Summary
Kombinert forløper isotopisk merking og isobarisk merking (cPILOT) er en kvantitativ proteomforskning strategi som øker samplings multipleksing av egenskapene til isobariske koder. Denne protokollen beskriver anvendelsen av cPILOT til vev fra en Alzheimers sykdom musemodellen og villtype-kontroller.
Abstract
Det er et økende behov for å analysere mange biologiske prøver for sykdomsforståelse og biomarkører. Kvantitative proteomikk strategier som tillater samtidig måling av flere prøver har blitt utbredt og sterkt redusere eksperimentelle kostnader og tid. Vårt laboratorium utviklet en teknikk som kalles kombinert forløper isotopisk merking og isobarisk merking (cPILOT) som forsterker prøve multipleksing av tradisjonell isotopisk merking eller isobariske merkings tilnærminger. Global cPILOT kan anvendes på prøver som stammer fra celler, vev, kroppsvæsker, eller hele organismer og gir informasjon om relative protein abundances på tvers av forskjellige prøvebetingelser. cPILOT fungerer ved 1) ved bruk av lave pH-buffer-betingelser for selektivt å dimethylate peptid N-termini og 2) ved hjelp av høy pH-buffer-betingelser for å merke av primære aminer med lysinresidiene med kommersielt tilgjengelige isobariske reagenser (se tabell of Materials / reagenser). Graden avPrøven multipleksing tilgjengelig er avhengig av antallet av forløper etiketter som brukes og den isobariske merking reagens. Her presenterer vi en 12-plex analyse ved hjelp av lette og tunge dimetylering kombinert med seks-plex isobariske reagenser for å analysere 12 prøver fra musevev i en enkelt analyse. Forbedret multipleksing er nyttig for å redusere eksperimentelle tid og kostnader, og enda viktigere, å tillate sammenligning av mange prøvebetingelser (biologiske replikater, sykdomstrinn, medikamentbehandlinger, genotyper, eller langsgående gangene) med mindre eksperimentelle skjevhet og feiling. I dette arbeidet, er den globale cPILOT fremgangsmåten som brukes til å analysere hjerne, hjerte, og levervev gjennom biologiske replikater fra en Alzheimers sykdom musemodellen og villtype-kontroller. Global cPILOT kan brukes til å studere andre biologiske prosesser og er innrettet til å øke prøve multipleksing til mer enn 20 prøver.
Introduction
Proteomics innebærer ofte analyse av mange prøver som brukes for å bedre forstå sykdomsprosesser, enzymkinetikk, post-translasjonelle modifikasjoner, respons på miljømessige stimuli, respons til terapeutiske behandlinger, biomarkører, eller medikament mekanismer. Kvantitative metoder kan bli anvendt for å måle relative forskjeller i proteinnivåer på tvers av prøvene og kan være markør-fri eller involvere isotopisk merking (metabolske, kjemisk eller enzymatisk). Stabile isotoper merkingsmetoder har vokst i popularitet fordi de tillater mange prøver som skal analyseres samtidig og er egnet for prøver fra forskjellige celler, vev, kroppsvæsker, eller hele organismer. Isotop merking metoder 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 økning eksperimentelle gjennomstrømning,samtidig redusere innhentingstiden, kostnader, og eksperimentelle feil. Disse metodene brukes forløper masse-spektra for å måle relative forekomster av proteiner fra peptid-topper. I motsetning til dette, isobariske tagging reagenser 8, 9, 10 generere reporter ioner som enten er påvist i MS / MS eller MS 3 11 spektra og disse toppene blir brukt til å rapportere om relative Forekomsten av proteiner.
Den nåværende state-of-the-art i proteomforskning multipleksing er enten en 10-plex 12 eller 12-plex isobarisk tag analyse 13. Forbedret prøve multipleksing (dvs.> 10 prøver) metoder har blitt utviklet av vårt laboratorium for vev 14, 15, 16, 17, og av andre for analyse av celler 18 sup>, 19, 20, 21 vev eller målrettede peptider 22. Vi har utviklet en forbedret multipleksing teknikk som kalles kombinert forløper isotopisk merking med tagging isobarisk (cPILOT). Global cPILOT er nyttig for å få informasjon om de relative konsentrasjoner av alle proteiner på tvers av forskjellige prøvebetingelser (≥12) 14. Figur 1 viser en generell cPILOT arbeidsflyt. Tryptiske eller Lys-C-peptider blir selektivt merkes ved N-enden med dimetylering ved hjelp av lav pH 2 og ved lysinrester med 6-plex-reagenser med høy pH-verdi. Denne strategien dobler antallet prøver som kan analyseres med isobariske reagenser som bidrar til å redusere eksperimentelle kostnader og i tillegg reduserer eksperimentelle trinn og tid.
cPILOT er fleksibel som vi har utviklet andre metoder for å studere oksidativ post-translasjonell modifications, inkludert 3-nitrotyrosine-modifiserte proteiner 14 og cystein-inneholdende peptider med S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. Vi har også utviklet en aminosyre selektiv tilnærming, cystein cPILOT (cyscPILOT) 17. MS 3 anskaffelse med en topp-ion 11 eller selektiv-y 1 -ion metode 15 kan bidra til å redusere reporter ion interferensen og bedre kvantitativ nøyaktighet cPILOT. Bruken av MS 3 i anskaffelse metoden krever en høy oppløsning instrument med en orbitrap masseanalysatoren selv med lav oppløsning ion trap instrumenter kan også fungere 24.
Tidligere cPILOT har blitt brukt til å studere leverproteiner 16 fra en Alzheimers sykdom musemodell. Her beskriver vi hvordan du utfører global cPILOT analyse ved hjelp av hjernen, hjertet og leverhomogenater å studere rollen av perifere produkterry i Alzheimers sykdom. Dette forsøk omfatter biologisk replikasjon. På grunn av allsidigheten cPILOT, kan interesserte brukere bruke teknikken til å studere andre vev for en rekke biologiske problemer og systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Musene ble kjøpt fra en uavhengig, non-profit biomedisinsk forskning institusjon og plassert i Divisjon for Forsøksdyr Resources ved University of Pittsburgh. Alle dyr protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Pittsburgh.
1. Protein Ekstraksjon og Generering av peptider for kjemisk merking
- Ekstrahere proteinet fra vev, celler eller kroppsvæsker.
- Homogen 60-90 mg vev (for eksempel hjerne, hjerte og lever) i fosfatbuffersaltoppløsning (1 x PBS) med 8 M urea (500 mL) ved hjelp av en mekanisk homogenisator. Protease og fosfatase-inhibitorer kan tilsettes til bufferen dersom det er nødvendig. I dette prosjektet ble de ikke brukt. Bruke følgende parametere for homogenisatoren: lyseringsmatrise A kuler, 4 m / s, 20 s. Hjertevevet kan kreve opp til 9 sykluser av homogenisering.
MERK: Protease eller fosfataseinhibitor s kan tilsettes til bufferen dersom det er nødvendig. De ble ikke brukt i denne studien.- Fjerne vev homogenat fra den lyseringsrøret og overføre til et mikro-sentrifugerør. Skyll lysering av rør med 100-500 pl PBS med 8 M urea og kombinere skylleoppløsningen med vev homogenat.
- Sentrifuger homogenisert vev (9447 x g, 4 ° C, 15 min) og samle supernatanten.
- Homogen 60-90 mg vev (for eksempel hjerne, hjerte og lever) i fosfatbuffersaltoppløsning (1 x PBS) med 8 M urea (500 mL) ved hjelp av en mekanisk homogenisator. Protease og fosfatase-inhibitorer kan tilsettes til bufferen dersom det er nødvendig. I dette prosjektet ble de ikke brukt. Bruke følgende parametere for homogenisatoren: lyseringsmatrise A kuler, 4 m / s, 20 s. Hjertevevet kan kreve opp til 9 sykluser av homogenisering.
- Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en bicinchoninic syre (BCA-analyse) i henhold til fabrikantens instruksjoner.
MERK: Ytterligere fortynning med buffer kan være nødvendig hvis proteinkonsentrasjonen er for høy. De resulterende konsentrasjoner for prøver fra disse vevene var mellom 6-13 ug / ul.- Valgfritt: Legg en intern kvalitetskontroll standard (for eksempel kveg a-kasein eller annen eksogent protein) med forholdet 1 ug standard: 100 ug proteinprøven.
- Tilsett 100 pg (100 x 10 -6 g) av protein fra hver prøve til individuelt merket mikro-sentrifugerør. Volumet er avhengig av proteinkonsentrasjonen (se trinn 1.2).
- Legg ditiotreitol (DTT) (40: 1 reagens for å prøve mol-forhold) til hver prøve. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer. Beregningen for det molare forhold er basert av den proteinmasse av bovint serumalbumin (BSA), som er 66,5 x 10 3 g / mol.
- Legg jodacetamid (IAM) (80: 1 reagens for å prøve mol-forhold) til hver prøve. Inkuber på is i mørket i 2 timer. Denne reaksjonen blir utført på is i 2 timer, for å hindre sidereaksjoner.
- Legg L-cystein (40: 1 reagens for å prøve mol-forhold) til hver prøve. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- Tilsett 20 mM Tris-buffer med 10 mM CaCl2 (pH 8,2) for å fortynne urea til en sluttkonsentrasjon på 2 M.
- Legg L-1-tosylamido-2-fenyletyl klormetylketon (TPCK) -behandlet trypsin (50: 1 substrat for enzym mol-forhold) til hver prøve og inkuber ved 37 ° C i 24 timer.
- Slukke proteinfordøyelsen ved flash-frysing av prøven i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C inntil videre bearbeidelse.
3. Prøve Desalting
- Re-surgjør prøvene ved tilsetning av maursyre (FA). Tilsett nok FA for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,1%. Hvis prøvene er opprinnelig ved -80 ° C, tines prøvene på is før fornyet surgjøring.
- De-salt peptidene ved bruk av C-18 hydrofile lipofile balanse (HLB) 10 mg patroner som tidligere beskrevet 16.
- Tørk de prøver ved vakuumsentrifugering (5 torr, 45 ° C, 77 xg) til et volum på ~ 10 mL.
4. dimetylering Merking (N-termini)
- Rekonstituer peptider i 1% eddiksyre (0,25 ug / ul) oppløst i væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) eller nano-ren kvalitet vann. Fjern et 50 μ; G porsjon til en ny mikro-sentrifugerør (1,5 ml) og lagre resten ved -80 ° C.
- Tilsett 8 mL av 60 mM (4%) CH2 (37% vekt / volum) eller 60 mM (4%) 13 CD 2 (20 vekt% v /) til prøvene for merking med lett eller tung dimetylering, henholdsvis O O . Typisk blir 4 pl av reagens tilsatt pr 25 ug av peptider (trinn 4.2, 4.3, 4.6).
- Legg 8 pl av 24 mM NaBH3CN eller 24 mM NaBD 3 CN til de prøver merket med lett eller tung dimetylering, henholdsvis.
- Vortex og riste på en rør-rister i ~ 10 minutter ved romtemperatur.
- Slukke reaksjonen ved tilsetning av 16 ul av 1% ammoniakk (~ 28-30% v / v) i 5 minutter. Vanligvis er 8 ul av reagens tilsatt pr 25 ug av peptider.
- Re-surgjøre reaksjonsblandingen ved tilsetning av 8 ul av 5% FA (98% v / v).
- Kombiner de lette og tunge dimetylert peptider (figur 1) for å generere en total av seks prøver. Se tabell 1
- Utfør prøve avsalting henhold til trinn 3.2 og 3.3.
5. isobarisk merking (Lys-rester)
- Rekonstituer 100 ug av dimetylert peptider (1 pg / pl) i 100 mM tri-etyl-ammonium-bikarbonat (TEAB) buffer (pH ~ 8,5).
- Forbered isobariske reagenser som er angitt i produsentens protokoll (se tabell of Materials / reagenser).
- Legg oppløseliggjorte isobariske reagenser (41 ul) til peptider og vortex i ~ 10 s. Ryst prøvene med et mikro-sentrifugerør-rysteapparat i ~ 1 time. Slukke reaksjonene med 8 ul hydroksylamin (10% w / v) og prøvene inkuberes i 15 min ved romtemperatur.
- Benytte de seks merkede prøver i en enkelt blanding og avsalte (trinnene 3,1-3,3) eller lagre ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
NB: For å forbedre proteom- dekning og dybde, er en flerdimensjonal separasjon strategi slåttslik som sterk kationbytter-(SCX).
6. Sterk kationbyttermateriale
- Utfør SCX som per produsentens protokoll (se Materialer tabell).
- Forbered ~ 1 ml ammoniumformiat løsninger (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, og 500 mM) med 10% acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
- Fjern den røde hetten fra toppen av pipettespissen og trykk på pipettespissen med pakkemasse for å sikre at pakningsmaterialet er mot bunnen av pipettespissen.
MERK: Kritisk: Ikke kast bort pipettespissen til slutten av protokollen. - Plasser sentrifugen adapteret på toppen av et mikro-sentrifugerør (2 ml) og feste pipettespissen innsiden.
- Tilsett 150 ul av SCX rekonstituering buffer til pipettespisser.
- Sentrifuger pipettespissene i 6 minutter ved romtemperatur (4000 x g). Gjenta dette trinnet to ganger og kast avfallet.
- Oppløse peptides i 150 ul SCX rekonstituering buffer. Sørg for at pH er 3.
- Legg peptider til pipettespissene, sentrifuge (se 6.1.5), og holde elueringsmiddel.
- Overfør filteret og pipetten til et nytt mikro-sentrifugerør (2 ml) og tilsett 150 ul av 20 mM ammoniumformiat løsning. Sentrifuger i 6 minutter ved romtemperatur (4000 x g) og holde elueringsmiddel.
- Gjenta trinn 6.1.8 ytterligere syv ganger, ved anvendelse av suksessive konsentrasjoner (dvs. 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM og 500 mM) ammoniumformiat.
- Overfør de åtte SCX fraksjonene til mikro-sentrifugerør (1,5 ml) og konsentrere dem ved hjelp av sentrifugal-fordampning (se trinn 3.3).
7. væskekromatografitandem massespektrometri (LC-MS / MS) og MS 3
- Rekonstituer peptider i massespektrometri klasse vann med 0,1% FA, filter, og plasser i en auto-sampler ampulle. Filter peptider som follstrømmer:
- Legg rekonstituert peptider til et mikro-sentrifugerør inneholdende et 0,65 mikrometer filter (se Materialer tabell).
- Sentrifuger peptider ved 12.000 xg i 1 min. Fjern filter, kast, og legge filtrert peptider inn i en auto-sampler ampulle.
- Fremstill den mobile fase buffere som følger: 3% (v / v) ACN med 0,1% FA (A) og 100% ACN med 0,1% FA (B).
- Injiser 6 ul av hver fraksjon SCX prøve på en kolonne pakket felle til 2 cm med C18 materiale (5 um, 200 Å porestørrelse).
MERK: Prøve rengjøring på fellen er som følger: 3 min, 0% B; 3 ul / min ved anvendelse av en 2D-væskekromatografisystem (se Materialer tabell). - Kjør den analytiske separasjonsmetode. Bruke en 75fim id x 13,2 cm laser uttrukket spiss kapillarkolonne av smeltet silisiumdioksyd pakket med C18-materiale (5 um, 100 A). Gradienten er: 0-5 min, 10% B; 5-40 minutter, 10-15% B; 40-90 minutter, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 minutter, 80% B, 145 til 150 minutter, 80-10% B; 150-180 minutter, 10% B; 300 nL / min, 180 min.
- Kjør datainnsamling for massespektrometeret mens den analytiske separasjonsmetode er i gang.
MERK: Parametrene for MS-undersøkelsen skanningen er som følger: 400-1,600 m / z, 60 000 oppløsning, automatisk forsterkningsregulering (AGC) målrette 1 x 10 6-ioner, maksimal injeksjons tid 500 ms. Parametere for CID-MS / MS er som følger: Topp 1-7 eller 8-14-topp dataavhengig kjøp (DDA), 3 m / z isolasjon bredde, 500 minimalt signal, 35% normalisert kollisjonsenergi (NCE), 0,25 aktivering q , 10 ms aktiveringstid, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maksimum injeksjonstid. Parametere for HCD-MS 3 er som følger: 200 minimumssignal, 4 m / z isolasjon bredde, 60% NCE, 0,1 aktiveringstid, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS utvalg område utelukke un-fragmentert ordnede ion.
8. Dataanalyse 16
- Søk RAW-filer ved hjelp av protein analyse programvare mot en passende database, for eksempel mus Uniprot.
MERK: Det er viktig å skape to arbeidsflyter for hver RAW-fil for å søke etter lette og tunge dimetylerte peptider. - Søk av RAW ved hjelp av følgende parametere: trypsin med to tapte spaltninger, peptid masseområde 300-6,000 Da, 15 ppm hovedmassen toleranse, 1 Da fragmentering toleranse. Statiske modifikasjoner: lys dimetylering (28,031, peptid N-terminal) eller heavy dimetylering (36,076 Da, peptid N-terminale enden), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
MERK: Noen ganger den tunge dimetylert topp er ~ 7 Da (35,069 Da, peptid N-terminal) er fra lyset dimetylert topp og således bør innarbeides i søke arbeidsflyten for tunge dimetylerte peptider. Dynamiske modifikasjoner: oksydasjon (15,995 Da, M), 6-plex isobarisk tag (229,163 Da, K). Omfatte et lokkefugl databasesøk kunne føre til falske funnrate (for eksempel 1 og 5%) og en kvantifisering node for å søke etter rapportør ioneintensitetene av isobariske koder. - Statistikk
- Eksport data til en elektronisk regnearkprogram for å normalisere protein rapportør ion-verdier. For hvert protein, dele enten medianrapportør ione-forhold, eller rå rapportør ioneintensitetene ved medianen forholdet mellom den interne standard eller rå reporter ioneintensitetene av den indre standarden, henholdsvis. Bruk riktig statistisk programvare som elektronisk regnearkprogram, Perseus, eller R for å bestemme signifikante endringer blant prøvebetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
cPILOT bruker aminbaserte kjemien til kjemisk etikett peptidene i N-terminus og lysin-rester og forbedrer prøve multipleksings-evner. Figur 2 viser representative MS-data som er oppnådd fra en 12-plex cPILOT analyse av hjerne, hjerte, og levervev fra en Alzheimers sykdom musemodellen og villtype-kontroller. Som vist i tabell 1, er to biologiske replikater for Alzheimers sykdom og villtype-mus som inngår i denne 12-plex-analyse. Figur 2A viser en dobbelt-ladet topp-par som er adskilt ved m / z avstand på 4 indikerer en enkelt dimetyl gruppe ble inkorporert i peptidet. Både den lette og tunge dimetylerte toppene i dette paret er uavhengig isolert og fragmentert med CID. MS / MS-data for hver av dimetylert peptidene er vist i figurene 2B og C. Søkeresultater tyder dette pair av topper representerer T (dimetyl) ELNYFAK (isobar-tag 6) peptid av proteinet fosfoglyceratkinase 1. Den mest intense fragment ion er y 3 + som er lik for både de lette og tunge dimetylerte topper. Disse toppene er isolert ytterligere for HCD-MS 3 og rapportørioner (m / z 126-131) er observert som vist på figurene 2D og 2E. Begge settene med MS 3 spektra er nødvendig for å få informasjon om de 12 prøvene. I dette eksempel er rapportør ion forhold (AD / WT) (Alzheimers sykdom / Villtype-kontroll) i hjerne, lever, hjerte og vev er lik på tvers av de to biologiske replikater. Antall gangers endring verdier for hver sammenligning tyder på at fosfoglyceratkinase 1-nivåer i hjerne og hjerte er høyere i AD mus, mens i leveren nivåene er lavere.
Figure 1: Proteomikk arbeidsflyten ved hjelp cPILOT. Som et eksempel, skisserer denne arbeidsflyten analyse av 12 individuelle prøver. Proteiner fra vevene, cellene eller kroppsvæsker ekstraheres og en passende proteinstandard (for eksempel kveg a-kasein) tilsettes. Proteiner nedbrytes ved hjelp av trypsin. Peptider er merket ved N-terminusen ved anvendelse av lett eller tung dimetylering (pH ~ 2,5) og på lysinrester ved anvendelse av TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Merkede peptider ble slått sammen i en enkelt blanding og utsatt for SCX-RP LC-MS / MS og MS tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel cPILOT data av peptider fra hjerne, hjerte, lever og vev av en Alzheimers sykdom musemodellen og villtype-kontroller. (A) viser lette og tunge dimetylert peptider, representert ved de topper ved m / z 643,854 og 647,875. Disse peptider ble valgt, isolert og fragmentert, og dermed generere CID-MS / MS-spektra (B og C), som ga peptid identifikasjon. En ytterligere markering, isolasjon, og fragmentering av den mest intense fragment ion av de lette og tunge dimetylerte peptider ved MS / MS-trinnet genereres HCD-MS 3-spektra (D og E), henholdsvis. Peptidsekvensen er T (dimetyl) ELNYFAK (isobar-tag 6) og representerer fosfoglyceratkinase 1. Trykk her for å vise en større versjon av denne figur.
| isobarisk Reagens0; | ||||||
| 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | |
| lys dimetylering | WT en | AD b | WT | AD | WT | AD |
| hjerne | hjerte | lever | ||||
| Heavy dimetylering | WT | AD | WT | AD | WT | AD |
| hjerte | lever | hjerne | ||||
| Vevet er enten fra en villtype kontroll (WT) en eller Alzheimers sykdom mus (AD) b. | ||||||
Tabell 1: cPILOT gruppering av AD og WT hjerne, hjerte, og levervev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cPILOT tillater samtidig måling av mer enn 12 unike prøver. For å sikre en vellykket merking på både N-terminale og lysinrester av peptider, er det viktig å ha den riktige pH-verdi for hvert sett av reaksjoner og for å utføre den dimetylering reaksjonen først for peptid merking. Selektiv dimetylering ved den N-terminale enden blir utført ved å ha en pH-verdi på ~ 2,5 (± 0,2). Dette oppnås ved å utnytte forskjellene på pKa-verdier for de aminogruppene på lysin og N-terminalen. Ved pH 2,5, er lysin inaktiv (pKa 10,5); Hvis imidlertid pH-verdien er svakt sur (dvs. pH 5-7) eller basisk, både den N-terminale ender og lysinrester vil bli dimetylert. I tillegg, hvis isobarisk merking er utført først ved en lav pH-verdi, vil den N-terminale ender har den isobariske etiketten og lysinrester vil bli dimetylert. Dette kan resultere i mindre fragmenter som blir valgt for MS 3 som b-ioner ville trenge å bli valgt. De relative kostnader av dimetylasjon reaksjoner er billig sammenlignet med de kommersielle isobariske reagenser. Mens man kan bruke en hel isobarisk reagens per 100 ug, har vi også hatt suksess ved anvendelse av halvparten av reagens per 100 ug med sammenlignbar effektivitet merking. Dette bidrar til å redusere kostnadene for enkelte cPILOT eksperimenter betydelig og gjør at flere prøver som skal analyseres. Det er også viktig å merke seg at andre isobariske tagging reagenser kan brukes i stedet for isobarisk reagens brukt i denne protokollen som vi tidligere har vist 14. For å sikre høy merking og merkingseffektivitet, er det viktig å tilsette reagenser til prøvene raskt. Dette vil tillate prøver å ha omtrent samme reaksjonstid. For kvantitative formål, bør hver prøve behandles identisk spesielt før pooling eksempler på dimetylering og isobariske merking trinn. Til slutt bør det legges merke til at det å arbeide med mange prøver samtidig i de første trinnene requires forsiktig bruker dyktighet og oppmerksomhet for å prøve håndtering.
Den mest ideelle scenariet er å få reporter ioner for hvert protein i blandingen over de 12 prøvene. Dette er imidlertid ikke tilfelle for et stort antall proteiner. Antallet peptider detektert med mengdeinformasjon for cPILOT og andre forbedrede multipleksing nærmer seg, avhenger av flere faktorer, inkludert prøvetype, prøvefraksjonering og behandlingstrinn, MS-data innhentingsmetoder, og instrumenttype. Selv om både dimetylering og isobariske merkingsfremgangsmåten har en høy peptid merking virkningsgrad på ~ 95-99%, er det fremdeles ~ 20% av det MS 3 data som ikke skal inneholde reporter ion informasjon. Dette skyldes delvis ved hjelp av trypsin som genererer arginin-terminerte peptider som resulterer i ikke inkorporering av isobarisk reagens. Dette kan løses ved å bruke andre enzymer, så som Lyse, med en potensiell avveining i protein identifikasjoner 25. Også for tungdimetylerte peptider, kan det velges for fragmentering topp er M- eller M-1 topp, som har forskjellige intensiteter og påvirker rapportør ioneintensitetene observert i MS tre trinn. Således kan det foreligge noen lav intensitet rapportør ioner som ikke oppdages for noen prøver. Slike situasjoner er ofte observeres ofte for lav intensitet MS / MS-fragmenter som er isolert for MS 3 trinn. En god løsning på dette problemet har blitt innarbeidet i tribrid massespektrometre, som i stedet for å anvende en-lyd utvalg for MS 3, bruker flere hakk eller flere MS / MS-fragmenter 26.
Det er mange av allsidighet ved cPILOT tilnærming, spesielt med hensyn til det antall prøver som kan sammenlignes i en enkelt analyse (dvs. opp til 20 med kommersielle isobariske reagenser), og de typer av vev som ble brukt. Vi viste at det er lett å få nøyaktig kvantitativ informasjon fra hjerne, hjerte, oglevervev i den samme analysen i sammenheng med en sykdom. Denne metoden, på samme måte som andre multipleksing av metoder, gjør det mulig for analyse av flere prøver på en gang, og er anvendelig for å prøver som stammer fra celler, vev, kroppsvæsker, eller hele organismer. I tillegg cPILOT merkede peptider som er i stand til å bli analysert ved bruk av enten en lav eller 24 høy oppløsning (60.000) instrument. Til sammenligning oppnå vellykket måling ved hjelp av andre multipleksing av metodene kan være begrenset til en spesifikk type av prøven (dvs. celler) 18, kan kreve et instrument med meget høy oppløsning 20, eller adgang til stabile isotopen etiketter. cPILOT er stor for brukere som er interessert i å forstå sykdom, biomarkører, respons til et medikament eller terapeutisk intervensjon, eller langsgående endringer over mange tidspunkter. Videre for store hagle proteomikk analyser av kliniske prøver (der N er stor, hundrevis til tusenvis), cPILOT kan også være egnet til å bidra til å redusere eksperimentelle kostnader og tid. I fremtiden vil cPILOT utvides til å multiplekse et større antall prøver ved anvendelse av eksisterende og nye isotopisk og isobariske etiketter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner University of Pittsburgh oppstart Funds og NIH, NIGMS R01 stipend (GM 117191-01) til RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | - | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | - | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient |
References
- Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
