Summary
Burada, bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının bir yarı-yüksek verimli hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu protokol, bir hücre tek tabaka üzerinde tutarlı çizik yaraları oluşturmak için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir.
Abstract
Hücre göçü / tahlil yaralama hücre göçü ve anjiyogenez ve tümör metastazı gibi diğer biyolojik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlilde, hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için büyütülür ve mekanik bir yara bir cihaz ile çizilerek oluşturulur. Sonra soyulmuş alanına doğru hücrelerinin göç hızı görüntüleme ile izlenebilir. Bizim 8 kanallı mekanik wounder hücre göçü deneyi ile ilişkili sorunların çoğunu çözmek için tasarlanmıştır. Birincisi, bizim wounder kolayca otoklav ile veya ortak dezenfektanlar ile sterilize edilebilir. İkinci olarak, tek tek ayarlanabilen pimleri daha keskin ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir, böylece hücre kültür plakası ile temas etmesi. Üçüncü olarak, wounder her iki tarafında kılavuz çubukları her bir tutarlı yaralama pozisyonunu garantiler. ayrıca wounder daha iyi yol tutuşu sağlayabilir yanı sıra çapraz contaminat en aza indirmek için yaralama için tek kullanımlık plastik pipet uçlarının kullanılmasıiyon. Sonuç olarak, hücre wounder standart 96 oyuklu bir kültür plakası kullanarak hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir kullanıcı dostu ve yeniden üretilebilir bir cihazla araştırmacılar sağlayabilir.
Introduction
Hücre göçü gibi embriyojenez, nöron, anjiyogenez, yara iyileşmesi, mukozal tamiri, normal gelişim ve hastalık durumuna 1 altında epitelyal-mezenkimal-geçişler gibi hücresel süreçleri de önemli bir rol oynar. Bu sinyal molekül etkileşimleri, hücre kutuplaşma, hücre iskeleti yeniden, matris yeniden membran çıkıntı ve dinamik hücre-hücre yapışması modülasyonu 2 olmak üzere çok sayıda içi ve hücresel olayların koordinasyonunu içeren karmaşık bir süreçtir. hücre göçü inceleyerek, hücre hareketi ve bununla ilgili biyokimyasal yollar yol açan kimyasal madde veya biyomoleküllerin keşif ve doğrulama tespit edilebilir. Bu temel süreç böyle hastalık tedavisi ve ilaç hedefleme gibi çeşitli uygulamalar için bir vekil olarak yararlı bir şekilde kullanılabilir.
Yaralama deney hücre göçü deneyleri 3 biridir. Burada, birhücrelerin tek tek örnek, kısmen hücre alanı kapsayacak şekilde göç bir soyulmuş alanı üretmek için mekanik araçlar ile kaldırılır. Belirli bir zaman noktasında geri kazanım yüzdesi izlenecektir. Örneklerin çok sayıda tutarken, bu tür örneklerin içinde deneysel maliyet ve çapraz kontaminasyon gibi konular sorunlu olabilir. Pek çok ticari araçlar ve deneyler, hücre göçü 4, 5, 6, çalışmak için uygun olmakla birlikte, bunların çok pahalı ve karmaşık ekipmanlar gerekmektedir ve geliştirmeler de ihtiyaç vardır. Bu nedenlerden dolayı, 8-kanallı mekanik hücre wounder (Şekil 1) olarak geliştirilmiştir.
Bizim 8-kanal mekanik hücre wounder yukarıda belirtilen sorunların çözümünde birçok benzersiz özelliklere yer vermiş. Bu 96 gözlü kültür plakası formatında tahlilleri yaralama / hücre göçü gerçekleştirmek için esneklik sağlar. ayarlanabilir guiding bar tasarımı karalama alanı de her merkezi konumda olmasını sağlar. wounder kültür plakalarının çeşitli markalar için geçerlidir, böylece aynı zamanda, yönlendirme çubuklarının yüksekliğinin ayarlanabilir. Son olarak, ayarlanabilir yaralama pimi tasarımı aynı anda ve tekrarlanabilir yaralama 7, 8 ulaşmak için kültür plaka yüzeyi ile pipet uçları eşit teması sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wounder parçaları 1. Giriş (Şekil 1)
- eşit mesafelerde yaralama işaretçilerine sabitleyerek pim tutucu hazırlayın. pipet uçları tutun ve yukarı ve aşağı ayarlanabilir yaralama işaretçilerine hareket ettirerek ucu yüksekliğini ayarlayın.
- 96-kuyu kültür plakaları farklı markalarda ayarlanabilir rehberlik-bar Fit ve yaralama alanı sabit bir pozisyonda olduğundan emin olun.
- altıgen vidayı sıkarak ayarlanabilir yaralama pimini sabitleyin. iki ucunda altıgen başlı kapaklar sıkarak pozisyonda rehberlik-bar Fix.
2. Pin Tutucu genişliği Ayar (Şekil 2)
- M5 altıgen anahtar ile altıgen başlı kapaklarını gevşetin.
- kılavuz çubukları 96 oyuklu bir kültür plakasına genişliği ile mükemmel uyum sağlar ve böylece çivili her iki taraf için halkalar ayarlama uygun sayıda yerleştirin.
NOT: Corning ve Iwaki plakaları büyük halkalar 1 çift ve küçük halkalar 1 çift gerektirir. Şahin ve Nunc plates büyük halkalardan 1 çift gerekir. - altıgen soket kafası sıkın rehberlik çubuğu düzeltmek için kapaklar.
3. Rehberlik Barlar ayarlanması (Şekil 3)
- Steril 10-ul plastik pipet uçları ile yaralama pimlerini.
- M5 altıgen anahtar ile altıgen başlı kapaklarını gevşetin.
- wounder tutun ve 96 bölümlü kültür plakasının bir kolonuna yaralama işaretçilerini daldırın.
- ancak kuyu alt dokunmak tüm ipuçları kadar yol gösterici çubukların yüksekliğini ayarlayın.
- altıgen başlı kapaklarını sıkıştırın. wounder şimdi mükemmel kültür plaka üzerinde ve işaretçilerine kuyuların ortasında iyi bir konuma olduğundan oturduğundan emin olun.
Pins 4. Kalibrasyon
- Düz steril bir yüzey (yani Petri kabı) dik wounder tutun ve M3 altıgen anahtar ile tüm altıgen vidayı gevşetin.
- eşit düz steril yüzeyine dokunmayın tüm ipuçları kadar wounder dokunun. </ Li>
- pozisyonunda işaretçilerine kilitlemek için tekrar altıgen vidalarını sıkın.
- Düz steril bir yüzeye hafifçe wounder dokunarak her ucu düzgünlüğü kontrol edin.
5. Kaşıma Hücre Tek tabakalı (Şekil 4)
- % 0.1 jelatin kaplı 96-iyi hücre kültür plakası üzerine tohum insan umbilikal damar endotelyal hücreleri. Ortama 199 Kültür hücreleri,% 20 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve 0.09 g / L heparin ile takviye edilmiştir. gece boyunca, kullanılmadan önce 37 ° C 'de,% 5 karbon dioksit ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri korumak. Hücreler yaralama önce% 100 confluency ulaşması gerekir.
- soldakinden (veya en sağdaki) kültür plaka aynı sütun içinde her bir kuyunun kenarındaki yaralama ipuçları yerleştirin. kuyunun üzerinden diğer tarafa wounder kaydırın; yaralama ipuçları kuyunun dibine dokunmadan emin olun.
- tüm sütunlar için tırmalamak (Adım 5.2) tekrarlayın.
- , Iskarta t yaralama sonraO, orta ve her bir oyuk taze ortam içeren test bileşikleri ile değiştirin.
6. Veri Toplama ve Görüntü Analizi
- Görüntü dijital kamera (örneğin 10X objektif) bir düşük güç mikroskop kullanılarak hücre tek tabaka mekanik yara ile tüm iyi derhal (t = 0 h) yaralama sonra.
- arzu edildiği takdirde test bileşiklerinin ekleyin ve bir zaman istenilen uzunlukta inkübe edilir. Görüntü İstenilen kuluçka süresinden (t = AH) sonra yeniden yara alanı ile tüm iyi.
- Böyle ImageJ gibi görüntü analiz yazılımı (kullanarak https://imagej.nih.gov/ij/ ), serbest aracını kullanarak resmin üzerine yaralı bölgeyi ölçer.
- yara kapatma yüzdesini hesaplayın:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu 8-kanal mekanik wounder hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için hücre tek tabaka kazımak için imal edilir. Bu özel eğitim olmadan bir dakikadan az 96 oyuklu plakalarda hücre tırmalamak analizleri yapabilir kullanıcı dostu bir cihazdır. Bu wounder yaklaşık 600 um'lik bir düzgün genişlikte ve keskin kenarlı hücre tekli katmanları üzerinde yara alanı neden olabilir (Şekil 5 ve 6). Yaraların genişliği pipet uçları marka ve kullanıcının performansına bağlıdır. Yara genişliği Bu aralık ortak görüntü düşük güç büyütme altında yakalayan (Şekil 7) için uygundur. Görüntü çektikten sonra, yara kapama yüzdesi hesaplanabilir. Bu hücre wounder hücre göçü deneyi ile karşılaşılan sorunların çözümünde farklı stratejiler dahil etti. Ayrıca, çeşitli 96-çukurlu kültür pl hücre göçü Analizleri yapan esneklik sağlarbiçimleri yedik.
Şekil 1: Sekiz kanallı mekanik hücre wounder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: çivili genişliğini ayarlayın. 96-kuyu plaka sığdırmak için ayarlama halkaları yerleştirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Farklı plaka biçimleri sığacak şekilde rehberlik çubukları ayarlayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: ucunun yönünü çizmek. de alt diğer tarafına de alt bir taraftan wounder kaydırarak hücreleri kazıyın.
Şekil 5: yaralama sonrası 96 oyuklu plakanın genel bir bakış. Hücre tek tabaka yaklaşık 600 um düzgün genişliği ile keskin kenarlar üreten wounder tarafından yaralanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. < / P>
Şekil 6: Bir satır Temsilcisi görüntüleri ve hemen çizilmeye sonra kuyuların bir sütun. Her bir yaranın genişliği nicel analizi. Görüntüler 10X objektif altında yakalanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: t = 0 h ve t = Sh de Çekilen yara görüntüleri (10X objektif). noktalı çizgi yara bölgesini gösterir ve katı çizgi hücre göçü alanını belirtir. A) insan göbek damarı endotel hücreleri. B) İnsan dermal fibroblast.= "_ Blank" olsun> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim hücre wounder geleneksel hücre göçü deneyleri sorunlarını çözmede birçok benzersiz özelliklere sahiptir. 8-kanallı mekanik hücre wounder otoklav ile sterilize edilebilir, uzun ömürlü, yüksek dereceli paslanmaz çelik (çelik 304) yapılmıştır. piyasada bulunan 96 oyuklu kültür plakaları neredeyse tüm ticari markalar için ayarlanabilir kılavuz çubuğunun bu mekanik hücre wounder kullanılabilir. Ayarlanabilir kılavuz çubuğunun tasarımı da kazıma alanı her bir merkezinde olmasını sağlar. oyuk bir merkez pozisyonda yara, bir mikroskop kullanılarak görüntü yakalama kolaylaştırabilir. Farklı zaman noktalarında alınan iken görüntüleri bazı varyasyonları sahip, ama iyi alanının neredeyse% 90 düşük büyütme amacı (yani 10X) ile mikroskop ile görülebilir çünkü veri analizi etkilemez. Bu durumda, bir yarı-yüksek veri akışı analizi, 96 oyuklu kültür plakaları 7 <gerçekleştirilebilirsup class = "xref"> 8. Ancak, bu yöntem hala uzun veri analizini gerektiren görüntülerin, çok sayıda gerektirir. Bir otomatik görüntü elde sistemi varsa, bu çözülebilir.
wounder bireysel olarak ayarlanabilir pimlerin tasarımı sayesinde, hücre tek tabaka, aynı Düzgün ve keskin yaralar elde etmek için 96 gözlü levha yüzeyi ile temas sağlar. çizilme pimleri sterilize ve her çizilmeye sonra imha ve mekanik hasar olmadan da yüzeyine temas büyük esneklik sağlayabilir edilebilir ticari plastik pipet uçları vardır. Bu avantajları, deney ve soyulmuş alanı boyunca hücre hareketi üzerinde etkisi sırasında örneklerin çapraz kontaminasyonu en aza indirebilirsiniz. Gelecekte, pim yükseklik ayarı adımını ortadan kaldırabilir yay kontrollü pimi gelişecektir. Bu cihazı kullanmak için en kritik adım kazıma sırasında hücre tek tabaka üzerine uygulanan kuvvettir. wounder gerekirSekiz pipet uçları kuyunun dibine değecek biçimde, kültür plakasına karşı dik yapılacak. Gerçekten de, wounder pahalı ve karmaşık ekipman kullanmaksızın hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir yöntem de sağlar. Bu wounder için protokol basit ve kolaydır.
Sonuç olarak, 8-kanal mekanik wounder özel bir yetenek gerektirmez hücre göçü deneyleri için kullanıcı dostu bir cihazdır. Kullanıcılar, hızlı ve basit bir şekilde 9, 10, 11 numune nispeten büyük bir sayıda 96 oyuklu plakalar içinde hücre göçü deneyi gerçekleştirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar bu wounder prototipini yapımında Sayın Tam Po Leung, Bay Wong Chi Kin ve teknik becerileri Fen Fakültesi Atölyesi teknik personel, Hong Kong Baptist Üniversitesi ve danışmanlık teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
