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Biochemistry

बढ़ी नमूना संयुक्त पूर्वगामी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग का उपयोग ऊतकों की Multiplexing (cPILOT)

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55406
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

Summary

संयुक्त अग्रदूत समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग (cPILOT) एक मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स रणनीति है कि समदाब रेखीय टैग की नमूना बहुसंकेतन क्षमताओं को बढ़ाता है है। यह प्रोटोकॉल एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल और जंगली प्रकार नियंत्रण से ऊतकों को cPILOT के आवेदन का वर्णन है।

Abstract

वहाँ एक बढ़ती मांग बीमारी समझ और बायोमार्कर की खोज के लिए कई जैविक नमूनों का विश्लेषण किया जा सके। मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स रणनीतियों कि कई नमूनों के एक साथ माप व्यापक हो गया है और बहुत प्रयोगात्मक लागत और समय को कम करने की अनुमति है। हमारी प्रयोगशाला एक तकनीक संयुक्त अग्रदूत समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग (cPILOT) कहा जाता है, जो परंपरागत समस्थानिक लेबलिंग या समदाब रेखीय टैगिंग तरीकों में से नमूना बहुसंकेतन को बढ़ाता है विकसित की है। वैश्विक cPILOT कोशिकाओं, ऊतकों, शरीर के तरल पदार्थ, या पूरे जीवों से होने वाले नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न नमूना स्थिति भर सापेक्ष प्रोटीन प्रचुरता के बारे में जानकारी देता है। cPILOT 1 से काम करता है) कम पीएच बफर शर्तों का उपयोग चुनिंदा dimethylate पेप्टाइड एन टर्मिनी और 2) उच्च पीएच बफर शर्तों का उपयोग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध समदाब रेखीय अभिकर्मकों के साथ लाइसिन अवशेषों के प्राथमिक amines लेबल करने के लिए (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)। की उपाधिनमूना बहुसंकेतन उपलब्ध इस्तेमाल किया अग्रदूत लेबल की संख्या और समदाब रेखीय टैगिंग अभिकर्मक पर निर्भर है। यहाँ, हम प्रकाश और भारी dimethylation छह plex समदाब रेखीय अभिकर्मकों के साथ संयुक्त रूप से एक विश्लेषण में माउस ऊतकों से 12 नमूनों का विश्लेषण करने के लिए का उपयोग कर एक 12 plex विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं। बढ़ी बहुसंकेतन कम प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह और त्रुटि के साथ, प्रयोगात्मक समय और लागत को कम करने और अधिक महत्वपूर्ण कई नमूना की स्थिति (जैविक प्रतिकृति, रोग चरण, नशीली दवाओं के उपचार, जीनोटाइप, या अनुदैर्ध्य समय-अंक) भर में तुलना करने के लिए उपयोगी है। इस काम में, वैश्विक cPILOT दृष्टिकोण एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल और जंगली प्रकार नियंत्रण से मस्तिष्क, हृदय, और जैविक प्रतिकृति भर में जिगर के ऊतकों का विश्लेषण किया जाता है। वैश्विक cPILOT अन्य जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है और अधिक से अधिक 20 से नमूने के लिए नमूना बहुसंकेतन बढ़ाने के लिए अनुकूलित।

Introduction

प्रोटिओमिक्स अक्सर कई बेहतर रोग प्रक्रियाओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया नमूने, एंजाइम गतिकी, बाद translational संशोधनों, पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब, चिकित्सीय उपचार, बायोमार्कर की खोज, या दवा तंत्र के जवाब का विश्लेषण शामिल है। मात्रात्मक पद्धतियों के नमूने भर में प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार मतभेद को मापने और लेबल से मुक्त किया जा सकता है या समस्थानिक लेबलिंग (चयापचय, रसायन, या एंजाइमी) को शामिल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तरीकों लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, क्योंकि वे कई नमूने एक साथ विश्लेषण करने की अनुमति देते हैं और विभिन्न कोशिकाओं, ऊतकों, शरीर के तरल पदार्थ, या पूरे जीवों से नमूने लिए उपयुक्त हैं। आइसोटोप लेबलिंग तरीकों 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 वृद्धि प्रयोगात्मक throughput,जबकि अधिग्रहण समय, लागत, और प्रयोगात्मक त्रुटि को कम करने। इन विधियों अग्रदूत जन स्पेक्ट्रा का उपयोग पेप्टाइड चोटियों से प्रोटीन के रिश्तेदार abundances को मापने के लिए। इसके विपरीत, समदाब रेखीय टैगिंग अभिकर्मकों 8, 9, 10 रिपोर्टर आयनों है कि या तो एमएस / एमएस या एमएस में पाया जाता है उत्पन्न 3 11 स्पेक्ट्रा और इन चोटियों प्रोटीन के रिश्तेदार abundances पर रिपोर्ट किया जाता है।

वर्तमान प्रोटिओमिक्स बहुसंकेतन में राज्य के अत्याधुनिक या तो एक 10 plex 12 या 12-plex समदाब रेखीय टैग विश्लेषण 13 है। बढ़ी नमूना बहुसंकेतन (यानी> 10 नमूने) तरीकों हमारे प्रयोगशाला द्वारा ऊतकों 14, 15, 16, 17 के लिए कोशिकाओं 18 के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, और दूसरों के द्वारा sup>, 19, 20, 21, या लक्षित पेप्टाइड्स 22 ऊतकों। हम समदाब रेखीय टैगिंग (cPILOT) के साथ संयुक्त अग्रदूत समस्थानिक लेबलिंग नामक एक बढ़ाया बहुसंकेतन तकनीक विकसित की है। वैश्विक cPILOT विभिन्न नमूना की स्थिति (≥12) 14 के पार सभी प्रोटीन के रिश्तेदार सांद्रता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोगी है। चित्रा 1 एक सामान्य cPILOT कार्यप्रवाह को दर्शाता है। Tryptic या लिस-सी पेप्टाइड्स चुनिंदा कम पीएच 2 का उपयोग dimethylation साथ N- टर्मिनस पर और उच्च पीएच का उपयोग कर 6-plex अभिकर्मकों के साथ लाइसिन अवशेषों पर लेबल रहे हैं। इस रणनीति डबल्स के नमूने है कि समदाब रेखीय अभिकर्मकों प्रयोगात्मक लागत और इसके अलावा कम करने में मदद जिसके साथ विश्लेषण किया जा सकता की संख्या, प्रयोगात्मक कदम और समय कम कर देता है।

cPILOT लचीला है के रूप में हम ऑक्सीडेटिव बाद अनुवादकीय मोदी अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों का विकास किया हैfications, 3-nitrotyrosine संशोधित प्रोटीन 14 और एस nitrosylation (oxcyscPILOT) 23 के साथ सिस्टीन युक्त पेप्टाइड सहित। हम यह भी एक अमीनो अम्ल चयनात्मक दृष्टिकोण, सिस्टीन cPILOT (cyscPILOT) 17 विकसित किया है। एक शीर्ष आयन 11 या चुनिंदा-y 1-आयन विधि 15 के साथ एमएस 3 अधिग्रहण में मदद कर सकते संवाददाता आयन हस्तक्षेप को कम करने और cPILOT की मात्रात्मक सटीकता में सुधार। अधिग्रहण विधि में एमएस 3 का उपयोग एक Orbitrap जन विश्लेषक के साथ एक उच्च संकल्प विधि की आवश्यकता होती है, हालांकि कम संकल्प आयन जाल वाद्ययंत्रों को भी 24 काम कर सकते हैं।

इससे पहले, cPILOT एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल से जिगर प्रोटीन 16 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम कैसे periphe की भूमिका का अध्ययन करने के मस्तिष्क, हृदय, और जिगर homogenates का उपयोग कर वैश्विक cPILOT विश्लेषण करने के लिए का वर्णनअल्जाइमर रोग में ry। इस प्रयोग जैविक प्रतिकृति को शामिल किया गया। cPILOT की बहुमुखी प्रतिभा की वजह से, इच्छुक उपयोगकर्ताओं जैविक समस्याओं और सिस्टम की एक श्रृंखला के लिए अन्य ऊतकों का अध्ययन करने के तकनीक का उपयोग कर सकते हैं।

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Protocol

आचार कथन: चूहे एक स्वतंत्र, गैर लाभ जैव चिकित्सा अनुसंधान संस्थान से खरीदा है और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन विभाग में रखे गए थे। सभी पशु प्रोटोकॉल पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. प्रोटीन निष्कर्षण और पेप्टाइड्स की पीढ़ी रासायनिक-टैगिंग के लिए

  1. ऊतक, कोशिकाओं, या शरीर के तरल पदार्थ से प्रोटीन निकालें।
    1. 8 एम यूरिया (500 μL) एक यांत्रिक homogenizer का उपयोग कर के साथ फॉस्फेट बफर खारा में ऊतक (जैसे मस्तिष्क, हृदय, और जिगर) (1x पीबीएस) की 60-90 मिलीग्राम homogenize। प्रोटीज या फॉस्फेट अवरोधकों यदि आवश्यक हो तो बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है। इस परियोजना में, वे इस्तेमाल नहीं किया गया। homogenizer के लिए निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: मैट्रिक्स A मोती, 4 m / s, 20 रों lysing। हृदय के ऊतकों एकरूपता की अधिकतम 9 चक्र की आवश्यकता हो सकती।
      नोट: प्रोटीज या फॉस्फेट अवरोध करनेवाला रों यदि आवश्यक हो तो बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है। वे इस अध्ययन में इस्तेमाल नहीं कर रहे थे।
      1. lysing ट्यूब से ऊतक homogenate निकालें और एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। 8 एम यूरिया के साथ पीबीएस के 100-500 μL के साथ ट्यूब lysing कुल्ला और ऊतक homogenate साथ कुल्ला समाधान गठबंधन।
    2. homogenized ऊतकों अपकेंद्रित्र (9447 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    नोट: बफर के साथ आगे कमजोर पड़ने आवश्यक हो सकता है अगर प्रोटीन एकाग्रता बहुत अधिक है। इन ऊतकों के नमूनों के लिए जिसके परिणामस्वरूप सांद्रता 6-13 माइक्रोग्राम / μL के बीच में थे।
    1. वैकल्पिक: एक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण मानक (जैसे गोजातीय अल्फा कैसिइन या अन्य एक्सोजेनस प्रोटीन) अनुपात 1 माइक्रोग्राम प्रति मानक के साथ जोड़ें: 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन नमूना।
jove_title "> 2। नमूना पाचन

  1. प्रत्येक नमूने से प्रोटीन की 100 माइक्रोग्राम (100 x 10 -6 छ) जोड़े को व्यक्तिगत रूप से सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब लेबल करने के लिए। मात्रा प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर है (कदम 1.2 देखें)।
  2. (: 1 अभिकर्मक मोल अनुपात नमूने के लिए 40) प्रत्येक नमूने के लिए dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। दाढ़ अनुपात के लिए गणना गोजातीय सीरम albumin प्रोटीन द्रव्यमान (बीएसए) है, जो 66.5 x 10 3 जी / मोल है पर आधारित है।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए: (मोल अनुपात नमूने के लिए 1 अभिकर्मक 80) iodoacetamide (IAM) जोड़ें। 2 घंटे के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं। यह प्रतिक्रिया 2 घंटे पक्ष प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए बर्फ पर किया जाता है।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए: (1 अभिकर्मक मोल अनुपात नमूने के लिए 40) एल सिस्टीन जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. 2 एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए यूरिया को कमजोर करने के लिए 10 मिमी 2 CaCl (पीएच 8.2) के साथ 20 मिमी Tris बफर जोड़ें
  6. जोड़े एल -1-tosylamido -2 phenylethyl chloromethyl कीटोन (TPCK) -treated ट्रिप्सिन (50: 1 सब्सट्रेट प्रत्येक नमूने के लिए मोल अनुपात एंजाइम के लिए) और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. फ्लैश ठंड आगे की प्रक्रिया जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में नमूना द्वारा प्रोटीन पाचन बुझाने।

3. नमूना Desalting

  1. चींटी एसिड (एफए) जोड़कर नमूने फिर से खटास लाना। पर्याप्त एफए 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें। नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर मूल रूप से कर रहे हैं, पहले उसे फिर से अम्लीकरण बर्फ पर नमूने पिघलना।
  2. डी-नमक पहले से के रूप में सी 18 हाइड्रोफिलिक lipophilic संतुलित (HLB) 10 मिलीग्राम कारतूस का उपयोग कर पेप्टाइड्स 16 का वर्णन किया।
  3. ~ 10 μL की मात्रा को वैक्यूम centrifugation (5 Torr, 45 डिग्री सेल्सियस, 77 XG) द्वारा नमूने सुखाएं।

4. Dimethylation लेबलिंग (एन टर्मिनी)

  1. 1% एसिटिक एसिड में पेप्टाइड्स (0.25 माइक्रोग्राम / μL) उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) या नैनो शुद्ध ग्रेड पानी में घोल कर Reconstitute। एक 50 μ निकालें; एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब (1.5 एमएल) के लिए छ भाग और -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष की दुकान।
  2. 8 2 हे (37% wt / v) या 2 (20% wt / v) क्रमश: 60 मिमी (4%) सीएच की μL 60 मिमी (4%) 13 सीडी हे प्रकाश या भारी dimethylation, साथ लेबलिंग के लिए नमूने में जोड़े । आमतौर पर, अभिकर्मक के 4 μL प्रति 25 माइक्रोग्राम पेप्टाइड्स के (कदम 4.2, 4.3, 4.6) जोड़ा गया है।
  3. 24 मिमी NaBH 3 सीएन या 24 मिमी NaBD 3 सीएन 8 μL नमूने प्रकाश या भारी dimethylation क्रमश: के साथ लेबल में जोड़े।
  4. भंवर और कमरे के तापमान पर ~ 10 मिनट के लिए एक ट्यूब शेकर पर हिला।
  5. 5 मिनट के लिए 1% अमोनिया (~ 28-30% v / v) के 16 μL जोड़कर प्रतिक्रियाओं बुझाने। आमतौर पर, अभिकर्मक के 8 μL प्रति पेप्टाइड्स के 25 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ा जाता है।
  6. फिर से खटास लाना 5% एफए के 8 μL जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण (98% v / v)।
  7. प्रकाश और भारी dimethylated पेप्टाइड्स (चित्रा 1) गठबंधन छह नमूनों की कुल उत्पन्न करने के लिए। तालिका 1 देखें
  8. चरणों 3.2 और 3.3 के अनुसार नमूना desalting निष्पादित करें।

5. समदाब रेखीय टैगिंग (लिस अवशेषों)

  1. 100 मिमी त्रिकोणीय एथिल अमोनियम बाइकार्बोनेट (TEAB) बफर (पीएच ~ 8.5) में dimethylated पेप्टाइड्स के 100 माइक्रोग्राम (1 माइक्रोग्राम / μL) Reconstitute।
  2. समदाब रेखीय अभिकर्मकों के रूप में निर्माता के प्रोटोकॉल में कहा गया है तैयार (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)।
  3. पेप्टाइड और भंवर के लिए solubilized समदाब रेखीय अभिकर्मकों (41 μL) के लिए ~ 10 रों जोड़ें। ~ 1 घंटे के लिए एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब शेकर पर नमूने हिलाएँ। 8 μL hydroxylamine (10% w / v) और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते के साथ प्रतिक्रियाओं बुझाने।
  4. एक भी मिश्रण और फीका बनाना (कदम 3.1-3.3) या दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर आगे उपयोग तक में छह लेबल नमूने पूल।
    नोट: proteome कवरेज और गहराई में सुधार के लिए, एक बहु-आयामी जुदाई रणनीति का सुझाव दिया हैइस तरह के रूप में मजबूत कटियन विनिमय (SCX)।

6. मजबूत कटियन विनिमय

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार SCX प्रदर्शन (देखें सामग्री तालिका)।
    1. अमोनियम वह स्वरूप समाधान के ~ 1 एमएल (20 मिमी, 40 मिमी, 60 मिमी, 80 मिमी, 100 मिमी, 150 मिमी, 250 मिमी, और 500 मिमी) 10% acetonitrile (ACN), 0.1% एफए (पीएच 3) के साथ तैयार करें।
    2. विंदुक टिप के ऊपर से लाल टोपी निकालें और गारा पैकिंग सुनिश्चित करना है कि पैकिंग सामग्री विंदुक टिप के नीचे की ओर है के साथ विंदुक टिप टैप करें।
      नोट: महत्वपूर्ण: प्रोटोकॉल के अंत तक विंदुक टिप हटाने की ज़रूरत नहीं।
    3. एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब (2 एमएल) के शीर्ष पर अपकेंद्रित्र एडाप्टर रखें और अंदर विंदुक टिप सुरक्षित है।
    4. SCX पुनर्गठन बफर के 150 μL विंदुक युक्तियाँ में जोड़े।
    5. कमरे के तापमान (4000 XG) पर 6 मिनट के लिए विंदुक युक्तियाँ अपकेंद्रित्र। इस कदम दो बार दोहराएँ और अपशिष्ट त्यागें।
    6. पी भंगSCX पुनर्गठन बफर के 150 μL में eptides। सुनिश्चित करें कि पीएच 3 है।
    7. विंदुक युक्तियाँ, अपकेंद्रित्र (6.1.5 देखें) पेप्टाइड्स जोड़ें, और eluent रहते हैं।
    8. एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब (2 एमएल) के लिए फिल्टर और पिपेट स्थानांतरण और 20 मिमी अमोनियम वह स्वरूप समाधान के 150 μL जोड़ें। कमरे के तापमान (4000 XG) पर 6 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और eluent रहते हैं।
    9. दोहराएँ कदम 6.1.8 एक अतिरिक्त सात बार, अमोनियम वह स्वरूप की लगातार सांद्रता (यानी 40 मिमी, 60 मिमी, 80 मिमी, 100 मिमी, 150 मिमी, 250 मिमी और 500 मिमी) का उपयोग कर।
  2. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब (1.5 एमएल) के लिए आठ SCX अंशों स्थानांतरण और उन्हें केन्द्रापसारक वाष्पीकरण का उपयोग करके ध्यान केंद्रित (कदम 3.3 देखें)।

7. तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-एमएस / एमएस) और एमएस 3

  1. 0.1% एफए, फिल्टर के साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड पानी में पेप्टाइड्स Reconstitute, और एक स्वत: नमूना शीशी में रख दें। foll के रूप में फ़िल्टर पेप्टाइड्सows:
    1. एक 0.65 सुक्ष्ममापी फिल्टर युक्त एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब को पुनर्गठित पेप्टाइड्स जोड़े (देखें सामग्री तालिका)।
    2. 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र पेप्टाइड्स। , फ़िल्टर निकालें त्यागें, और एक स्वत: नमूना शीशी में फ़िल्टर पेप्टाइड्स जोड़ें।
  2. 0.1% एफए (बी) के साथ 3% (v / v) 0.1% एफए (ए) के साथ ACN और 100% ACN: इस प्रकार मोबाइल चरण बफ़र्स तैयार करें।
  3. एक जाल स्तंभ सी 18 सामग्री (5 सुक्ष्ममापी, 200 छेद के आकार) के साथ 2 सेमी पैक पर प्रत्येक SCX अंश नमूने के 6 μL इंजेक्षन।
    नोट: जाल पर नमूना सफाई इस प्रकार है: 3 मिनट, 0% बी; 3 μL / मिनट एक 2D तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर (देखें सामग्री तालिका)।
  4. विश्लेषणात्मक जुदाई विधि चलाएँ। एक 75 सुक्ष्ममापी आईडी एक्स 13.2 सेमी लेजर खींच लिया की नोक जुड़े सिलिका केशिका स्तंभ सी 18 सामग्री के साथ पैक (5 सुक्ष्ममापी, 100 ए) का प्रयोग करें। ढाल है: 0-5 मिनट, 10% बी; 5-40 मिनट, 10-15% बी; 40-90 मिनट, 15-25% बी; 90-115 मिनट, 25-30% बी; 115-130 मिनट, 30-60% बी; 130-135 मिनट, 60-80% बी; 135-145 मिनट, 80% बी, 145-150 मिनट, 80-10% बी; 150-180 मिनट, 10% बी; 300 nl / मिनट, 180 मिनट।
  5. जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए डाटा अधिग्रहण भागो, जबकि विश्लेषणात्मक जुदाई विधि चल रहा है।
    नोट: 400-1,600 मीटर / z, 60,000 संकल्प, स्वत: लाभ नियंत्रण (AGC) 1 x 10 6 आयनों, अधिकतम इंजेक्शन समय 500 एमएस को लक्ष्य: एमएस सर्वेक्षण स्कैन के लिए मानकों को इस प्रकार हैं। सीआईडी-एमएस / एमएस के लिए पैरामीटर इस प्रकार हैं: शीर्ष 1-7 या शीर्ष 8-14 डेटा निर्भर अधिग्रहण (डीडीए), 3 मीटर / z अलगाव चौड़ाई, 500 न्यूनतम संकेत, 35% सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा (एनसीई), 0.25 सक्रियण क्ष 10 एमएस सक्रियण समय, 3 x 10 4 एजीसी, 50 एमएस अधिकतम इंजेक्शन समय। HCD-एमएस 3 के लिए पैरामीटर इस प्रकार हैं: 200 न्यूनतम संकेत, 4 मीटर / z अलगाव चौड़ाई, 60% एनसीई, 0.1 सक्रियण समय, 3 x 10 5 एजीसी, 250 एमएस आईटी, 300-1,300 मीटर / z एमएस / एमएस चयन रेंज , को बाहर अन-खंडित माता पिता आयन।
    6. नोट: नमूने एक Orbitrap या एक tribrid जन स्पेक्ट्रोमीटर युक्त एक साधन के एक नए मॉडल पर चलाने के लिए, डीडीए मापदंडों अलग अलग होंगे और अधिक एमएस / एमएस और एमएस 3 स्कैन शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। साथ ही, tribrid उपकरणों के लिए, तुल्यकालिक अग्रदूत चयन (एसपीएस) एमएस 3 नियोजित किया जाना चाहिए।

8. डेटा विश्लेषण 16

  1. इस तरह के माउस Uniprot के रूप में एक उचित डेटाबेस, के खिलाफ प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर RAW फ़ाइलें खोजें।
    नोट: यह आदेश प्रकाश और भारी dimethylated पेप्टाइड्स के लिए खोज करने के लिए प्रत्येक रॉ फ़ाइल के लिए दो वर्कफ़्लो बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर RAW फ़ाइलें खोज: दो चोली याद किया, पेप्टाइड जन रेंज 300-6,000 दा, 15 पीपीएम माता-पिता बड़े पैमाने पर सहिष्णुता, 1 दा विखंडन सहिष्णुता के साथ trypsin। स्टेटिक संशोधनों: प्रकाश dimethylation (28.031, पेप्टाइड N- टर्मिनस) या जeavy dimethylation (36.076 दा, पेप्टाइड N- टर्मिनस), carbamidomethyl (57.021 दा, सी)।
    नोट: कभी-कभी भारी dimethylated चोटी है ~ 7 दा (35.069 दा, पेप्टाइड N- टर्मिनस) प्रकाश dimethylated चोटी से है और इस तरह खोज भारी dimethylated पेप्टाइड्स के लिए कार्यप्रवाह में शामिल किया जाना चाहिए। गतिशील संशोधन: ऑक्सीकरण (15.995 दा, एम), 6-plex समदाब रेखीय टैग (229.163 दा, कश्मीर)। एक प्रलोभन डेटाबेस खोज झूठी खोज दरों उपज के लिए (उदाहरण के लिए 1 और 5%) और समदाब रेखीय टैग की रिपोर्टर आयन तीव्रता के लिए खोज करने के लिए एक quantitation नोड को शामिल करें।
  3. आंकड़े
    1. क्रम में एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में निर्यात डेटा प्रोटीन संवाददाता आयन मूल्यों को सामान्य बनाने में। प्रत्येक प्रोटीन के लिए, आंतरिक मानक या आंतरिक मानक के कच्चे संवाददाता आयन तीव्रता की औसत अनुपात से या तो मंझला संवाददाता आयन अनुपात या कच्चे संवाददाता आयन तीव्रता को विभाजित क्रमशः। इस तरह के एक इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट प्रोग्राम, कार्मिक के रूप में उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का प्रयोग करेंeus, या आर नमूना की स्थिति के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तन निर्धारित करते हैं।

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Representative Results

cPILOT N- टर्मिनस और लाइसिन अवशेषों पर लेबल पेप्टाइड्स लिए रासायनिक को अमाइन आधारित रसायन शास्त्र का उपयोग करता है और नमूना बहुसंकेतन क्षमताओं को बढ़ाता है। चित्रा 2 प्रतिनिधि एमएस डेटा है कि एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल और जंगली प्रकार नियंत्रण से मस्तिष्क, हृदय, जिगर और ऊतकों की एक 12 plex cPILOT विश्लेषण से प्राप्त होता है पता चलता है। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, अल्जाइमर रोग और जंगली प्रकार चूहों के लिए दो जैविक प्रतिकृति इस 12-plex विश्लेषण में शामिल हैं। चित्रा 2A एक दोगुना चार्ज शिखर जोड़ी है कि 4 के मीटर / z रिक्ति एक भी डाइमिथाइल समूह का संकेत पेप्टाइड में शामिल किया गया से अलग किया जाता दर्शाता है। दोनों प्रकाश और इस जोड़ी में भारी dimethylated चोटियों स्वतंत्र रूप से अलग-थलग और सीआईडी ​​के साथ खंडित कर रहे हैं। Dimethylated पेप्टाइड्स से प्रत्येक के लिए एमएस / एमएस डेटा आंकड़े 2 बी और सी में दिखाया गया है। खोज परिणाम इस pai से संकेत मिलता हैचोटियों के आर टी (डाइमिथाइल) ELNYFAK (समदाब रेखीय टैग 6) प्रोटीन phosphoglycerate kinase 1. सबसे तीव्र टुकड़ा आयन y है 3+ जो दोनों प्रकाश और भारी dimethylated चोटियों के लिए इसी तरह की है की पेप्टाइड के अंतर्गत आता है। इन चोटियों HCD-एमएस 3 के लिए आगे अलग हो जाती हैं और के रूप में आंकड़े 2 डी और 2 ई में दिखाया गया रिपोर्टर आयनों (मी / z 126-131) मनाया जाता है। एमएस 3 स्पेक्ट्रा के दोनों सेट 12 नमूने के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। इस उदाहरण में, संवाददाता आयन अनुपात (ई / WT) (अल्जाइमर रोग / जंगली प्रकार नियंत्रण) मस्तिष्क, लीवर और दिल के ऊतकों के लिए दो जैविक प्रतिकृति भर में समान हैं। प्रत्येक तुलना के लिए गुना-परिवर्तन मूल्यों का सुझाव मस्तिष्क और हृदय में phosphoglycerate kinase 1 स्तरों ई चूहों में उच्च रहे हैं, जबकि जिगर में स्तर कम कर रहे हैं।

आकृति 1
figu1 पुन: प्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाह cPILOT का उपयोग कर। उदाहरण के लिए, इस कार्यप्रवाह 12 व्यक्ति के नमूनों का विश्लेषण की रूपरेखा। ऊतकों, कोशिकाओं, या शरीर के तरल पदार्थ से प्रोटीन निकाले जाते हैं और एक उपयुक्त प्रोटीन मानक (जैसे गोजातीय अल्फा कैसिइन) जोड़ा गया है। प्रोटीन ट्रिप्सिन का उपयोग कर पचा रहे हैं। पेप्टाइड्स टीएमटी 6 -plex (पीएच ~ 8.5) का उपयोग कर प्रकाश या भारी dimethylation (पीएच ~ 2.5) और लाइसिन अवशेषों पर का उपयोग करके N- टर्मिनस पर लेबल रहे हैं। लेबल लगाए गए पेप्टाइड्स एक भी मिश्रण और SCX आरपी-LC-एमएस / एमएस और एमएस 3 के अधीन में जमा कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: मस्तिष्क, हृदय, और एक अल्जाइमर रोग माउस मॉडल और जंगली प्रकार नियंत्रण के जिगर के ऊतकों से पेप्टाइड्स के उदाहरण cPILOT डेटा। (ए) प्रकाश और भारी dimethylated पेप्टाइड्स, मी / z 643.854 और 647.875 पर चोटियों के प्रतिनिधित्व को दर्शाता है। इन पेप्टाइड्स चयन किया गया था, अलग, और खंडित है, इस प्रकार पैदा सीआईडी-एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा (बी और सी), जो पेप्टाइड पहचान प्रदान की है। एक अतिरिक्त चयन, अलगाव, और प्रकाश और एमएस / एमएस के स्तर पर भारी dimethylated पेप्टाइड्स की सबसे तीव्र टुकड़ा आयन के विखंडन क्रमश: उत्पन्न HCD-एमएस 3 स्पेक्ट्रा (डी और ई)। पेप्टाइड अनुक्रम टी (डाइमिथाइल) ELNYFAK (समदाब रेखीय टैग 6) और काइनेज 1. phosphoglycerate के अंतर्गत आता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समदाब रेखीय अभिकर्मक0;
126 127 128 129 130 131
लाइट Dimethylation WT एक ई ख WT ई WT ई
दिमाग दिल जिगर
भारी Dimethylation WT ई WT ई WT ई
दिल जिगर दिमाग
ऊतक है या तो एक जंगली प्रकार नियंत्रण (WT) एक या अल्जाइमर रोग माउस (एडी) ख से।

तालिका 1: विज्ञापन और WT मस्तिष्क, हृदय, जिगर और ऊतकों की cPILOT समूह।

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Discussion

cPILOT 12 से अधिक अद्वितीय नमूने के एक साथ माप के लिए अनुमति देता है। आदेश पेप्टाइड्स के दोनों N- टर्मिनस और लाइसिन अवशेषों में सफल टैगिंग सुनिश्चित करने के लिए है, यह प्रतिक्रियाओं के प्रत्येक सेट के लिए सही पीएच के लिए और पेप्टाइड लेबलिंग के लिए पहले dimethylation प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। N- टर्मिनस पर चयनात्मक dimethylation (± 0.2) ~ 2.5 पर पीएच होने से किया जाता है। यह लाइसिन पर एमिनो समूहों के PKA के मतभेद और N- टर्मिनस का शोषण द्वारा हासिल की है। पीएच 2.5 से कम, लाइसिन निष्क्रिय है (PKA ~ 10.5); फिर भी, यदि पीएच हल्का अम्लीय (यानी पीएच 5-7) या बुनियादी है, दोनों एन टर्मिनी और लाइसिन अवशेषों dimethylated कर दिया जाएगा। इसके अलावा, यदि समदाब रेखीय टैगिंग एक कम पीएच पर पहले किया जाता है, एन टर्मिनी समदाब रेखीय लेबल और लाइसिन अवशेषों dimethylated हो जाएगा होगा। यह एमएस 3 के लिए चयन किया जा रहा है के रूप में बी-आयनों का चयन किया जा करने की आवश्यकता होगी कम टुकड़े हो सकता है। डाइमिथाइल के रिश्तेदार लागतव्यावहारिक प्रतिक्रियाओं वाणिज्यिक समदाब रेखीय अभिकर्मकों की तुलना में सस्ता कर रहे हैं। एक प्रति 100 माइक्रोग्राम एक पूरे समदाब रेखीय अभिकर्मक शीशी का उपयोग कर सकते हैं, हम भी तुलनीय लेबलिंग दक्षता के साथ 100 माइक्रोग्राम प्रति अभिकर्मक शीशी में से आधे का उपयोग कर सफलता मिली है। यह महत्वपूर्ण व्यक्ति cPILOT प्रयोगों के लिए लागत को कम करने में मदद करता है और अधिक नमूनों का विश्लेषण करने की अनुमति देता। इसके अलावा यह ध्यान रखें कि अन्य समदाब रेखीय टैगिंग अभिकर्मकों समदाब रेखीय इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अभिकर्मक के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता, जैसा कि हम पहले से 14 का प्रदर्शन किया है महत्वपूर्ण है। उच्च लेबलिंग और टैगिंग क्षमता सुनिश्चित करने के लिए इसे जल्दी नमूने के लिए अभिकर्मकों जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है। इस नमूने लगभग एक ही प्रतिक्रिया समय के लिए अनुमति देगा। मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए, प्रत्येक नमूने हूबहू विशेष रूप से dimethylation और समदाब रेखीय लेबलिंग चरणों में नमूने पूलिंग से पहले इलाज किया जाना चाहिए। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि requir प्रारंभिक चरणों में एक साथ कई नमूनों के साथ कामतों सावधान उपयोगकर्ता कौशल और ध्यान से निपटने के नमूने के लिए।

सबसे आदर्श परिदृश्य 12 नमूने भर में मिश्रण में हर प्रोटीन के लिए रिपोर्टर आयनों प्राप्त करने के लिए है। हालांकि, इस प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के लिए ऐसा नहीं है। cPILOT के लिए quantitation जानकारी और अन्य बढ़ाया बहुसंकेतन आ के साथ पता लगाया पेप्टाइड्स की संख्या नमूना प्रकार, नमूना विभाजन और प्रसंस्करण कदम, एमएस डाटा अधिग्रहण विधियों, और उपकरण का प्रकार सहित कई कारकों पर निर्भर करता है। हालांकि दोनों dimethylation और समदाब रेखीय टैगिंग चरणों ~ का 95-99% एक उच्च पेप्टाइड लेबलिंग दक्षता है, वहां अभी भी है ~ एमएस 3 डेटा जो रिपोर्टर आयन जानकारी नहीं होगी का 20%। यह ट्रिप्सिन जो arginine-समाप्त पेप्टाइड्स कि समदाब रेखीय अभिकर्मक का कोई समावेश में परिणाम उत्पन्न करता है का उपयोग करने के भाग में कारण है। इस तरह के lysC के रूप में अन्य एंजाइमों, का उपयोग कर हल किया जा सकता है, प्रोटीन पहचान 25 में एक संभावित तालमेल के साथ। इसके अलावा भारी के लिएdimethylated पेप्टाइड्स, शिखर विखंडन के लिए चुना एम या एम -1 शिखर है, जो विभिन्न तीव्रताओं है और एमएस 3 चरण में मनाया रिपोर्टर आयन तीव्रता को प्रभावित करेगा हो सकता है। इस प्रकार वहाँ कुछ कम तीव्रता संवाददाता आयनों कि कुछ नमूने के लिए पता नहीं चलने पर हो सकता है। ऐसी स्थितियों अक्सर आमतौर पर कम तीव्रता एमएस / एमएस टुकड़े कि एमएस 3 चरणों के लिए अलग हो जाती हैं के लिए मनाया जाता है। इस मुद्दे पर एक महान समाधान tribrid जन स्पेक्ट्रोमीटर, जो, के बजाय एमएस 3 के लिए एक पायदान चयन का उपयोग कर के, का उपयोग बहु पायदान या एक से अधिक एमएस में शामिल किया गया / एमएस 26 विखंडित।

वहाँ है कि (अर्थात 20 अप करने के लिए वाणिज्यिक समदाब रेखीय अभिकर्मकों के साथ) एक भी विश्लेषण में तुलना की जा सकती नमूनों की संख्या के संबंध और इस्तेमाल किया ऊतकों के प्रकार के साथ विशेष रूप से cPILOT दृष्टिकोण में बहुमुखी प्रतिभा का एक बहुत है। हम दिखा दिया है कि यह मस्तिष्क, हृदय से सटीक मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए आसान है, औरएक बीमारी के संदर्भ में एक ही विश्लेषण में जिगर के ऊतकों। इस विधि, ठीक उसी प्रकार अन्य बहुसंकेतन तरीकों के साथ, कई नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक ही बार में अनुमति देता है, और कोशिकाओं, ऊतकों, शरीर के तरल पदार्थ, या पूरे जीवों से होने वाले नमूनों के लिए लागू है। इसके अलावा, cPILOT लेबल पेप्टाइड्स या तो एक कम 24 या उच्च संकल्प (60,000) साधन का उपयोग कर विश्लेषण किया जा करने में सक्षम हैं। इसकी तुलना में, सफल माप अन्य बहुसंकेतन तरीकों का उपयोग कर प्राप्त नमूना की एक विशिष्ट प्रकार (यानी कोशिकाओं) 18, तक सीमित हो सकती बहुत अधिक रिज़ोल्यूशन 20, या स्थिर आइसोटोप लेबल के उपयोग के साथ एक उपकरण की आवश्यकता हो सकती। cPILOT बीमारी समझ, बायोमार्कर की खोज, एक दवा या चिकित्सकीय हस्तक्षेप, या कई बार अंक के पार अनुदैर्ध्य परिवर्तन की प्रतिक्रिया में रुचि रखने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए अच्छा है। इसके अलावा, बड़े बन्दूक प्रोटिओमिक्स के लिए नैदानिक ​​नमूने (जहां एन बड़ी है, सैकड़ों हजारों के लिए), सीपी का विश्लेषण करती हैIlot भी प्रयोगात्मक लागत और समय को कम करने में मदद करने के उपयुक्त हो सकता है। भविष्य में, cPILOT मौजूदा और उपन्यास समस्थानिक और समदाब रेखीय लेबलों का उपयोग करके नमूनों की एक बड़ी संख्या मल्टीप्लेक्स विस्तार किया जाएगा।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है।

Acknowledgments

लेखकों RASR को पिट्सबर्ग प्रारंभ हुआ फंड के विश्वविद्यालय और एनआईएच, NIGMS R01 अनुदान (जीएम 117,191-01) स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

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References

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जैव रसायन अंक 123 मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स cPILOT टीएमटी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग बहुसंकेतन ऊतकों
बढ़ी नमूना संयुक्त पूर्वगामी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग का उपयोग ऊतकों की Multiplexing (cPILOT)
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King, C. D., Dudenhoeffer, J. D.,… More

King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

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