Summary
Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.
Abstract
Er is een toenemende vraag naar vele biologische monsters analyseren voor de ziekte van begrip en het ontdekken van biomarkers. Kwantitatieve proteomics strategieën waarmee gelijktijdige meting van meerdere monsters zijn wijdverspreid en experimentele kosten en tijd sterk verminderen. Ons laboratorium ontwikkelde een techniek genaamd gecombineerde precursor isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT), welk monster multiplexen van traditionele isotopische labeling of isobare tagging benadering verbetert. Global cPILOT kan worden toegepast op monsters afkomstig uit cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen en geeft informatie over de relatieve abundanties eiwit in verschillende monstercondities. cPILOT werkt door 1) het gebruik van lage pH buffer condities selectief dimethylate peptide N-termini en 2) met behulp van hoge pH buffer omstandigheden primaire aminen lysineresiduen labelen met commercieel verkrijgbare reagentia isobare (zie Tabel Materialen / Reagentia). De mate vansample multiplexen verkrijgbaar is afhankelijk van het aantal gebruikte etiketten precursor en isobare tagging reagens. Hier presenteren we een 12-plex analyse die lichte en zware dimethylering gecombineerd met zes-plex isobare reagentia om 12 monsters van muizenweefsels analyseren één analyse. Verbeterde multiplexing is nuttig voor experimentele tijd en kosten en nog belangrijker verminderen, waardoor vergelijking tussen verschillende monstercondities (biologische replicaten, ziektestadium, drugs, genotypen, of longitudinale tijdstippen) met minder experimentele vertekeningen en fouten. In dit werk wordt de globale cPILOT aanpak waarbij de hersenen, het hart en de lever weefsels door biologische replica's te analyseren vanuit een ziekte van Alzheimer muismodel en wild-type controles. Global cPILOT kan worden toegepast op andere biologische processen te bestuderen en ingericht om sample multiplexen stijgen tot meer dan 20 monsters.
Introduction
Proteomics gaat vaak gepaard met de analyse van vele monsters gebruikt om ziekteprocessen beter te begrijpen, enzymkinetiek, post-translationele modificaties, als reactie op prikkels uit de omgeving, als reactie op therapeutische behandelingen, de ontdekking van biomarkers of drug mechanismen. Kwantitatieve werkwijzen kunnen worden toegepast voor verschillen in relatieve eiwitniveaus in de monsters te meten en kan labelvrije blijkt of isotopische labeling (metabolische, chemisch of enzymatisch). Stabiele isotopen methoden zijn gegroeid in populariteit omdat ze laten veel monsters tegelijkertijd te analyseren en zijn geschikt voor monsters uit verschillende cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen. Isotopen werkwijzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 toename experimentele doorvoerterwijl het verminderen van acquisitie tijd, kosten en experimentele fout. Deze methoden gebruiken precursor massaspectra relatieve abundanties van eiwitten uit peptidepieken meten. Daarentegen isobare tagging reagentia 8, 9, 10 genereren reporter ionen die ofwel gedetecteerd in MS / MS en MS3 spectra en 11 deze pieken worden gebruikt voor het rapporteren van de relatieve abundanties van eiwitten.
De huidige stand van de techniek in proteomics multiplexing ofwel een 10-plex 12 of 12-plex isobare tag analyse 13. Verbeterde monster multiplexing (dwz> 10 monsters) methoden ontwikkeld door ons laboratorium voor weefsels 14, 15, 16, 17 en anderen voor de analyse van cellen 18 sup>, 19, 20, 21 weefsels of gerichte peptiden 22. We ontwikkelden een verbeterde multiplexing techniek genaamd gecombineerd voorloper isotopische labeling met isobare tagging (cPILOT). Global cPILOT is nuttig om informatie over de relatieve concentraties van eiwitten in verschillende monstercondities (≥12) 14. Figuur 1 toont een algemene werkstroom cPILOT. Tryptische of Lys-C peptiden selectief gelabeld aan de N-terminus met behulp dimethylering lage pH 2 en lysineresten met 6-plex reagentia met behulp van hoge pH. Deze strategie verdubbelt het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd isobare reagentia die helpt om experimentele kosten en bovendien verminderen, vermindert experimentele werk en tijd.
cPILOT is flexibel als we andere methoden hebben ontwikkeld om oxidatieve post-translationele modi te bestuderencaties, waaronder 3-nitrotyrosine gemodificeerde eiwitten 14 en cysteïne bevattende peptiden met S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. We hebben ook een aminozuur selectieve aanpak, cysteïne cPILOT (cyscPILOT) 17. MS3 verkrijgen met een top-ion 11 of selectief y 1 -ion werkwijze 15 kan helpen verminderen reporter ion interferentie en verbetering kwantitatieve nauwkeurigheid van cPILOT. Het gebruik van MS3 in het verwerven werkwijze vereist een hoge-resolutie welks orbitrap massa-analysator hoewel lage resolutie iontrap instrumenten mogelijk ook 24.
Eerder heeft cPILOT is gebruikt om de lever eiwitten 16 studeren aan de ziekte van muismodel van Alzheimer. Hier beschrijven we hoe de wereldwijde cPILOT analyses uit te voeren met behulp van de hersenen, hart en homogenaten lever naar de rol van de randapparatuur, te bestuderenry bij de ziekte van Alzheimer. Dit experiment omvat biologische replicatie. Vanwege de veelzijdigheid van cPILOT, kunnen geïnteresseerde gebruikers van de techniek gebruiken om andere weefsels te studeren voor een scala aan biologische problemen en systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: De muizen werden gekocht van een onafhankelijke, non-profit instelling biomedisch onderzoek en ondergebracht in de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Universiteit van Pittsburgh. Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Pittsburgh.
1. Eiwit extractie en het genereren van peptiden voor Chemisch-tagging
- Extract eiwit uit weefsels, cellen of lichaamsvloeistoffen.
- Homogeniseer 60-90 mg weefsel (bijvoorbeeld hersenen, hart en lever) in fosfaatbuffer zoutoplossing (1 x PBS) met 8 M ureum (500 uL) met een mechanische homogenisator. Protease of fosfatase remmers kan aan de buffer worden toegevoegd indien nodig. In dit project werden ze niet gebruikt. Gebruik de volgende parameters voor de homogenisator: lyseren matrix A kralen, 4 m / s, 20 s. Hartweefsel kan tot 9 cycli van homogeniseren vereisen.
OPMERKING: Protease of fosfatase inhibitor en kan aan de buffer worden toegevoegd indien nodig. Ze werden niet gebruikt in deze studie.- Verwijderen weefsel homogenaat uit de lyserende buis overbrengen naar een micro-centrifugebuis. Spoel lyseren buizen met 100-500 pi PBS met 8 M ureum en voeg de spoeloplossing met weefsel homogenaat.
- Centrifugeer de gehomogeniseerde weefsels (9447 x g, 4 ° C, 15 minuten) en verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Homogeniseer 60-90 mg weefsel (bijvoorbeeld hersenen, hart en lever) in fosfaatbuffer zoutoplossing (1 x PBS) met 8 M ureum (500 uL) met een mechanische homogenisator. Protease of fosfatase remmers kan aan de buffer worden toegevoegd indien nodig. In dit project werden ze niet gebruikt. Gebruik de volgende parameters voor de homogenisator: lyseren matrix A kralen, 4 m / s, 20 s. Hartweefsel kan tot 9 cycli van homogeniseren vereisen.
- Bepaal de eiwitconcentratie onder gebruikmaking van een bicinchoninezuur (BCA) assay volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Verdere verdunning met buffer kan nodig zijn als de eiwitconcentratie te hoog. De resulterende concentraties van monsters van deze weefsels waren tussen 6-13 ug / ul.- Facultatief: voeg een interne kwaliteitscontrole standaard (bijvoorbeeld runder a caseïne of andere exogene eiwit) met een verhouding van 1 gg standaard: 100 ug eiwitmonster.
- Voeg 100 g (100 x 10 -6 g) eiwit van elk monster afzonderlijk gelabelde micro-centrifugebuizen. De omvang is afhankelijk van de eiwitconcentratie (zie stap 1.2).
- Voeg dithiothreitol (DTT) (40: 1 reagens molverhouding monster) aan elk monster. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. De berekening van de molverhouding is gebaseerd van de eiwitmassa van runderserumalbumine (BSA), dat 66,5 x 10 3 g / mol.
- Voeg joodaceetamide (IAM) (80: 1 reagens molverhouding monster) aan elk monster. Incubeer op ijs in het donker gedurende 2 uur. Deze reactie wordt uitgevoerd op ijs gedurende 2 uur nevenreacties te voorkomen.
- Add L-cysteïne (40: 1 reagens molverhouding monster) aan elk monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Voeg 20 mM Tris-buffer met 10 mM CaCl2 (pH 8,2) ureum verdunnen tot een eindconcentratie van 2 M.
- Add L-1-tosylamido 2-fenylethyl chloormethylketon (TPCK) behandeld trypsine (50: 1 substraat molverhouding enzyme) aan elk monster en incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Schrik de eiwitvertering van flash-bevriezen van het monster in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot verdere verwerking.
3. Voorbeeld Ontzouten
- Opnieuw zuur de monsters door toevoeging van mierenzuur (FA). Voeg genoeg FA tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% te verkrijgen. Als monsters die oorspronkelijk bij -80 ° C, ontdooien monsters op ijs alvorens opnieuw verzuring.
- De zout-peptiden middels C18 hydrofiel lipofiel evenwicht (HLB) 10 mg patronen zoals eerder beschreven 16.
- De monsters door vacuüm centrifugeren (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) tot een volume van ~ 10 pi.
4. dimethylering Labeling (N-termini)
- Reconstitueren peptiden in 1% azijnzuur (0,25 ug / ul) opgelost in hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) of nano-zuivere kwaliteit water. Verwijderen 50 μ, G portie van een nieuwe micro- centrifugebuis (1,5 ml) en bewaar de rest bij -80 ° C.
- Voeg ul van 60 mM (4%) CH of O (v 20% gew /) respectievelijk 8 2 O (37% gew / v) 60 mM (4%) 13 CD 2 de monsters voor merken met lichte of zware dimethylering, . Typisch wordt 4 pl reagens per 25 ug peptiden (stappen 4.2, 4.3, 4.6) toegevoegd.
- Voeg 8 pi 24 mM NaBH3CN of 24 mM NaBD CH3CN het gelabeld met lichte of zware dimethylering respectievelijk monsters.
- Vortex en schudden op een buis schudder 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Blus de reactie door toevoeging van 16 gl 1% ammoniak (~ / v 28-30% v) gedurende 5 minuten. Typisch wordt 8 pl reagens per 25 ug peptiden toegevoegd.
- Opnieuw zuur de reactiemengsels door toevoeging van 8 pi 5% FA (98% v / v).
- Combineer de lichte en zware dimethyl peptiden (figuur 1) tot een totaal van zes monsters genereren. Zie tabel 1
- Voeren ontzouten monster volgens de stappen 3.2 en 3.3.
5. Isobaric Tagging (Lys resten)
- Reconstitueren 100 ug gedimethyleerd peptiden (1 ug / ul) in 100 mM tri-ethyl ammoniumbicarbonaat (TEAB) -buffer (pH ~ 8,5).
- Bereid isobare reagentia, zoals vermeld in het protocol van de fabrikant (zie tabel of Materials / reagentia).
- Voeg oplosbaar isobare reagentia (41 pl) peptiden en vortex voor ~ 10 s. Schud de monsters op een micro-centrifugebuis schudder 1 uur. Blus de reactie met 8 pi hydroxylamine (10% w / v) en incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- de zes gelabelde monsters te bundelen tot een enkel mengsel en ontzouten (Stappen 3,1-3,3) en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.
LET OP: Voor het verbeteren van proteoom dekking en diepte, een multi-dimensionale scheiding strategie wordt gesuggereerdzoals sterke kationuitwisseling (SCX).
6. Sterk Kationenuitwisselings
- Voer SCX volgens het protocol van de fabrikant (zie Materials Table).
- Bereid ~ 1 ml ammoniumformaat oplossing (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM en 500 mM) met 10% acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
- Verwijder de rode dop van de bovenkant van de pipetpunt en tik de pipetpunt met verpakking slurry zodat het verpakkingsmateriaal is naar de bodem van de pipetpunt.
LET OP: Kritiek: Gooi de pipetpunt tot het einde van het protocol. - Plaats de centrifuge adapter op de bovenkant van een micro-centrifugebuis (2 ml) en zet de pipetpunt binnen.
- Voeg 150 ul van SCX reconstitutie buffer om pipet tips.
- Centrifugeer de pipetpunten gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur (4.000 xg). Herhaal deze stap nog twee keer en het afval weggooien.
- Los de peptides in 150 pl buffer SCX reconstitutie. Waarborgen dat de pH 3.
- peptiden toe te voegen aan de pipet tips, centrifuge (zie 6.1.5), en houden de eluens.
- Breng de filter en pipet naar een nieuwe micro- centrifugebuis (2 ml) en voeg 150 ul van 20 mM ammoniumformaat oplossing. Centrifugeer gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur (4.000 xg) en houdt het elutiemiddel.
- Herhaal stap 6.1.8 nog zeven malen waarbij opeenvolgende concentraties (dat wil zeggen 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM en 500 mM) ammoniumformiaat.
- Breng de acht SCX fracties micro-centrifugebuizen (1,5 mL) en concentreer ze door centrifugale verdamping (zie stap 3.3).
7. vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) en MS3
- Reconstitueren de peptiden in massaspectrometrie kwaliteit water met 0,1% FA, filter, en plaats in een autosampler flesje. Filter peptiden als follows:
- Voeg gereconstitueerd peptiden aan een micro-centrifugebuis die een 0,65 urn filter (zie Materialen tabel).
- Centrifugeer peptiden bij 12.000 xg gedurende 1 minuut. Filter verwijderen, verwijderen, toevoegen gefiltreerd peptiden in een autosampler flesje.
- Bereid de mobiele fase buffers als volgt: 3% (v / v) ACN met 0,1% FA (A) en 100% ACN met 0,1% FA (B).
- Injecteren 6 pi van elke fractie SCX monster op een val kolom gepakt tot 2 cm met C18 materiaal (5 urn, 200 A poriegrootte).
OPMERKING: Sample schoonmaak op de val is als volgt: 3 min, 0% B; 3 pl / min met een 2D vloeistofchromatografiesysteem (zie Materialen tabel). - Voer de analytische scheidingswerkwijze. Een 75 um ID x 13,2 cm laser uitgetrokken uiteinde fused silica capillaire kolom gepakt met C18 materiaal (5 urn, 100 A). De gradiënt: 0-5 minuten, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
- Voer de gegevensverwerving voor de massaspectrometer terwijl de analytische scheidingswerkwijze wordt uitgevoerd.
Opmerking: De parameters voor de MS survey scan zijn: 400-1,600 m / z 60.000 resolutie, automatische versterkingsbesturing (AGC) targeten 1 x 10 6 ionen, maximale injectietijd van 500 ms. Parameters voor CID-MS / MS zijn: Top 07/01 of 14/08 Top data afhankelijke acquisitie (DDA), 3 m / z isolatie breedte 500 minimumsignaal, 35% genormaliseerd botsingsenergie (NCE), 0,25 q activering , 10 ms activeringstijd, 3 x 10 4 AGC 50 ms maximale injectietijd. Parameters voor HCD-MS3 zijn: 200 minimumsignaal, 4 m / z isolatie width, 60% NCE, 0,1 activeringstijd, 3 x 10 5 AGC 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS selectiereeks , exclusief niet-gefragmenteerde ouder ion.
8. Data Analysis 16
- Zoeken in de RAW-bestanden met behulp van eiwit analyse software tegen een geschikte database, zoals muis Uniprot.
LET OP: Het is belangrijk om twee workflows voor elk RAW-bestand aan te maken om te zoeken voor lichte en zware digemethyleerde peptiden. - Zoek de RAW bestanden met de volgende parameters: trypsine met twee gemiste splitsingen, peptide massabereik 300-6,000 Da, 15 ppm ouder massatolerantie, 1 Da fragmentatie tolerantie. Statische wijzigingen: licht dimethylering (28,031, peptide N-terminus) of heavy dimethylering (36,076 Da, peptide N-terminus), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
Opmerking: soms zware digemethyleerde piek ~ 7 Da (35,069 Da, peptide N-terminus) tussen het licht digemethyleerd piek en derhalve moeten in de zoektocht workflow voor zware digemethyleerde peptiden worden opgenomen. Dynamische modificaties: oxidatie (15,995 Da, M), 6-plex isobare tag (229,163 Da, K). Onder een lokken databankonderzoek valse discovery basisrente (bijvoorbeeld 1 en 5%) en een kwantificering knooppunt te zoeken naar de reporter ionenintensiteiten van isobare labels. - Statistieken
- gegevensuitvoer in een elektronisch spreadsheetprogramma om eiwitreportermolecuul ion waarden normaliseren. Voor elk eiwit, verdeel ofwel de mediaan reporter ionverhoudingen of ruwe reporter ionintensiteiten de mediaanratio van de interne standaard of ruwe reporter ionintensiteiten van de interne standaard, respectievelijk. Gebruik de juiste statistische software zoals een elektronische spreadsheet-programma, Perseus, of R om significante veranderingen bij steekproef voorwaarden vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cPILOT gebruikt op amine gebaseerde chemie label peptiden aan de N-terminus en lysine- resten chemisch en verbetert monster multiplexing mogelijkheden. Figuur 2 toont representatieve MS-gegevens die worden verkregen uit een 12-plex cPILOT analyse van hersenen, hart en leverweefsel van een Alzheimer muismodel en wildtype controles. Zoals getoond in tabel 1, zijn twee biologische repliceert voor de ziekte en wildtype muizen Alzheimer in deze 12-plex analyse. Figuur 2A toont een dubbel geladen piek koppel dat wordt gescheiden door m / z tussenruimte van 4 wijst één dimethylgroep werd opgenomen in het peptide. Zowel de lichte als zware digemethyleerde toppen van dit paar onafhankelijk van elkaar geïsoleerd en gefragmenteerd met CID. De MS / MS-gegevens voor elk van de gedimethyleerde peptiden wordt getoond in figuren 2B en C. Zoekresultaten aangeven pair pieken behoort tot de T (dimethyl) ELNYFAK (isobare-tag 6) peptide van het proteïne fosfoglyceraatkinase 1. De meest intense fragmention is y 3+ die vergelijkbaar voor zowel de lichte en zware digemethyleerd pieken. Deze pieken zijn verder geïsoleerd van HCD-MS3 en het reporter ionen (m / z 126-131) waargenomen zoals getoond in figuren 2D en 2E. Beide sets van MS 3 spectra zijn noodzakelijk om informatie over de 12 monsters te krijgen. In dit voorbeeld is de reporter ionverhoudingen (AD / WT) (ziekte / Wildtype control Alzheimer) voor de hersenen, lever en hartweefsel zijn vergelijkbaar in de twee biologische repliceert. De veelvoudverandering voor elke vergelijking suggereren dat fosfoglyceraatkinase 1 niveaus in de hersenen en hart zijn hoger in AD muizen, terwijl in de lever de niveaus lager zijn.
Figure 1: Proteomics workflow met cPILOT. Als voorbeeld, deze werkstroom schetst de analyse van 12 afzonderlijke monsters. Eiwitten uit weefsels, cellen of lichaamsvloeistoffen worden geëxtraheerd en geschikte eiwitstandaard (bijv boviene a-caseïne) wordt toegevoegd. Eiwitten worden gedigereerd met behulp van trypsine. Peptiden worden gelabeld aan de N-terminus met lichte of zware dimethylering (pH ~ 2,5) en lysineresten met TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Gelabelde peptiden zijn samengevoegd in een enkel mengsel en onder SCX RP-LC-MS / MS en MS3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld cPILOT gegevens van peptiden uit hersenen, hart en lever weefsels van een Alzheimer muismodel en wildtype controles. (A) toont lichte en zware gedimethyleerd peptiden, vertegenwoordigd door de pieken bij m / z 643,854 en 647,875. Deze peptiden werden geselecteerd, geïsoleerd en gefragmenteerd, waardoor het genereren CID-MS / MS spectra (B en C), die peptidenidentificatie voorzien. Een extra selectie, isolatie en fragmentatie van de meest intense fragmention van de lichte en zware digemethyleerde peptiden bij de MS / MS stadium gegenereerd HCD-MS3 spectra (D en E), respectievelijk. De peptidesequentie T (dimethyl) ELNYFAK (isobare-tag 6) en aangesloten kinase 1. fosfoglyceraat Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien.
| Isobaric reagens0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| Light dimethylatie | WT een | AD b | WT | ADVERTENTIE | WT | ADVERTENTIE |
| hersenen | hart- | lever | ||||
| heavy dimethylatie | WT | ADVERTENTIE | WT | ADVERTENTIE | WT | ADVERTENTIE |
| hart- | lever | hersenen | ||||
| Het weefsel is ofwel een wildtype controle (WT) a of Alzheimer muis (AD) b. | ||||||
Tabel 1: cPILOT groepering van AD en WT hersenen, hart en lever weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cPILOT voorziet in de gelijktijdige meting van meer dan 12 unieke monsters. Om succesvol tagging zowel de N-terminus en lysine resten van peptiden te verzekeren, is het noodzakelijk om de juiste pH voor elke set reacties en om de dimethylering eerste reactie uit te voeren voor peptide labeling. Selectieve dimethylatie op de N-terminus wordt uitgevoerd door een pH op ~ 2,5 (± 0,2). Dit wordt bereikt door het benutten van de verschillen van de pKa van de aminogroepen van lysine en N-terminus. Bij pH 2,5, lysine inactief is (pKa ~ 10,5); Indien de pH mild zuur (bijvoorbeeld pH 5-7) of basisch zijn zowel de N-termini en lysineresten worden digemethyleerd. Bovendien, als isobare tagging eerst wordt uitgevoerd bij een lage pH, wordt de N-termini hebben isobare label en lysineresten worden digemethyleerd. Dit kan leiden tot minder fragmenten gekozen voor MS3 als b-ionen zouden moeten worden geselecteerd. De relatieve kosten van de dimethylesteratie reacties zijn goedkoop in vergelijking met de commerciële isobare reagentia. Terwijl de ene een hele isobarisch reagensflesje kunt gebruiken per 100 ug, hebben we ook succes gehad met behulp van de helft van de reagensflesje per 100 ug met vergelijkbare labeling efficiency. Dit helpt om de kosten voor individuele cPILOT experimenten aanzienlijk verminderen en maakt het mogelijk meer monsters worden geanalyseerd. Het is ook belangrijk op te merken dat andere isobaar tagging reagentia kunnen worden gebruikt in plaats van de isobare reagens dat in dit protocol zoals we eerder hebben aangetoond 14. Om hoge etikettering en tagging efficiency te garanderen, is het belangrijk om de reagentia om monsters snel toe te voegen. Dit zal zorgen voor monsters ongeveer dezelfde reactietijd. Voor kwantitatieve doeleinden, moet elk monster identiek bijzonder vóór bundeling monsters op dimethylering en isobare labeling stappen worden behandeld. Tenslotte zij opgemerkt dat het werken met veel monsters gelijktijdig de eerste stappen requires zorgvuldig gebruiker vaardigheid en aandacht voor de behandeling proeven.
De meest ideale scenario is om reporter ionen te verkrijgen voor elk proteïne in het mengsel in de 12 monsters. Dit is echter niet het geval voor een groot aantal eiwitten. Het aantal peptiden gedetecteerd met kwantificering informatie cPILOT en andere verbeterde multiplexing benaderen afhankelijk van verschillende factoren zoals soort monster monster fractionering en verwerkingsstappen, MS data acquisitiemethoden en instrumenttype. Hoewel zowel dimethylering en tagging isobare trappen een hoge peptide merkingsrendement van ~ 95-99% is er nog ~ 20% van de MS3 gegevens die niet reporter ionen informatie zullen bevatten. Dit is deels te wijten aan het gebruik van trypsine die arginine-eindstandige peptiden die leiden tot geen opname van isobare reagens genereert. Dit kan worden opgelost met andere enzymen, zoals LysC die potentieel afweging in eiwitidentificaties 25. Ook voor zwaredigemethyleerde peptiden, kunnen de voor fragmentatie piek M of M-1 piek die verschillende intensiteit hebben en hebben invloed op de reporter ionintensiteiten waargenomen in de MS3 podium. Zo kunnen er lage intensiteit reporter ionen die niet is waargenomen enkele voorbeelden. Dergelijke situaties worden vaak waargenomen lage intensiteit MS / MS fragmenten die geïsoleerd MS 3 stappen. Een goede oplossing voor dit probleem is opgenomen in tribride massaspectrometers, die, in plaats van één uitsparing selectie voor MS3 gebruikt meervoudige inkeping of meerdere MS / MS fragmenten 26.
Er is veel flexibiliteit in de cPILOT benadering bijzonder met betrekking tot het aantal monsters dat kan worden vergeleken in een enkele analyse (dwz tot 20 commerciële isobare reagentia) en de soorten gebruikte weefsels. We hebben aangetoond dat het gemakkelijk is om nauwkeurige kwantitatieve informatie uit de hersenen, het hart te verkrijgen, enleverweefsel in dezelfde analyse in de context van een ziekte. Deze methode, vergelijkbaar met andere methoden multiplexing, maakt de analyse van meerdere monsters tegelijkertijd en is van toepassing op monsters afkomstig uit cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen. Bovendien cPILOT gelabelde peptiden kunnen worden geanalyseerd met behulp van een laag 24 of hoge resolutie (60.000) instrument. Ter vergelijking, het verkrijgen van succesvolle meting met andere werkwijzen multiplexing kan beperkt zijn tot een specifiek type monster (dat wil zeggen cellen) 18, kan een instrument met een zeer hoge resolutie 20 of de toegang tot stabiele isotooplabels vereisen. cPILOT is ideaal voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in het begrip van ziekten, de ontdekking van biomarkers, als reactie op een geneesmiddel of een therapeutische interventie, of longitudinale veranderingen op diverse tijdstippen. Verder is het voor grote shotgun proteomics analyses van klinische monsters (waarbij N is groot, honderden tot duizenden), cPILOT kan ook geschikt zijn om te helpen experimentele kosten en tijd te verminderen. In de toekomst zullen cPILOT worden uitgebreid tot een groter aantal monsters te multiplexen met bestaande en nieuwe isotopische labels en isobaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de Universiteit van Pittsburgh Start-up fondsen en NIH, NIGMS R01 subsidie (GM 117.191-01) naar RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
