. א) הדמיה קאמרית + מצרכים חיוניים. 25-מ מ #1 כיסוי זכוכית (1), בחלק התחתון של החדר (2), העליון חלק התא (מקוםד הפוכים למטה) ו- o-ring (3) שלב מחזיק (4), איטום המכסה (5). סרגל קנה מידה: 2 ס מ. B) ביחידה אינקובציה. מיקרוסקופ מחוממת שלב (1), זרימה הבמה עם - ו -out - flow עבור CO2 (2), בדיקה2 CO (3) ותיקון הסגירה (4). סרגל קנה מידה: 2 ס מ. ג) הדמיה קאמרית ביחידה חממה, כפי שנראה במיקרוסקופ. D) סדרת רב הזמן מאקרו. ה) מכשור הדמיה. הפוך מיקרוסקופ (1), אור פלורסנט (2), המחשב (3), טבעת חימום (4, הוספה), בקר (4, הדמות הראשית), CO2 זרימה אבובים (5), שסתום2 CO (6), בקר2 CO (7), CO2 מכשיר אדים (8), O2 שסתום, בקר (9), ולא בקר טמפרטורה הבמה (10). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סכמטי של הפרמטרים מיקרוסקופ מפורט בפרוטוקול בסעיף 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חוקרים את ספיגת לטווח קצר של dox ו Dox-NP. BLM תאים נחשפו באופן רציף dox או Dox-NP במשך 3 שעות, זמן לשגות נלקח. (א) עדיין תמונות בצילום מואץ של תאים מודגרות עם dox. (B) עדיין תמונות בצילום מואץ של תאים מודגרות עם Dox-NP. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) פיקסל עליית הצפיפות של חייה של DXR הגרעין בתאים dox ו Dox-NP-שטופלו. (ד) פיקסל עליית הצפיפות של חייה של DXR cytoplasmic בתאים dox ו Dox-NP-שטופלו. הנתונים מייצגים זאת אומרת ± SD של 3 תאים לכל שדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: חוקרים את ספיגת לטווח ארוך של dox ו Dox-NP בשורות תאים שונים- התאים נחשפו dox או Dox-NP, עם תמונה 24 שעות מאוחר יותר. התמונות צולמו מיד לאחר ההסרה של הסמים, עם 3 רווחים שונים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: חוקרים את ספיגת הסלולר ואת שחרורו של סוכנים liposomal. תאים נחשפו באופן רציף Dox-NP במשך 24 שעות ביממה, ולא זמן לשגות. (א) עדיין תמונות בצילום מואץ. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) פיקסל עליית הצפיפות של חייה של DXR גרעין, הציטופלסמה. הנתונים מייצגים זאת אומרת ± SD של 3 תאים לכל שדה. תמונות (C) הממחיש הלוקליזציה של חייה של DXR בתוך התא. קו מלא: קרום התא, קו מנוקד: גרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: חוקרים הלוקליזציה של סמים, נושאת בשורות תאים שונים- (א) התאים היו נחשפים Dox-NP הוא עשה במשך 24 שעות ביממה, עם תמונה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) התאים היו חשופים Dox-NP/עשה/CF-PE ב 24 שעות ביממה, עם תמונה עם רווח בעוצמה נמוכה יותר להבחין שלפוחית בודדים. (ג) ברייט-השדה ואת חייה של DXR כיסוי בהצגת חייה של DXR cytoplasmic שלפוחית (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: חקירת לוקליזציה תאיים של התרופה ואת נושאת. תאים נחשפו היו Dox-NP או CF-PE/במשך 24 שעות ביממה, lysosomes הם visualized באמצעות הסמן lysosomal לחיות תאים (LM), ירוק או אדום. (א) לוקליזציה תאיים של חייה של DXR, המוביל (עשו). החצים מייצגים 3 דוגמאות חייה של DXR ועשיתי מקומי ב- ליזוזום. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) שותף ניתוח לוקאליזציה של חייה של DXR, המוביל (עשו) ב lysosomes (LM) באמצעות ImageJ. (ג) אחוז שיתוף לוקליזציה של חייה של DXR, המוביל ב- lysosomes. הנתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM של 3 ניסויים בודדים. Sequestering Lysosomal (ד), נושאת visualized באמצעות שני סמנים שונים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: הקשורים איור 3 : תאים BLM היו מודגרות עם dox עבור ה 3 בצילום מואץ: 19 תמונות, במרווח זמן של 10 דקות במסגרת שיעור: 3 fps. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
הסרט 2: הקשורים איור 3 : תאים BLM היו מודגרות עם Dox-NP עבור ה 3 בצילום מואץ: 19 תמונות, במרווח זמן של 10 דקות במסגרת שיעור: 3 fps. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
הסרט 3: הקשורים איור 5 : תאים BLM היו מודגרות עם Dox-NP עבור 24h. בצילום מואץ: תמונות 96, בהפרשים של 15 דקות במסגרת שיעור: 8 fps. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
סרט 4: הקשורים איור 5 : 1F6 התאים היו מודגרות עם Dox-NP עבור ה 24 בצילום מואץ: תמונות 96, בהפרשים של 15 דקות במסגרת שיעור: 8 fps. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
סרט 5: הקשורים איור 7 : Lysosomes של B16BL6 התאים היו מוכתמים סמן לחיות תאים. בצילום מואץ: 10 תמונות, עם מרווח של 10 ס' במסגרת שיעור: 3fps. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Discussion
כפי שנצפו בעבר, קיבוע יכול להרוס liposomal nanocarriers כמעט מיד, חייה של DXR שוחררה טופס אלה נהרסה ליפוזומים עדיין היה לי זמן להיכנס לגרעין, שהופך את הפרשנות של נתונים קשה מאוד אפילו מטעה. עם כמה שינויים מיקרוסקופיים, גורל כימותרפיות חיים תאים ורקמות ניתן באופן שגרתי ייבדקו כדי לאשר או להפיל את התצפיות היסטולוגית. עיתון האחרונות הראו את ספיגת שחרור, לוקליזציה של חייה של DXR בתאים לטפל בעזרת dox בחינם, שעברו אנקפסולציה באמצעות הדמיה בצילום מואץ לחיות תאים9. עבודה זו מתארת את הגדרת הניסוי בפירוט רב יותר. באמצעות מודל זה, אפשרי לדמיין את הובלת מיידית dox את הגרעין, איפה זה ברציפות מצטבר עד התא ימות בסופו של דבר. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש Dox-NP, רק כמויות קטנות של dox המשוחררים נמצאים בגרעין. למרות חשיפה מתמשכת תוצאות הצטברות חייה של DXR רציפה, האות פלורסנט הוא נמוך בהרבה ב Dox-NP-לעומת תאים שטופלו dox, המציין הבדל ריכוז הסלולר לבין cytotoxicity הבאים. יתר על כן, באמצעות סמנים לחיות תאים, זה הוצג, בעת חשיפת לתאים Dox-NP, חייה של DXR את nanocarrier ממוקמים על ליזוזום. אפשרות זו מציינת ליפוזום מלאה הוא נלקח על ידי התא ומדגים במעורבות מסלול endocytic במהלך ספיגת של חלקיקים אלה. חייה של DXR בגרעין ברור מן המשוחררים dox. באמצעות שיטה זו, כמו חייה של DXR והן המוביל לשפה משותפת ולא נראה להיות לכודים בתוך lysosomes, זאת עדיין חד משמעית אם זה עוברת אנקפסולציה או משוחרר dox. זה אפשרי כי יציבות פנימית ננו-חלקיק מונע שחרור dox כאשר מותאמים לשפה את ליזוזום.
ב פרוטוקול זה, הוכח הדמיה לחיות תאים באמצעות מלכודת מיקרוסקופיים ספציפי, בעל שלב בהזמנה אישית (המפרט יכול להיות נתון על פי בקשה). עם זאת, מייצרת מיקרוסקופ קונפוקלי ביותר מציעים מגוון רחב של חממות לבצע הדמיה לחיות תאים. שמירה על תנאי התרבות התא (כלומר, טמפרטורה, CO2, pH, לחות ו עקרות) הוא הקריטריון העיקרי של חממות אלה ואינה דורשת כמה בדיקות מקדימות כדי לקבוע את תנאים נאותים, אשר בהמשך מוסברת. גם יכולה להיות מועברת תוכניות רכישה אוטומטית נתונים באתר לפי יצרנים אותו. אפשרות "ריבוי מיקום" מאפשרת לך תמונה במספר תפקידים בבית הבליעה אותה, זיקוק ניתוח סטטיסטי. עם זאת, אפשרות זו בפקודת המאקרו שצוין בכתב היד מחייבת עמדות XYZ קבוע, לפיו האפשרות לתיקון Z-להיסחף אובד. סריקה Z-הממד יכולים להיכלל זה מאקרו, שימושים מוקד מטוס לניתוח. עם זאת, הדבר דורש סריקה נוספת, להגדיל את האפשרות של phototoxicity, הלבנת.
כמו עם כל המדידות פלורסנט, חשיפת יתר היא בעיה, במיוחד בעת השוואת שני מתחמים עם ספיגת הסלולר שונה. עוצמת פלורסנט אינה תלויה על האות מהותי של המתחם, אלא גם על קצב ספיגת, הריכוז, ואת הזמן חשיפה לסמים בלבד. כפי שמוצג באיור 3, גרעיני חייה של DXR תוכן של תאים שטופלו dox הוא כבר גלוי, ואילו אין אות נתפסת בתאים Dox NP-שטופלו. רק על ידי הגדלת הרווח את חייה של DXR בתאים Dox NP-שטופלו ניתן לאבחן, שמוביל חשיפת יתר בתאים שטופלו dox. יתר על כן, אפילו intracellularly, Dox-NP heterogeneously מופץ, אשר יכול לגרום נמנעת תחת- או חשיפת יתר. במיוחד כאשר חוקרים את מלכודת חייה של DXR הסלולר, הרווח צומצם באופן משמעותי כדי להבחין organelles בודדים (דמויות 5B ו- 5 C). לפיכך, המידות המיוצג על-ידי צפיפות פיקסלים חייבים להיות מלווים את התמונות נציג לפרשנות הראויה של תוצאות.
Phototoxicity, הלבנה, יחס אות לרעש נמוך הם גם נושאים חשובים במיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש ליצור פשרה בין איכות התמונה ורכישת תמונות. עם זאת, גם כאשר ההגדרה של מיקרוסקופ תהיה אופטימלית, איכות התמונה גם במידה רבה נקבעת לפי האיכות של התאים, המתחם שנוספו. חייה של DXR נותן אות חזק, עם נעשים, הלבנת לא נצפתה, גם לאחר תקופות ארוכות יותר (עד 72 שעות). עם זאת, צמצום של האות פלורסנט יכול להיות גם תוצאה של בזרימת. בזרימת תופעה חשובה ההתנגדות סמים15 , מתרחשת כאשר התאים לשאוב התרופה מאתר תאיים של פעולה. ירידה של האות פלורסנט לאורך זמן ולכן ניתן גם תוצאה של dox בזרימת9. השוואה בין האות פלורסנט של מקום שאינו סרוקים בסוף הניסוי עם התמונה האחרונה מתוך הסדרה זמן לשגות תדגים הלבנת (קרי, האות יהיה גבוה יותר במיקום שאינו סרוקים) או בזרימת (קרי, שניכם אותות יהיו זהים). קיימות מספר אפשרויות הענישה (למשל, הרקע, סחיפה, הלבנה, וכו ') בתוכניות כמו ImageJ16. בנוסף, ככל האינטנסיביות פלורסנט לאורך זמן, הגדרות התצורה ניתן מראש הערכה בניסוי פיילוט כדי למזער חשיפת יתר בסוף זמן לשגות (השלב 3.21). לחלופין, ניתן להשתמש תא הדמיה עם תאים כבר נחשף לסם-בתקופה הרצויה כדי לאתחל את ההגדרות. לבסוף, עבור סוג זה של ניתוח, הסם ריכוזי (שלב 3.22) להימנע והקימו מראש באמצעות ביו-מבחני קונבנציונלי.
תאים תרבותי ומתוחזק באופן רציף במדיום בלי פנול אדום. פנול אדום שזוהר בחלק האדום של הספקטרום, יכול להיות שנצפו ב- organelles הסלולר, lysosomes ככל הנראה, הצגת מידע חיובי-false (שלב 1.2). כדי לאפשר פיקוח על תאים בודדים, תא זרימה לא יעלה על 70% (שלב 3.1.). CO2 הזרימה-המהירות (שלב 3.5) צריך להיות מוסדר בניסוי אימות כאשר נרכש הציוד או אחרי תחזוקה. כאשר המהירות גבוהה מדי, בינוני יתפוגג. כאשר המהירות נמוכה מדי, יגדיל ה-pH של המדיום, אשר יכולה להשפיע על גדילת התאים. המדיום הוא ללא השינויים אינדיקטור פנול אדום pH pH לא יכול להיות שנצפו, ולכן התעלמו בקלות. ברגע הזרם2 CO מאומת, הגדרות אלה יכול לשמש כל ניסויים עתידיים.
באמצעות השיטה המתוארת כאן, גורלו של חלקיקים יכול בקלות ייחקרו באמצעות הדמיה לחיות תאים ומיקרוסקופיה זמן לשגות. בהליך זה, שימשו חלקיקים זמינים מסחרית. עם זאת, גורל thermosensitive17, ליפוזומים cationic10; ליפוזומים מועשר shingolipids קצר-שרשרת18; חלקיקים לבצע סמים אחרים8,19 נחקרו גם באופן זה גידול, תאים נורמליים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המתקנים מיקרוסקופ המשמש חלק המרכז דימות אופטי ארסמוס, אנחנו רוצים להודות לצוות OIC עבור שירותיהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter - 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
