Summary
Her præsenteres en protokol til at udføre en semi-high throughput cellemigrationsassay på en 96-brønds celledyrkningsplade. Denne protokol er en hurtig, enkel og økonomisk metode til at skabe ensartede scratch sår på en celle monolag.
Abstract
Den cellemigration / sårede assay er en almindeligt anvendt metode til at studere celle migration og andre biologiske processer, såsom angiogenese og tumormetastase. I dette assay dyrkes celler til dannelse af et sammenflydende monolag og en mekanisk sår er skabt ved at skrabe med en enhed. Derefter vandringshastigheden af cellerne mod det blottede område kan overvåges ved billeddannelse. Vores 8-kanals mekanisk wounder er designet til at håndtere de fleste af de problemer, der er forbundet med cellemigrationsassay. For det første kan vores wounder let steriliseres ved autoklavering eller med almindelige desinfektionsmidler. For det andet tillader de enkelte justerbare ben selv kontakt med cellekultur pladen, så der kan skabes skarpe og reproducerbare sår. For det tredje, de ledende bjælker på begge sider af wounder sikre konsekvent sårdannelse position i hver brønd. Brugen af engangs plast pipettespidser til sårede yderligere kan give bedre håndtering af wounder samt at minimere tværs SNAVSETion. Som konklusion kan vores celle wounder give forskerne et brugervenligt og reproducerbar indretning til udøvelse af cellemigrationsassay anvendelse af standard 96-brønds dyrkningsplade.
Introduction
Cellemigrering spiller en vigtig rolle i cellulære processer, såsom embryogenese, neurogenese, angiogenese, sårheling, mucosal reparation, epitel--mesenchymal-overgange under normal udvikling og sygdomssituationen 1. Det er en kompliceret proces, der kræver det en samordning af talrige inter- og intra-cellulære begivenheder, herunder signalmolekyle interaktioner, celle polarisering, cytoskeletal reorganisering, matrix remodeling, membran fremspring og dynamiske celle-celle adhæsion modulation 2. Ved at studere celle migration, kan bestemmes opdagelsen og validering af kemikalier eller biomolekyler, der fører til celle bevægelse og dens relaterede biokemiske veje. Denne grundlæggende proces kan bruges med fordel som en proxy for forskellige applikationer, såsom sygdom behandling og narkotika målretning.
Den sårede analysen er en af celle migration assays 3. Her, enindividuel prøve af celler vil blive delvist fjernes mekanisk for at frembringe en blottede område, hvor celler vil migrere til at dække området. Procentdelen af genvinding på et bestemt tidspunkt vil blive overvåget. Ved håndtering stort antal prøver, kan emner som den eksperimentelle omkostninger og krydskontaminering inden prøverne være problematisk. Selvom mange kommercielle værktøjer og assays er tilgængelige til undersøgelse af cellemigrering 4, 5, 6, mange af dem krævede dyrt og sofistikeret udstyr og stadig behov for forbedringer. Af disse grunde er en 8-kanals mekanisk celle wounder (figur 1) udviklet.
Vores 8-kanals mekanisk celle wounder har indarbejdet flere unikke funktioner i at løse de ovennævnte problemer. Det giver fleksibilitet til at udføre cellemigration / sårede assays i 96-brønds dyrkningsplade format. Den justerbare guiding bar design sikrer, at bunden område er i den centrale position i hver brønd. Desuden kan højden af de ledende stænger justeres således at wounder er anvendelig til forskellige mærker af dyrkningsplader. Endelig den justerbare såret pin design muliggør en jævn kontakt pipettespidserne med kulturen pladens overflade for at opnå en samtidig og reproducerbar sårdannelse 7, 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Introduktion til Dele af wounder (figur 1)
- Forbered holder stiften ved fastsættelse af sårende stifter i samme afstand. Hold pipettespidserne og justere spidsen højden ved at flytte de justerbare såring stifter op og ned.
- Monter indstillelige føring-bar på forskellige mærker af 96-brønds kulturplader og sikre, at såret område er i en fast position.
- Fastgør den justerbare såret pin ved at stramme den sekskantede skrue. Fix det ledende-bar på plads ved at stramme sekskant hætter på begge ender.
2. Indstilling af bredde Pin Holder (figur 2)
- Løsn sekskant hætter med M5 skruenøgle.
- Indsæt et passende antal justere ringe til begge sider af pin holderen, så de vejledende stænger passer perfekt med bredden af 96 brønde kultur plade.
BEMÆRK: Corning og Iwaki plader kræver 1 par store ringe og 1 par små ringe. Falcon og Nunc plAtes brug 1 par store ringe. - Spænd sekskant hætter at fastsætte den vejledende bar.
3. Justering af Vejledende Bars (figur 3)
- Monter sårede pins med sterile 10-pi plast pipettespidser.
- Løsn sekskant hætter med M5 skruenøgle.
- Hold wounder og dyppe de sårende stifter i en søjle i en 96-brønds dyrkningsplade.
- Juster højden af de ledende stænger, indtil alle de tips knap røre bunden af brøndene.
- Spænd sekskant caps. Sørg for, at wounder nu passer perfekt på kultur pladen og at benene er godt positioneret i midten af brøndene.
4. Kalibrering af Pins
- Hold wounder vinkelret på en flad steril overflade (dvs. petriskål) og løsn alle sekskantskruer med M3 skruenøgle.
- Tryk på wounder indtil alle tips jævnt røre den flade sterile overflade. </ Li>
- Spænd sekskantskruer igen for at låse benene i position.
- Tjek jævnhed af hver spids ved at trykke på wounder forsigtigt på den flade sterile overflade.
5. skrabe cellemonolaget (figur 4)
- Seed humane umbilical vaskulære endotelceller på en 0,1% gelatine-coatede 96-brønds celledyrkningsplade. Dyrke celler i medium 199 suppleret med 20% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin og 0,09 g / L heparin. Opretholde celler i en fugtig inkubator med 5% carbondioxid ved 37 ºC natten over, inden den anvendes. Cellerne bør nå 100% flyder sammen inden såret.
- Placer såring tip i længst til venstre (eller længst til højre) side af hver brønd under samme kolonne i dyrkningspladen. Skub wounder over til den anden side af brønden; sørge for sårende tips rører bunden af brønden.
- Gentag skrabe (trin 5.2) for alle kolonner.
- Efter såret, discard than medium i hver brønd og erstattes med frisk medium indeholdende forbindelser, som tester.
6. dataopsamling og billedanalyse
- Billede hele godt med den mekaniske sår på cellemonolaget ved hjælp af en energibesparende mikroskop med digital kamera (f.eks 10X objektiv) umiddelbart efter sårede (t = 0 h).
- Tilføj testforbindelser om ønsket og inkuberes i den ønskede længde af tid. Billede hele godt med sårområdet igen efter den ønskede inkubationstid (t = Ah).
- Brug billedanalyse software såsom ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), måle sårede område på billedet med frihånd værktøj.
- Beregn procentdelen af sårlukning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne 8-kanals mekaniske wounder er konstrueret til at ridse en celle monolag for at udføre den cellemigrationsassay. Det er en brugervenlig enhed, der kan udføre celle skrabe analyser i 96-brønds plader på mindre end et minut uden særlig uddannelse. Denne wounder kan introducere viklede områder på cellemonolag med en ensartet bredde på ca. 600 um og med skarpe kanter (5 og 6). Bredden af sår afhænger af mærke af pipettespidser og brugerens præstationer. Denne serie af sår bredde er egnet til almindelig billedoptagelse under lav-forstørrelse (figur 7). Efter optagelse af billedet, kan procentdelen af sårlukning beregnes. Denne celle wounder har indarbejdet forskellige strategier til at løse problemerne med cellemigrationsassay. Også, det giver fleksibilitet ved cellemigration assays i forskellige 96-brønds kultur plspiste formater.
Figur 1: Otte-kanal mekanisk celle wounder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Juster bredden på pin holderen. Indsæt justeringsringene for at passe med 96 brønde plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Juster de ledende stænger passer til forskellige plade-formater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ridses retning af spidsen. Ridse cellerne ved at skubbe wounder fra den ene side af bunden af brønden til den anden side af brønden bund.
Figur 5: Oversigt over 96-brønds plade efter sårdannelse. Cellemonolaget såret af wounder producerer skarpe kanter med ensartet bredde på ca. 600 um. Klik her for at se en større version af dette tal. < / P>
Figur 6: Repræsentative billeder af en række og en søjle af brønde umiddelbart efter ridser. Kvantitativ analyse af bredden af hvert sår. Billeder er fanget under en 10X mål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Captured såret billeder (10X objektive) ved t = 0 h og t = Ah. Den stiplede linje angiver sårområdet og den fuldt optrukne linie angiver cellemigrering område. A) Humane navlevene endothelceller. B) humane dermale fibroblaster.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores celle wounder har flere unikke funktioner i at løse problemerne med traditionelle celle migration assays. Den 8-kanals mekanisk celle wounder er lavet af høj kvalitet rustfrit stål (stål 304) med en lang levetid, der kan steriliseres ved autoklavering. Næsten alle kommercielle mærker af 96-brønds dyrkningsplader findes på markedet, kan anvendes med denne mekaniske celle wounder grund af den indstillelige styrestangen. Udformningen af den justerbare styrestangen sikrer også, at skrabe område er i centrum for hver brønd. Såret i en central position af brønden kan lette billedoptagelse ved mikroskopi. Billederne besidder nogle variationer mens taget på forskellige tidspunkter, men de påvirker ikke dataanalyse fordi næsten 90% af brønden område kan ses af mikroskopet med en lav-forstørrelse mål (dvs. 10X). Således kan en semi-high throughput analyse udføres på 96-brønds dyrkningsplader 7, <sup class = "xref"> 8. Imidlertid kræver denne fremgangsmåde, stadig et stort antal billeder, som kræver langvarig dataanalyse. Dette kan løses, hvis et automatisk billede erhverve system er tilgængeligt.
Udformningen af de enkelte indstillelige stifter af wounder tillader jævn kontakt med den 96-brønds plade overflade for at opnå identiske, glatte og skarpe sår på cellemonolaget. De skrabe stifter er kommercielle plast pipettespidser, der kan steriliseres og bortskaffes efter hver enkelt ridser, og kan give stor elasticitet til at kontakte brøndens overflade uden mekaniske skader. Disse fordele kan yderligere at minimere krydskontaminering af prøver under eksperimentet og indflydelsen på cellebevægelse tværs det blottede område. I fremtiden vil vi udvikle en fjeder-kontrolleret stift, der kan eliminere trinnet pin højdejustering. Det mest kritiske trin for at bruge denne enhed er den kraft, der udøves på cellemonolaget under ridser. Den wounder skalholdes vinkelret mod dyrkningspladen, således at otte pipettespidser rører bunden af brønden. Faktisk wounder en fremgangsmåde til at udføre cellemigrationsassay uden brug af dyrt og kompliceret udstyr. Protokollen for dette wounder er enkel og ligetil.
Afslutningsvis vores 8-kanals mekanisk wounder er en brugervenlig indretning til cellemigration assays, der ikke kræver særlige færdigheder. Brugere kan udføre cellemigrationsassay i 96-brønds plader med en relativt stort antal prøver på en hurtig og enkel måde 9, 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Mr. Tam Po Leung, Mr. Wong Chi Kin og tekniske personale på Science Faculty Workshop, Hongkong Baptist University, for deres tekniske færdigheder og rådgivning i at gøre prototypen på denne wounder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
