Summary
在这里，我们提出了一个协议，以在96孔细胞培养板进行半高通量细胞迁移测定。该协议是建立在一个细胞单层一致划伤伤口快速，简便，经济的方法。
Abstract
细胞迁移/伤人测定法是一种常用的方法来研究细胞迁移和其它生物过程，如血管生成和肿瘤转移。在该试验中，细胞生长，以形成汇合单层，并通过与一个设备刮擦创建的机械伤口。然后朝裸露区域的细胞的迁移速率可以通过成像来监测。我们的8通道机械wounder旨在解决大部分与细胞迁移测定相关的问题。首先，我们的wounder可以容易地通过高压灭菌或与常用消毒剂消毒。其次，个人可调节销允许甚至与细胞培养板，使得可以创建锐利和可再现的伤口接触。第三，关于wounder两侧的导杆确保在每一致伤人位置很好。为伤人还可以提供更好的处理wounder的以及以最小化交叉铅污染的使用一次性塑料吸头离子。总之，我们的细胞wounder可以使用标准的96孔培养板进行细胞迁移测定法提供与用户友好和可重现装置的研究人员。
Introduction
细胞迁移在细胞过程，如胚胎发生，神经发生，血管生成，伤口愈合，粘膜修复，在正常发育和疾病状况1上皮-间质跃迁中起重要作用。它是一个复杂的过程，涉及大量的间和细胞内的事件，包括信号分子相互作用，细胞极化，细胞骨架重组，基质重塑，膜突起和动态细胞-细胞粘连调制2的协调。通过研究细胞迁移，化学物质或生物分子导致细胞的运动和它的相关的生物化学途径的发现和验证可以被确定。这一基本过程可以有利地用作用于各种应用，如疾病的治疗和药物靶向的代理。
的伤人测定是细胞迁移测定法3中的一个。这里，一个细胞的个体的样品将通过机械装置被部分地去除，以产生一个裸露区，让细胞将迁移以覆盖面积。回收的在特定时间点的百分比将被监测。当处理大量的样品，如样品中实验成本和交叉污染的问题可能会出现问题。虽然许多商业工具和测定法可用于研究细胞迁移4，5，6，其中许多是需要昂贵和复杂的设备和仍需要改进。由于这些原因，一个8通道机械细胞wounder（ 图1）显影。
我们的8通道机械细胞wounder在解决上述问题已经将几个独特的功能。它提供了执行细胞迁移/在96孔培养板格式伤人测定的灵活性。可调区iding杆设计保证了刮开区是在每个中心位置很好。另外，导向杆的高度可以调整，使得wounder适用于各种品牌培养板。最后，可调伤人针设计能够与培养板表面实现同步和可重复伤人7,8的连枪头接触。
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Protocol
1.简介Wounder的部件（图1）
- 通过在相等的距离固定伤人引脚准备针座。握住枪头，并上下移动调节伤人引脚调节尖端的高度。
- 适合于不同品牌的96孔培养板中的可调节的引导杆，并确保该受伤区域是在一个固定的位置上。
- 通过拧紧六角螺丝固定可调伤人引脚。通过拧紧两端的六角帽固定在适当位置的指导吧。
2.设置销座的宽度（图2）
- 松开六角帽用M5的内六角扳手。
- 插入调节环到销保持器的两侧的一适当数，使得导向杆与96孔培养板的宽度伏贴。
注：康宁和磐城板块需要1对大环和1对小环。猎鹰和Nunc公司PL阿泰需要1对大环。 - 拧紧六角帽固定的指导吧。
3.调节导杆（图3）
- 适合用无菌的10微升塑料吸管提示伤人引脚。
- 松开六角帽用M5的内六角扳手。
- 握住wounder和浸伤人针到96孔培养板的一列。
- 调节导向杆的高度，直到所有的尖端刚好触及孔的底部。
- 拧紧六角帽。确保wounder现在完全适合于培养板中，该销良好定位在孔的中间。
4.引脚的校准
- 按住wounder垂直于平坦的表面消毒（ 如培养皿），松开所有的M3六角扳手六角螺丝。
- 点击wounder，直到所有的提示均匀地接触到平坦表面消毒。</ LI>
- 再次拧紧六角螺钉位置锁定引脚。
- 通过轻轻拍打wounder平无菌表面上检查每个尖端的均匀性。
5.划痕细胞单层（图4）
- 种子人脐静脉内皮细胞上的0.1％明胶包被的96孔细胞培养板。在199培养基培养细胞补充有20％热灭活的胎牛血清，1％青霉素/链霉素和0.09克/升的肝素。在使用前过夜保持在37ºC用5％二氧化碳的潮湿培养箱中的细胞。细胞伤人前应达到100％汇合。
- 放置伤人提示在最左边的（或最右边的）培养板的同一列内的每个孔一侧。对面井的另一侧滑动wounder;确保伤人尖端接触井的底部。
- 重复所有列的划伤（步骤5.2）。
- 伤人后，丢弃Ť他中等每口井和更换新鲜含中测试化合物。
6.数据采集和图像分析
- 整个井与使用具有数码相机（ 例如 ，10X物镜）的低功率显微镜细胞单层的机械伤口后图像立即伤人（t = 0的小时）。
- 添加试验化合物，如果需要的孵育时间的期望的长度。图像的整个井与所需孵育时间（t =ΔH）后伤口再次区域。
- 使用图像分析软件，如ImageJ的（ https://imagej.nih.gov/ij/ ），测量使用手绘工具在图像上的伤员区域。
- 计算伤口闭合的百分比：
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Representative Results
该8通道机械wounder被构造以执行小区迁移测定划伤的细胞单层。这是一个用户友好的设备，可以在不到一分钟进行96孔板细胞划伤实验无需特殊培训。此wounder可以在细胞单层引入伤口面积为约600微米的均匀的宽度，并与锋利的边缘（ 图5和6）。伤口的宽度取决于品牌枪头的和用户的性能。伤口宽度的范围适用于普通图像的低功率放大下捕获（ 图7）。拍摄图像后，伤口闭合的百分比可以计算出来。此细胞wounder解决与细胞迁移测定法中遇到的问题已经将不同的策略。此外，它提供了灵活性以各种96孔培养复进行细胞迁移测定法吃格式。
图1：八通道的机械细胞wounder。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：调整销保持器的宽度。插入调节环，以适合96孔板。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.调整导杆，以适应不同的平板格式。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：划伤尖端方向。通过滑动从井底部的一侧wounder到孔底的另一侧划伤细胞。
图5：带伤后的96孔板的概述。细胞单层被wounder生产具有约600微米的均匀的宽度锐边受伤。 请点击此处查看该图的放大版本。 < / P>
图6：一个行的代表性图像和井刮擦后，立即一列。每个伤口的宽度的定量分析。图像被下10X目标捕获。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：捕获伤口图像（10X物镜）在t = 0 H和T =的Δh。虚线表示伤口区域和实线表示的细胞迁移区域。 A）人脐静脉内皮细胞。 b）人类真皮成纤维细胞。得到=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们的细胞wounder在解决传统的细胞迁移实验的问题，几个独特的功能。 8通道机械细胞wounder与可以通过热压灭菌寿命长采用优质不锈钢（304）的。几乎所有的商业品牌的市场上可用的96孔培养板可与该机械细胞wounder使用，因为可调节导向杆的。可调导向杆的设计也保证了划痕区域是在每个的中心孔。在井的中心位置上的伤口可以使用显微镜促进图像捕获。图像具有一些变型中，而在不同的时间点拍摄，但它们不影响数据的分析，因为在井区的近90％，可通过显微镜用低倍率物镜（ 即 10X）进行查看。因此，可以在96孔培养板7，<进行半高通量分析SUP类=“外部参照”> 8。然而，这种方法仍需要大量的图像，这需要长时间的数据分析。如果自动图像采集系统是可用的，这可能得到解决。
该wounder的各个可调整销的设计允许即使在96孔板表面接触，以实现对细胞单层相同的，光滑和锐利的伤口。的划痕针是商业塑料枪头，它可以被灭菌和布置每一个刮擦后，能提供极大的弹性接触孔表面无机械损伤。这些优点可以在实验和整个裸露区域上细胞运动的影响时进一步减少样品的交叉污染。在未来，我们将开发一个弹簧控制引脚，可消除销高度调整步骤。以使用该设备的最关键的步骤是在划痕过程中在细胞单层所施加的力。该wounder必须垂直对培养板举行，因此，8枪头都在触摸井的底部。事实上，wounder提供无需使用昂贵和复杂的设备的执行细胞迁移测定的方法。此wounder该协议是简单明了。
总之，我们的8声道机械wounder为细胞迁移测定，不需要特殊技能一个用户友好的设备。用户可以在一个快速和简单的方式9，10，11具有相对大量的样品进行在96孔板的细胞迁移测定。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
笔者想感谢谭宝梁先生，王梓健先生和香港浸会大学理学院车间的技术人员，对他们的技术技能和建议，使这一wounder的雏形。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
