Summary
결합 전구체 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT)은 동중 태그의 샘플 다중화 기능을 향상 정량 프로테오믹스 전략이다. 이 프로토콜은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 조직에 cPILOT의 응용 프로그램을 설명합니다.
Abstract
질병의 이해와 바이오 마커의 발견을위한 많은 생물학적 샘플을 분석하는 요구가 증가하고있다. 여러 샘플의 동시 측정이 확산되고 크게 실험 비용과 시간을 단축 한 수 정량 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리 연구실은 기존의 동위 원소 표지 또는 등압 태그 방식의 샘플 멀티플렉싱을 향상 동위 원소 라벨 및 동중 태그 (cPILOT) 결합 전구체라는 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT은 세포, 조직, 체액, 또는 전체 유기체로부터 유래 된 샘플에 적용하고 다른 샘플 조건에 걸쳐 상대적 단백질 존재비에 대한 정보를 제공 할 수있다. cPILOT는 낮은 pH 완충액 조건을 이용하여) (1)에 의해 작동 선택적 dimethylate 펩티드 N 말단 2)) 재료 / 시약의 표를 참조 (시판 등압 시약 리신 잔기의 차 아민 라벨을 높은 pH 완충액 조건을 사용한다. 의 정도가능한 샘플 다중화 사용 전구체 레이블의 수 및 등압 태그 시약에 의존한다. 여기서는 한 번의 분석 마우스 조직에서 12 개 샘플을 분석하는 여섯 플렉스 등압 시약과 함께 광 무거운 디메틸 화를 사용하여 12 플렉스 분석을 제시한다. 향상된 다중 적은 실험 편견과 오류, 더 중요한 것은 실험 시간과 비용을 줄일 수 많은 샘플 조건 (생물 복제, 병기, 약물 치료, 유전자형, 또는 세로 시간 포인트)에서 비교를 허용하는 도움이됩니다. 본 연구에서는 글로벌 cPILOT 방법은 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 생물 복제에서 간 조직을 분석하는 데 사용됩니다. 글로벌 cPILOT 다른 생물학적 과정을 연구에 적용되고, 20 개 이상의 샘플을 샘플 다중화를 증가하도록 구성 될 수있다.
Introduction
단백질 체학은 종종 더 나은 질병 과정을 이해하는 데 많은 샘플, 효소 반응 속도론, 번역 후 수정, 환경 자극에 대한 반응, 치료 치료, 바이오 마커 발견, 약물 메커니즘에 대한 응답의 분석을 포함한다. 정량 방법은 시료 전체 단백질 수준에서의 상대적인 차이를 측정하고 라벨없는 일 수 있거나, 동위 원소 표지 (대사, 화학적, 또는 효소)를 포함하는 이용 될 수있다. 그들은 많은 시료를 동시에 분석 할 수있게하고 다른 세포, 조직, 체액, 또는 유기체 전체 샘플에 적합하기 때문에 안정 동위체 표식 방법은 인기가 증가했다. 동위 원소 표지 방법 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 증가 실험 처리량획득 시간, 비용, 및 실험 오차를 줄일 수있다. 이러한 방법은 펩티드의 단백질 피크의 상대 존재비를 측정하는 전구체 질량 스펙트럼을 사용한다. 대조적으로, 태그 등압 시약 8, 9, 10 중 하나를 MS / MS 또는 MS에서 검출되는 리포터 이온을 발생 3~11 스펙트럼 및 이들 피크는 단백질의 상대적 존재비를보고하는데 사용된다.
프로테오믹스 멀티플렉싱 현재 최첨단은 12 10 12 플렉스 플렉스 등압 태그 분석 중 13이다. 향상된 다중 샘플 (즉> 10 개 샘플) 방법은 세포 (18)의 분석을 위해 다른 사람에 의해 조직을 14, 15, 16, 17에 대해 실험실에서 개발하고있다 19, 20, 21, 또는 표적 펩티드 22 어떤 조직이. 우리는 동중 태그 (cPILOT)와 결합 전구체 동위 원소 표지라는 강화 된 다중화 기술을 개발했다. 글로벌 cPILOT 다른 샘플 조건 (≥12) (14) 전체의 모든 단백질의 상대적 농도에 대한 정보를 얻기에 유용합니다. 도 1은 일반적인 cPILOT 흐름을 나타낸다. 트립신 또는리스-C 펩티드는 선택적으로 낮은 pH (2)를 사용하여 디메틸 화와 N 말단에 및 높은 pH를 사용하여 6 플렉스 시약 리신 잔기로 표지된다. 이 전략은 실험 비용과 추가를 줄이는 데 도움이 동중 시약으로 분석 할 수있는 샘플의 수를 두 배로, 실험 단계 및 시간을 줄일 수 있습니다.
우리는 산화 번역 후 MODI을 연구하기 위해 다른 방법을 개발로 cPILOT는 유연3 nitrotyrosine의 변성 단백질 14, S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23 시스테인 함유 펩티드를 포함 fications. 또한 아미노산 선택적 접근 시스테인 cPILOT (cyscPILOT) (17)을 개발 하였다. 상부 이온 선택성 11 Y-1 - 이온 방법 (15) MS (3) 획득 리포터 이온 간섭을 줄이고 cPILOT의 정량 정확도를 향상시킬 수있다. 저해상도 이온 트랩기구는 24 일 수 있지만, 획득 방법에서 MS (3)의 사용은 orbitrap 질량 분석기 고해상도 장비를 필요로한다.
이전 cPILOT는 알츠하이머 병 마우스 모델에서 간 단백질 (16)을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 periphe의 역할을 연구하는 뇌, 심장, 간 균질를 사용하여 글로벌 cPILOT 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다알츠하이머 병의 스피. 이 실험은 생물학적 복제를 통합합니다. 때문에 cPILOT의 다양성의 관심 사용자는 생물 문제와 시스템의 범위를 다른 조직을 연구하는 기술을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
윤리 선언문 : 마우스는 독립적 인 비영리 생명 의학 연구 기관에서 구입 한 피츠버그 대학의 실험 동물 자원의 부문에 보관되었다. 모든 동물 프로토콜은 피츠버그 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
화학 태그 1. 단백질 추출 및 펩타이드 생성
- 조직, 세포, 또는 체액에서 단백질을 추출합니다.
- 기계적 균질기를 사용하여 8 M 우레아 (500 μL)를 인산 완충 식염수 조직 (예 : 뇌, 심장, 간) (1X PBS) 60-90 mg의 균질화. 필요한 경우, 프로테아제 억제제 또는 인산 버퍼에 추가 될 수있다. 이 프로젝트에서, 그들은 사용되지 않았다. 균질 대해 다음 파라미터를 사용하여 행렬 A 비드, 4m / 초, 20 초를 용균. 심장 조직을 균질화의 최대 9 사이클을 필요로 할 수있다.
참고 : 프로테아제 또는 포스 파타 아제 억제제 필요한 경우, S가 버퍼에 추가 될 수있다. 그들은이 연구에 사용되지 않았다.- 용균 튜브에서 조직 균질 액을 제거하고 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 8 M 우레아의 PBS 100-500 μL와 튜브 용균 헹구고 조직 파쇄 액과 세정액을 결합한다.
- 균질 조직을 원심 분리 (9,447 XG, 4 ℃, 15 분)하여 상층 액을 모은다.
- 기계적 균질기를 사용하여 8 M 우레아 (500 μL)를 인산 완충 식염수 조직 (예 : 뇌, 심장, 간) (1X PBS) 60-90 mg의 균질화. 필요한 경우, 프로테아제 억제제 또는 인산 버퍼에 추가 될 수있다. 이 프로젝트에서, 그들은 사용되지 않았다. 균질 대해 다음 파라미터를 사용하여 행렬 A 비드, 4m / 초, 20 초를 용균. 심장 조직을 균질화의 최대 9 사이클을 필요로 할 수있다.
- 제조자의 지시에 따라 bicinchoninic 산 (BCA) 분석법을 이용하여 단백질 농도를 결정한다.
주 : 단백질 농도가 너무 높으면 버퍼 희석 또한 필요할 수있다. 이들 조직으로부터 얻어진 시료 농도 6-13 ㎍ / μL 사이에 있었다.- 선택적 : 1 비율 μg의 표준 내부 품질 관리 표준 (예 : 소 알파 카제인 또는 다른 외래 단백질)을 추가 100 μg의 단백질 샘플.
- 각 샘플로부터의 단백질 100 μg의 (100 × 10-6 g)를 첨가 개별적 마이크로 원심 분리기 튜브로 표시한다. 볼륨이 단백질 농도에 의존한다 (단계 1.2 참조).
- 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 40) 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가한다. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 몰비의 계산은 66.5 × 103 G / 몰이다 소 혈청 알부민 단백질 질량 (BSA) 기반으로한다.
- 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 80) 요오도 아세트 아미드 (IAM)를 추가한다. 2 시간 동안 어둠 속에서 얼음에 품어. 이 반응은 부반응을 방지하기 위해 2 시간 동안 얼음상에서 수행된다.
- 각 샘플 (몰 비율 샘플 1 시약 40) -L- 시스테인을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
- M. 2의 최종 농도로 희석 우레아, 10 mM의 CaCl2를 (PH 8.2)에 20 mM 트리스 완충액 추가
- 추가 L-1-tosylamido -2- 페닐 클로로 메틸 케톤 (TPCK)을 트립신 처리 한 (501 기판에 각 시료) 몰 비율을 효소 및 24 시간 동안 37 ° C에서 배양.
- 플래시 동결 추가 처리 될 때까지 -80 ℃에서 액체 질소에 저장하여 샘플을 단백질 분해 담금질.
3. 샘플 탈염
- 포름산 (FA)를 첨가하여 샘플을 다시 산성화. 0.1 %의 최종 농도를 얻기 위해 충분한 FA를 추가합니다. 시료는 -80 ° C에서 원래 경우 다시 산성화 전에 얼음에 샘플을 해동.
- 탈 염은 이전에 균형으로 C 18의 친수성 친 유성 (HLB) 10 mg의 카트리지를 사용하여 펩티드 16 기재.
- ~ 10 μL의 부피로 진공 원심 분리 (5 토르, 45 ° C, 77 XG)하여 샘플을 건조.
4. 디메틸 화 라벨 (N 말단)
- 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 또는 나노 - 순수한 등급의 물에 용해 된 1 % 아세트산 펩타이드 (0.25 ㎍ / μL) 재구성한다. 50 μ 제거; g의 새로운 마이크로 원심 분리 튜브 (1.5 ㎖)에 부와 -80 ° C의 나머지를 저장한다.
- (8) 60 mM의 (4 %) CH의 μL 2 O (37 % 중량 / V) 또는 60 mM의 (4 %) 13 CD 2 O (20 % 중량 / V) 또는 많이 디메틸 화와 표지 용 샘플 각각을 추가 . 일반적으로, 시약 4 μL 펩타이드 25 μg의 (단계 4.2, 4.3, 4.6)에 따라 첨가된다.
- 각각 밝거나 무거운 디메틸 화, 표지 샘플에 24 밀리미터의 NaBH 3 CN 24 mM의 3 NaBD CN 8 μL를 추가한다.
- 소용돌이와 실온에서 ~ 10 분 튜브 쉐이커에 흔들.
- 5 분 동안 1 % 암모니아수 (~ 28-30 %의 v / v)의 16 μL를 첨가하여 반응을 켄칭 하였다. 일반적으로, 시약 8 μL 펩타이드 25 μg의 당 추가된다.
- 다시 산성화시키고, 5 % FA 8 μL 첨가하여 반응 혼합물 (98 %의 절 / V).
- 여섯 개 개의 샘플을 생성하는 광 및 무거운 dimethylated 펩티드 (도 1)에 결합한다. 표 1을 참조하십시오
- 단계 3.2 및 3.3에 따라 샘플 탈염을 수행합니다.
5. 등압 태그 (라이신 잔기)
- 트리 에틸 암모늄 바이 카보네이트 (TEAB) 완충액 (pH ~ 8.5) 100 mm 단위 dimethylated 펩타이드 100 μg의 (1 개 ㎍ / μL)를 재구성한다.
- 제조 업체의 프로토콜에 명시된 바와 같이 동중 시약을 준비합니다 (재료 / 시약의 표 참조).
- ~ 10 초 동안 펩티드 및 와류에 용해 등압 시약 (41 μL)을 추가한다. ~ 1 시간 동안 마이크로 원심 분리기 튜브 통에 샘플을 흔들어. 8 μL 히드 록실 아민과 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양 (/ V w 10 %)로 반응을 켄칭 하였다.
- 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 혼합 한 탈염 (단계 3.1 내지 3.3) 또는 저장소로 여섯 개 표지 샘플 풀.
참고 : 프로테옴 범위와 깊이를 개선하기 위해, 다차원 분리 전략 제안같은 강한 양이온 교환 (SCX).
6. 강한 양이온 교환
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 SCX을 수행합니다 (재료 표 참조).
- 포름산 암모늄 용액 ~ 1 ㎖ (20 mm의 40 mm의 60 mm의 80 mm의 100 mm의 150 mm의 250 밀리미터, 500 mM)을 10 % 아세토 니트릴 (ACN), 0.1 % FA 핀 (PH3)을 준비.
- 피펫 팁의 상단에서 빨간 모자를 제거하고 포장 재료는 피펫 팁의 바닥을 향해 있는지 확인하기 위해 슬러리 포장과 피펫 팁을 누릅니다.
참고 : 치명타 : 프로토콜이 끝날 때까지 피펫 팁을 버리지 마십시오. - 마이크로 원심 분리 튜브 (2 ㎖)의 상부에 원심 어댑터를 놓고 내부 피펫 팁을 고정.
- 피펫 팁 SCX 재구성 버퍼 150 μL를 추가합니다.
- 실온 (4000 XG)에서 6 분간 피펫 팁을 원심 분리기. 이 단계를 두 번 더 반복하고 폐기물을 폐기하십시오.
- 는 P를 녹이고SCX 재구성 완충액 150 μL의 eptides. pH가 3인지 확인합니다.
- 피펫 팁, 원심 분리기 (6.1.5 참조) 펩티드를 추가하고 용리액을 유지한다.
- 새로운 마이크로 원심 분리 튜브 (2 mL) 중 상기 필터와 피펫으로 옮기고하는 20 mM 포름산 암모늄 용액 150 μL를 추가한다. 실온 (4000 XG)에서 6 분 동안 원심 분리하여 용출액을 유지한다.
- 6.1.8 단계를 반복하여 추가의 일곱 번, 암모늄 포르 메이트의 연속적인 농도 (즉, 40 mm의 60 mm의 80 mm의 100 mm의 150 mm의 250 mM 내지 500 mm)를 사용.
- 마이크로 원심 분리기 튜브 (1.5 mL)을 8 개의 분획을 SCX 옮기고 원심 증발을 사용하여 그것들을 집중한다 (단계 3.3 참조).
7. 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)와 MS (3)
- 0.1 % FA, 필터 질량 분석 등급 물에 펩티드를 재구성하고, 오토 샘플러 바이알에 배치했다. FOLL 같은 필터 펩티드OWS :
- 0.65 μm의 필터를 포함하는 미세 원심 분리 관에 추가 재구성 펩티드 (재료 표 참조).
- 1 분 동안 12,000 XG 원심 분리기 펩타이드. 필터를 제거 폐기하고, 자동 샘플러 병에 필터링 된 펩티드를 추가 할 수 있습니다.
- 다음 이동상 버퍼 준비 : 3 %, 0.1 %, FA (A)와 (V / V) ACN 100 % ACN 0.1 % FA (B)와.
- C (18) 재료 (는 5㎛, 200 Å 기공 크기)를 2cm로 충전 트랩 컬럼 상 SCX 각 분획 시료 6 μL를 주입한다.
주 : 다음에 트랩 샘플 세정 : 3 분, 0 % B 단계; 2 차원 액체 크로마토 그래피 시스템을 사용하여 3 μL / 분 (재료 표 참조). - 분석 분리 방법을 실행합니다. C (18) 재료로 충전 된 75 μm의 ID X 13.2 cm 레이저 인출 팁 용융 실리카 모세관 컬럼 (5 ㎛의 100 Å)을 사용한다. 구배는 : 0-5 분, 10 % B; 5-40 분 10-15 % B; 40-90 분 15-25 % B; 90-115 분 25-30 % B; 115-130 분 30-60 % B; 130-135 분 60-80 % B; 135-145 분, 80 % B, 145-150 분, 80-10 %의 B; 150-180 분, 10 % B; 300 거리 nL / 분, 180 분.
- 분석 분리 방법을 실행하는 동안 질량 분석기에 대한 데이터 수집을 실행합니다.
주 : 400-1,600 m / z 60,000 해상도, 자동 이득 제어 (AGC)는 1 × 106 이온, 최대 분사 시간이 500ms 타겟팅 다음과 같이 조사 MS 스캔을위한 파라미터이다. 다음 CID-MS / MS에 대한 파라미터들은 : 상위 1-7 또는 상부 8-14 데이터 종속 수집 (DDA), 3m / z 분리 폭 500 최소 신호 35 % 정상화 충돌 에너지 (NCE), 0.25 활성화 Q 10 밀리 활성화 시간, 3 × 104 AGC, 50 밀리 초, 최대 분사 시간. 다음 HCD-MS (3)에 대한 매개 변수는 200의 최소 신호 4 m / z 분리 폭 60 % NCE 0.1 활성화 시간, 3 × 105 AGC 250 개 단말 IT를 300-1,300 m / z MS / MS 선택 범위 , 유엔 조각 부모 이온을 제외 할 수 있습니다.
8. 데이터 분석 (16)
- 마우스 Uniprot 같은 적절한 데이터베이스에 대한 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 RAW 파일을 검색 할 수 있습니다.
주 : 빛과 무거운 dimethylated 펩티드를 검색하기 위해 각 RAW 파일에 대한 두 개의 워크 플로우를 작성하는 것이 중요합니다. - 다음 매개 변수를 사용하여 RAW 파일을 검색이 놓친 분열, 펩타이드의 질량 범위 300-6,000 다, 15 ppm의 부모 중량 허용 오차, 1 개 다 단편화 허용 오차 트립신. 정적 변형 : 광 디메틸 화 (28.031, N 말단 펩티드) 또는 Heavy의 디메틸 화 (36.076 다, N 말단 펩티드) carbamidomethyl (57.021 다, C).
주 : 중쇄 때때로 dimethylated 피크는 7 ~ 다 (35.069 다, N 말단 펩티드)에 광 dimethylated 피크 내지 때문에 무거운 dimethylated 펩타이드의 검색 작업 흐름에 통합되어야한다. 동적 변형 : 산화 (15.995 다, M), 6- 플렉스 등압 태그 (229.163 다, K). 거짓 검색 속도를 얻을 수있는 미끼 데이터베이스 검색 (예 : 1, 5 %)와 동중 태그의 기자 이온 농도를 검색 할 수있는 정량 노드를 포함합니다. - 통계
- 위해서는 전자 스프레드 시트 프로그램에 데이터 내보내기 단백질 리포터 이온 값을 정규화한다. 각 단백질은 각각 내부 표준의 내부 표준 또는 원시 리포터 이온 농도의 중간 비율로 평균 리포터 비 이온 또는 원시 리포터 이온 농도 중 하나를 나눈다. 이러한 전자 스프레드 시트 프로그램, PERS으로 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여EUS, 또는 R 샘플 조건 사이에 큰 변화를 확인합니다.
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Representative Results
cPILOT은 N 말단 및 리신 잔기에 라벨 펩티드를 화학적으로하는 아민 계 화학 제를 사용하여 시료 다중화 기능을 향상시킨다. 그림 2는 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤에서 뇌, 심장, 간 조직의 12 플렉스 cPILOT 분석에서 얻어진 대표 MS의 데이터를 보여줍니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 병 및 야생형 생쥐 두 생물 복제이 12 플렉스 분석에 포함되어 있습니다. 도 2a는, 펩티드에 도입 된 하나의 다이 메틸 그룹을 나타내는 4 m / z 간격에 의해 분리되는 이중 하전 피크 쌍을 나타낸다. 광이 한 쌍의 무거운 dimethylated 피크 모두 CID 독립적으로 절연 및 파편이다. dimethylated 펩티드의 각각에 대한 MS / MS 데이터를도 2b 및 C에 도시되어있다. 검색 결과는이 파이를 표시피크 R은 T (디메틸) ELNYFAK (등압 태그 6) 광 무거운 dimethylated 피크 모두 유사한 단백질 포스 포 키나아제 (1) 가장 강한 단편 이온 Y 3+의 펩티드에 속한다. 이들 피크는 HCD-MS (3)을 더 격리되고도 2D 및 2E에 도시 된 바와 같이 리포터 이온 (m / z 126-131)가 관찰된다. MS 3 스펙트럼의 두 세트는 12 개 샘플에 대한 정보를 얻을 필요합니다. 이 예에서, 뇌, 간, 심장 조직에 대한 기자 이온 비율 (AD / WT) (알츠하이머 병 / 와일드 형 제어) 두 생물 복제에서 유사하다. 각 비교를 위해 접이식 변경 값은 간에서 수준이 낮은 반면 뇌와 마음의 포스 포 키나제 1 개 수준, AD 마우스에 더 높은 것이 좋습니다.
Figu1 다시 : 프로테오믹스 cPILOT 흐름을 사용. 예로서, 이러한 흐름은 12 개 개인 시료의 분석을 설명합니다. 조직, 세포, 또는 체액에서 단백질을 추출하고, 적절한 표준 단백질 (예 : 소 알파 카세인)를 첨가 하였다. 단백질을 트립신을 사용하여 분해된다. 펩티드 TMT 6 -plex (pH가 ~ 8.5)을 이용하여 빛 또는 무거운 디메틸 화 (약 pH 2.5) 및 리신 잔기로를 사용하여 N 말단에 표지된다. 표지 된 펩티드를 SCX RP-LC-MS / MS 및 MS (3)에 하나의 혼합물로 풀링 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 뇌, 심장 및 알츠하이머 병 마우스 모델 및 야생 형 컨트롤의 간 조직에서 펩티드의 예 cPILOT 데이터입니다. (A)은 m / z 643.854 647.875과의 피크로 표시되는 광 무거운 dimethylated 펩티드를 나타낸다. 이러한 펩티드는 펩티드 따라서 식별을 제공 CID-MS / MS 스펙트럼 (B 및 C)을 생성 격리 선택되고, 단편화했다. 상기 MS / MS 단계에서 광 무거운 dimethylated 펩티드의 가장 강한 단편 이온의 추가적인 선택 분리 및 분할은 각각 3 HCD-MS 스펙트럼 (D 및 E)을 생성. 펩티드 서열은 T (디메틸) ELNYFAK (등압 태그 6)이며, 1 키나제 포스 속하는 이 도면의 확대를 보려면 여기를 클릭하세요.
| 동중 시약0; | ||||||
| (126) | 127 | (128) | 129 | 130 | (131) | |
| 빛 디메틸 화 | WT A를 | 광고 B | WT | 광고 | WT | 광고 |
| 뇌 | 심장 | 간 | ||||
| 헤비 디메틸 화 | WT | 광고 | WT | 광고 | WT | 광고 |
| 심장 | 간 | 뇌 | ||||
| 조직은 하나 야생 형 제어 (WT) A 또는 알츠하이머 병 마우스 (AD) B에서. | ||||||
표 1 : AD와 WT 뇌, 심장 및 간 조직의 cPILOT 그룹화.
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Discussion
cPILOT는 12 개 이상의 독특한 샘플의 동시 측정을 허용한다. 펩티드의 N 말단 리신 잔기 모두 성공적인 태깅을 보장하기 위해, 반응의 각 세트에 대한 정확한 산도를 갖는 펩티드 및 라벨링 먼저 디메틸 화 반응을 수행하는 데 필수적이다. N- 말단에 선택적 디메틸 화는 (± 0.2) ~ 2.5의 pH를 갖는 의해 수행된다. 이것은 라이신의 아미노기의 PKA의 차이 및 N 말단을 이용함으로써 달성된다. pH가 2.5에서 라이신이 비활성 상태 (PKA ~ 10.5); pH가 약간 (즉, pH를 5-7) 산성 또는 염기성 인 경우, 상기 N 말단 및 리신 잔기 모두 dimethylated한다. 등압 태그는 낮은 pH에서 먼저 수행되는 경우뿐만 아니라, 상기 N 말단은 등압 라벨 리신 잔기 dimethylated 될 것이다. 이것은 B-이온 선택해야하는 것처럼 MS (3)에 대해 선택되는 작은 조각 될 수있다. 디메틸의 상대적 비용ATION 반응은 상업 동중 시약에 비해 저렴합니다. 하나는 100 μg의 당 전체 동중 시약 병을 사용할 수 있지만, 우리는 또한 비교 표시 효율을 100 μg의 당 시약 병의 절반을 사용하여 성공을 거두었습니다. 이로 인해 개별 cPILOT 실험에 대한 비용을 절감하는 데 도움이 더 많은 샘플을 분석 할 수 있습니다. 또한 우리가 이전 14 증명과 같은 다른 동중 태그 시약이 프로토콜에 사용되는 동중 시약 대신에 사용될 수 있다는 점에 유의해야합니다. 높은 라벨 및 태그의 효율성을 보장하기 위해, 신속 샘플에 시약을 추가하는 것이 중요하다. 샘플은 거의 동일한 반응 시간을 가지고이 허용됩니다. 정량적 목적을 위해, 각각의 샘플은 디메틸 화 및 등압 라벨링 단계에서 샘플을 풀링 동일 특히 전에 처리되어야한다. 마지막으로,이 주목해야의 requir 초기 단계에서 동시에 많은 샘플 작업ES주의 사용자 기술과 관심 취급을 샘플링한다.
가장 이상적인 시나리오는 12 개 샘플들에 걸쳐 상기 혼합물에있는 모든 단백질 리포터 이온을 얻을 수있다. 그러나, 이것은 많은 단백질에 대한 경우가 아니다. 정량 cPILOT 정보 및 다른 향상된 다중 접근 검출 펩티드의 수는 표본 유형 샘플 분획 및 공정, MS 데이터 수집 방법 및 기기 유형을 포함한 여러 요인에 따라 달라진다. 디메틸 화 및 등압 태깅 단계 모두 95-99 % - 높은 펩티드 표지 효율을 갖지만, 여전히 존재한다 ~ 리포터 이온 정보가 들어 있지 않습니다 MS (3) 데이터의 20 %. 이 등압 시약없이 혼입 될 아르기닌 - 말단 펩티드를 생성하고, 트립신을 사용하여 부분적으로 기인한다. 이는 단백질 동정 (25)의 전위와 트레이드 오프 등의 lysC 같은 다른 효소를 사용하여 해결 될 수있다. 또한 무거운에 대한dimethylated 펩티드 단편화 선택된 피크는 서로 다른 강도를 가지고 있고 MS (3) 단계에서 관찰 리포터 이온 강도에 영향을 미칠 것이다 M 또는 M-1의 피크가 될 수있다. 따라서, 몇몇 샘플에 대해 검출되지 않는 일부 저휘 리포터 이온이 존재할 수있다. 이러한 상황들은 일반적으로 MS (3) 단계는 분리되어 저 강도 MS / MS 단편이 관찰된다. 이 문제에 대한 훌륭한 해결책을 대신 MS 3 단일 수준의 선택을 사용하는 다중의 노치 나 다수의 MS를 사용 tribrid 질량 분광계에 혼입 된 / MS (26)를 분해한다.
특히 (상업 동중 시약 20까지, 즉) 하나의 분석에서 비교 될 수있는 샘플의 수에 관해서 및 사용 조직의 유형과 cPILOT 방식의 다양성이 많이 있습니다. 우리는 뇌, 심장에서 정확한 정량적 인 정보를 얻기 쉽다는 것을 증명하고,질병의 맥락에서 동일한 분석에서 간 조직. 이 방법은 유사하게 다른 다중화 방식으로, 한 번에 여러 개의 시료의 분석을 가능하게하고, 세포, 조직, 체액, 또는 전체 유기체로부터 유래 된 샘플에 적용 가능하다. 또한, 표지 된 펩티드 cPILOT 낮은 24 고해상도 (60,000) 기기를 사용하여 분석 될 수있다. 이에 비해, 다른 다중화 방식을 사용하여 성공적인 측정을 획득하는 안정 동위 원소 라벨 매우 높은 해상도 (20), 또는 액세스 악기 샘플이 필요할 수의 특정 유형 (즉, 셀) (18)에 한정 될 수있다. cPILOT 질병의 이해, 바이오 마커 발견, 약물 또는 치료 개입, 또는 여러 시점에 걸쳐 길이 방향의 변화에 대응에 관심이있는 사용자에 좋은 곳입니다. 또한, 큰 샷건 위해 프로테오믹스 (N이 크면, 수백에서 수천)의 임상 샘플 (Cp)의 분석ILOT 또한 실험 비용과 시간을 절감 할 수 있도록 적합 할 수있다. 앞으로 cPILOT는 기존 및 새로운 동위 원소 및 동중 라벨을 사용하여 많은 샘플을 다중화 확대 될 것이다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 관심이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 RASR에 피츠버그 시동 자금의 대학과 NIH, NIGMS R01 부여 (GM 117191-01)를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
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