מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע assay נדידת תאי תפוקה למחצה גבוהה על צלחת תרבית תאי 96-היטב. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית ליצור פצעי שריטה עקביים על monolayer תא.

Abstract

הגירת התא / ופצע assay היא שיטה נפוצה ללמוד נדידת תאים ותהליכים ביולוגיים אחרים, כגון אנגיוגנזה גרורה של גידולים. ב assay זה, תאים גדלים להקים monolayer ומחובר פצע מכנים נוצר על ידי גירוד עם התקן. ואז שיעור ההגירה של התאים לעבר אזור הערומים ניתן לנטר באמצעות הדמיה. wounder המכאני 8 הערוצים שלנו נועד להתמודד עם רוב הבעיות קשורות assay נדידת תאים. ראשית, wounder שלנו ניתן לעקר בקלות על ידי מעוקר או בחומרי חיטוי נפוץ. שנית, הפינים מתכווננת הבודדים אפילו לאפשר מגע עם צלחת תרבית תאים כך פצעים חדים לשחזור ניתן ליצור. שלישית, הברים המנחים משני צידי wounder ולהבטיח את מעמדה ופציעתם עקבית בכל טוב. שימוש טיפי פיפטה פלסטיק חד פעמיים עבור ופצע עוד יכול לספק טיפול טוב יותר של wounder וכן למזער צולבות contaminatיוֹן. לסיכום, wounder התא שלנו יכול לספק לחוקרים עם מכשיר ידידותי למשתמש לשחזור עבור ביצוע assay נדידת תאים באמצעות צלחת תרבות 96-היטב הסטנדרטית.

Introduction

נדידת תאים ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים תאיים, כגון עובר, נוירוגנזה, אנגיוגנזה, ריפוי פצעים, תיקון רירי, אפיתל mesenchymal-מעבר בפיתוח נורמלי למחלת מצב ^1. זהו תהליך מסובך שכרוך התיאום של רבי אירועים בין-תוך תאי כולל אינטראקציות מולקולת איתות, קיטוב תא, ארגון מחדש cytoskeletal, שיפוץ מטריקס, בליטת הממברנה אפנון הידבקות תאי תאים דינמיים ^2. על ידי לימוד נדידת תאים, הגילוי והאימות של כימיקלים או ביומולקולות מובילה תנועת תא הביוכימיים הקשורים אליה ניתן לקבוע. תהליך בסיסי זה יכול לשמש לטובה כמו פרוקסי עבור יישומים שונים, כגון טיפול במחלות התרופה מיקוד.

את assay והפצע הוא אחת מבחני נדידת תאים ^3. הנה,מדגם בודד של תאים יוסר באופן חלקי על ידי אמצעים מכאניים לייצר אזור ערומים שבו תאים יעברו כדי לכסות את האזור. אחוז ההחלמה בנקודת זמן מסוימת יהיה פיקוח. בעת טיפול מספר גדול של דגימות, בעיות כגון עלות הניסיונית בין זיהום בתוך דגימות יכולות להיות בעייתיות. למרות כלי מבחנים מסחריים רבים זמינים לחקר תא גירה ^{4, 5, 6,} רבים מהם נדרשים ציוד יקר ומתוחכם ושיפורים נדרשים עדיין. מסיבות אלו, wounder תא מכאני 8 ערוצים (איור 1) מפותח.

8 ערוצי wounder התא המכאני שלנו מאגד כמה תכונות ייחודיות בפתרון הבעיות הנ"ל. הוא מספק את הגמישות לבצע נדידת תאים / ופצע מבחנים בפורמט צלחת תרבות 96-היטב. ג.א. מתכווננתעיצוב בר iding מבטיח שאזור השריטה נמצא במצב המרכזי של כל טוב. כמו כן, בעיצומה של הברים המנחים יכול להיות מותאם כך wounder ישימה עבור מותגים שונים של צלחות תרבית. לבסוף, עיצוב הסיכה ופציעתם מתכווננת מאפשר גם איש קשר של הטיפים פיפטה עם פני צלחת התרבות להשיג ופציעתם סימולטני לשחזור ^{7, 8.}

Protocol

1. מבוא החלק Wounder (איור 1)

1. הכן את בעל פינים ידי תיקון סיכות ופציעתם במרחקים שווים. החזק את הטיפים פיפטה ולהתאים את גובה הטיפ על ידי הזזת הסיכות ופציעתם מתכווננת מעלה ומטה.
2. התאימו את המנחה-בר מתכווננת על מותגים שונים של צלחות תרבות 96-היטב להבטיח שהאזור ופציעתם נמצא בעמדה קבועה.
3. תקן את הסיכה ופציעתם מתכווננת על ידי הידוק בורג hex. תקן את הבר המנחה בעמדה ידי הידוק כמוס ראשי קץ hex בשני הקצוות.

2. הגדרת הרוחב של מחזיק הפין (איור 2)

1. שחרר את כמוסות ראשי קץ hex עם מפתח ברגים hex M5.
2. הכנס מספר מתאים של התאמת טבעות לשני הצדדים של בעל פינים כך הסורגים המנחים להתאים באופן מושלם עם הרוחב של הצלחת התרבות 96-היטב.
   הערה: קורנינג Iwaki צלחות דורשים 1 זוג טבעות גדולות 1 זוג טבעות קטנות. פלקון pl Nuncאטס צריך 1 זוג טבעות גדולות.
3. הדקו את ראשי קץ hex caps לתקן הבר המנחה.

3. התאמת ברי המנחים (איור 3)

1. התאם את הסיכות ופוצעים עם טיפי פיפטה פלסטיק 10 μL סטרילי.
2. שחרר את כמוסות ראשי קץ hex עם מפתח ברגים hex M5.
3. החזק את wounder וטובל את הסיכות ופציעתם לתוך עמודה אחת של צלחת תרבות 96-היטב.
4. התאם את הגובה של הסורגים המנחים עד כל הטיפים בקושי לגעת בתחתית הבארות.
5. הדק את הכמוסות ראש קץ hex. ודא כי wounder עכשיו מתאים באופן מושלם על הצלחת התרבות כי הפינים-ממוצבים היטב באמצע הבארות.

4. כיול של פיני

1. החזק את wounder בניצב משטח שטוח סטרילית (צלחת פטרי כלומר) לשחרר את כל הברגים hex עם מפתח ברגים hex M3.
2. הקש על wounder עד כל הטיפים שווה לגעת משטח סטרילי שטוח. </ Li>
3. חזק את ברגי hex שוב לנעול את הסיכות בעמדה.
4. בדוק את השוויון של כל קצה על ידי קשה על wounder בעדינות על המשטח סטרילי השטוח.

5. וגרד תא חד שכבתי (איור 4)

1. זרע אנושי לתאי אנדותל כלי הדם הטבורי על צלחת תרבית תאים 0.1% ג'לטין מצופה 96-היטב. תאי תרבות בינונית 199 בתוספת 20% בסרום שור עובר מומת חום, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו הפרין 0.09 g / L. שמור על תאים בתוך חממה humidified עם פחמן דו חמצני 5% ב 37 ºC לילה לפני בשימוש. תאים צריכים להגיע ל -100% confluency לפני ופצע.
2. מניח את הטיפים ופציעתם על השמאלי ביותר (או הימני ביותר) הצד של כל טוב בתוך באותו הטור של הצלחת התרבות. חלק את wounder פני לצד השני של הבאר; לוודא את הטיפים ופציעתם נוגעות בתחתית הבאר.
3. חזור על מגרד (שלב 5.2) עבור כל העמודות.
4. לאחר פציעה, שנזרק tהוא בינוני בכל טוב ולהחליף עם תרכובות בדיקות המכיל בינוני טרי.

6. קליטת נתונים וניתוח תמונה

1. תמונה כולה גם עם הפצע מכני על monolayer התא באמצעות מיקרוסקופ צריכת חשמל נמוכה עם מצלמה דיגיטלית (אובייקטיבי למשל 10X) מיד לאחר ופצעו (t = 0 ח).
2. להוסיף תרכובות בדיקה אם רוצה דגירה במשך האורך הרצוי של זמן. תמונה כולה היטב עם אזור הפצע שוב לאחר זמן דגירה הרצוי (t = Δh).
3. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), למדוד את השטח הפצוע על התמונה באמצעות כלי ביד החופשי.
4. חישוב אחוזי סגירת הפצע:
   

Representative Results

8 ערוצים זה wounder המכאני בנוי לגרד בשכבת תא על מנת לבצע את assay נדידת תאים. זהו מכשיר ידידותי למשתמש, כי יכול לבצע מבחני מגרד תא 96-גם צלחות בפחות מדקה ללא הכשרה מיוחדת. Wounder זה יכול להציג אזורי פצע על משטחי תא ברוחב אחיד של כ -600 מיקרומטר עם קצוות חדים (איורים 5, 6). רוחבו של פצעים תלוי המותג של טיפים פיפטה ואת הביצועים של המשתמש. מגוון זה של רוחב פצע מתאים תמונה נפוצה לכיד בהגדלת צריכת חשמל נמוכה (איור 7). לאחר צילום התמונה, אחוז סגירת הפצע ניתן לחשב. wounder תא זה מאגד אסטרטגיות שונות בפתרון בעיות נתקלו עם assay נדידת תאים. כמו כן, הוא מספק גמישות בביצוע מבחני נדידת תאים ב pl תרבות 96-היטב שוניםאכול פורמטים.

איור 1: wounder תא מכאני שמונה ערוצים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: התאם את הרוחב של בעל פינים. הכנס את טבעות התאמה כדי להתאים את צלחת 96-בארות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. מתאים את הסורגים המנחים כדי להתאים פורמטי צלחת שונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: שריטה לכיוון הקצה. גרד את התאים על ידי החלקת wounder מהצד אחד קרקעית הבאר לצד השני של קרקעית הבאר.

איור 5: סקירה של צלחת 96-היטב לאחר ופצע. Monolayer התא נפצע ידי wounder הפקת קצוות חדים עם רוחב אחיד של כ -600 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. < / P>

איור 6: נציג תמונות של שורה ועמודה של בארות מייד לאחר הגרידה. ניתוח כמותי של הרוחב של כל פצע. תמונות נלכדות תחת מטרת 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7: תמונות שנתפסו הפצע (אובייקטיבי 10X) בזמן t = 0 שעות ו t = Δh. הקו המקווקו מציין את אזור הפצע והקו הקבוע מציין באזור נדידת תאים. א) וריד אדם טבור תאי האנדותל. B) פיברובלסטים עורי אדם.לקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

יש wounder התא שלנו כמה תכונות ייחודיות בפתרון הבעיות של מבחני נדידת תאים מסורתיים. Wounder התא מכני 8 ערוצים עשוי נירוסטה ציון גבוה (פלדה 304) עם אורך חיים ארוך כי ניתן לעקר על ידי מעוקר. כמעט כל המותגים המסחריים של תרבות צלחות 96-היטב הקיימים בשוק ניתן להשתמש עם wounder התא מכני זה בגלל הבר המנחה מתכווננת. העיצוב של הבר מנחה מתכווננת גם מבטיח כי האזור המגרד נמצא במרכז של כל טוב. הפצע בעמדה מרכזית של הבאר יכול להקל לכידת תמונה באמצעות מיקרוסקופ. התמונות להחזיק כמה וריאציות בעוד נלקחים בנקודות זמן שונות, אך הן אינן משפיעות נתוני ניתוח כי כמעט 90% המשטח הטוב ניתן לראות על ידי מיקרוסקופ עם מטרה נמוכה גדלה (כלומר 10X). לפיכך, ניתוח תפוקה למחצה גבוהה יכול להתבצע על תרבות צלחות 96-היטב ^7, <sup class = "Xref"> 8. עם זאת, שיטה זו עדיין דורשת מספר רב של תמונות, אשר דורשות ניתוח נתונים ממושך. זה עשוי להיפתר אם מערכת רכישת תמונה אוטומטית זמינה.

העיצוב של סיכות מתכווננת אישית לבן wounder ואף מאפשר במגע עם פני השטח צלחת 96-היטב כדי להשיג פצעים זהים, חלקה וחדה על monolayer התא. הפינים מגרד טיפים מסחרי פלסטיק פיפטה, אשר ניתן לעקר ולהיפטר אחרי כל גירוד יחיד, והוא יכול לספק גמישות רבה כדי ליצור קשר עם השטח גם בלי נזק מכני. יתרונות אלה יכולים לצמצם עוד יותר זיהום צולב של דגימות במהלך הניסוי ואת ההשפעה על תנועת התא על פני שטח הערומים. בעתיד, נוכל לפתח סיכת מבוקר אביב אשר יכול למנוע את צעד כוונון גובה סיכה. השלב הקריטי ביותר להשתמש בהתקן זה הוא הכוח המופעל על monolayer התא במהלך הגירוד. Wounder חייבשיתקיים בניצב נגד צלחת התרבות, כך שמונה טיפים פיפטה נוגעים בתחתית הבאר. אכן, wounder מספק שיטה לבצע את assay נדידת תאים ללא שימוש בציוד יקר ומסובך. הפרוטוקול עבור wounder זה הוא פשוט וברור.

לסיכום, wounder המכאני 8 הערוצים שלנו הוא מכשיר ידידותי למשתמש עבור מבחני נדידת תאים שאינם דורש כישורים מיוחדים. משתמשים יכולים לבצע את assay נדידת תאים ב 96-גם הצלחות עם מספר רב יחסית של דגימות באופן מהיר ופשוט ^{9, 10, 11.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	Nunc	167008	Other brands of 96-well cell culture plate can also be used
P10 pipette tips	Axygen	301-03-051	Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound
Wounder	R&P Technology Limited
Medium 199	Sigma	M2520-1L	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Fetal bovine serum	Gibco	26140079	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3393	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Gelatin from bovine skin	Sigma	G9391	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.